專利名稱：一種表達(dá)重組人凝血因子Ⅶ的方法及其專用載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域中蛋白的重組表達(dá)方法，特別是涉及一種高效表達(dá)重組人凝血因子VII的方法及其專用載體。
背景技術(shù)：
凝血過程是機(jī)體的重要保護(hù)機(jī)制之一，是一系列凝血因子相繼酶解激活的過程， 最終結(jié)果是凝血酶和纖維蛋白凝塊的形成。這一過程包括內(nèi)源性凝血途徑和外源性凝血途徑，這兩條途徑的主要區(qū)別是啟動(dòng)方式和參加的凝血因子不完全相同，但參與兩條凝血途徑的某些凝血因子能夠相互激活，將兩條途徑聯(lián)系起來。其中，凝血因子VII發(fā)揮了重要作用。凝血因子VII (coagulation factor VII，F(xiàn)VII)是形成凝血塊起始的關(guān)鍵分子之一，在凝血過程中發(fā)揮著極其重要的作用。它主要通過與暴露的組織因子(tissue factor, TF)結(jié)合，形成TF-FVII復(fù)合物而啟動(dòng)外源性凝血途徑，同時(shí)對內(nèi)源性凝血途徑的啟動(dòng)也具有特殊的調(diào)控作用。人FVII主要由肝臟合成，是一種維生素K依賴的單鏈糖蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶家族成員。其基因含9個(gè)外顯子，全長12.81Λ，定位于染色體13q34。人FVII的 cDNA (GenBank號匪019616)由1335bp組成，編碼406個(gè)氨基酸殘基，分子量約為 45. 5kDa,經(jīng)過翻譯后修飾，加上側(cè)鏈的糖基，分子量可達(dá)50kDa。人血漿中FVII主要以酶原形式存在，而活性形式的FVII含量僅占約1%。當(dāng)FVII 的Argl52-Ilel53之間的肽鍵裂解后，由單肽鏈形式轉(zhuǎn)變?yōu)殡p肽鏈形式，即形成有酶活性的FVIIa。其中1-152位的氨基酸殘基組成FVIIa的輕鏈，分子量為20kDa;153-406位的殘基組成FVIIa的重鏈，分子量為30kDa。輕鏈與重鏈由原第135位和262位氨基酸殘基之間的單個(gè)二硫鍵連接。輕鏈?zhǔn)级思s38個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成Y-羧基谷氨酸區(qū)，亦稱“Gla” 區(qū)，其后有兩段氨基酸殘基的排列順序與上皮生長因子相似的區(qū)域，稱為“EGF”區(qū)；重鏈部分氨基酸殘基的排列順序與絲氨酸蛋白酶家族有顯著同源性，是FVIIa具有催化作用的功能區(qū)，稱為絲氨酸蛋白酶區(qū)。FVII在合成過程中所經(jīng)歷的翻譯后修飾包括Asnl45和Asn322的N-糖基化， Ser52和Ser60的0_糖基化以及Gla區(qū)內(nèi)多處谷氨酸殘基(第6、7、14、16、19、20、25、26、 四、35位)的Y-羧基化。在正常生理?xiàng)l件下，人體內(nèi)只有大約1 %的FVII具有酶活性，而血漿中FVII的水平非常的低，應(yīng)用放免法測定大約為200-400ng/mL，而且隨個(gè)體和人種有比較大的波動(dòng)。人 FVII 的半衰期非常短，GE Rivard 等(Rivard GE, Kovac I，Kunschak M, et al. Clinical study of recovery and half-life of vapor-heated factor VII concentrate. Transfusion. 1994,34(11) :975-981.)證明FVII在血漿中的半衰期大約在5小時(shí)到7小時(shí)之間。重組人凝血因子VII是指應(yīng)用基因工程的方法將人FVII的cDNA基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行體外表達(dá)，從而獲得重組凝血因子VII。Thim L 等(Thim L, Bjoern S, Christensen M.Amino acid sequence and posttranslational modifications of human factor Vila from plasma and transfected baby hamster kidney cells. Biochemistry. 1988, 27 :7785-7791.)比較了人FVII重組樣品(rFVIIa)與血漿純化樣品(pd-FVIIa)的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)兩者的氨基酸序列完全相同，均與cDNA推測的結(jié)果一致，并且在N端均有一段長達(dá)60個(gè)氨基酸殘基的信號肽序列。然而，兩者在翻譯后的修飾方面存在較大區(qū)別①Y-羧基化比較兩者Gla區(qū)谷氨酸Y-羧基化發(fā)現(xiàn)，在PdFVHa中，所有10個(gè)可能的Gla殘基全部Y -羧基化，而rFVIIa只有9個(gè)Gla殘基完全Y-羧基化，1個(gè)部分Y-羧基化。但這個(gè)差別與功能似乎并無聯(lián)系。 ②0-糖基化pd-FVII含兩個(gè)0-糖基化位點(diǎn)Ser52和kr60。在rFVIIa中也發(fā)現(xiàn)了這兩個(gè)位點(diǎn)。Ser52有三種不同的葡聚糖結(jié)構(gòu)葡萄糖單體、葡萄糖-木糖和葡萄糖_(木糖)2。 這三種結(jié)構(gòu)在兩種蛋白樣品中的數(shù)量稍有不同。在義計(jì)。位點(diǎn)，兩者都發(fā)現(xiàn)了巖藻糖。位點(diǎn)特異性突變研究發(fā)現(xiàn)，0-糖基化與FVII同TF的結(jié)合有關(guān)。③N-糖基化兩者都發(fā)現(xiàn)在 Asnl45和Ash322完全N-糖基化，區(qū)別是rFVIIa具有比較高的巖藻糖含量和較低的唾液酸含量。盡管存在結(jié)構(gòu)上的不同點(diǎn)，HednerU 等(Hedner U, Ljundberg J, Lund-Hansen T. Comparison of the effect of plasma-derived and recombinant human FVIIa in vitro and in a rabbit model. Blood Coagul Fibrinolysis. 1990,1(2) :145-153.)證明， 兩者的生物學(xué)功能是完全一樣的。重組產(chǎn)品的作用機(jī)制與人體內(nèi)的正常凝血機(jī)制稍有不同。體外實(shí)驗(yàn)證明，rFVIIa 會和FVII競爭TF受體。大劑量注射rFVIIa后，在啟動(dòng)凝血瀑布階段，血漿高水平的rFVIIa 克服了 FVII的干擾，使TF與rFVIIa飽和，從而確保其發(fā)揮最大的生理作用，產(chǎn)生足夠的活化血小板。在放大階段，rFVIIa與血小板低親和，并且不依賴TF產(chǎn)生FXa，因而比pd_FVII 更加有效。低親和性說明了治療中rFVIIa高劑量的必要性。rFVIIa不與休眠的血小板結(jié)合，因而只有當(dāng)發(fā)生損傷，TF暴露并且血小板被活化后才可以發(fā)揮凝血作用。由于血漿中FVII含量比較少，純化比較困難，對其適應(yīng)癥的研究僅限于FVII缺乏癥。后來隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，rhFVII成為了帶抑制物的血友病人的主要替代療法。 最近的臨床研究表明，F(xiàn)VII對血小板減少癥和血小板功能障礙、嚴(yán)重創(chuàng)傷、大面積外科手術(shù)的止血具有令人滿意的治療效果。目前，其主要的臨床適應(yīng)癥包括帶有凝血因子VIII抑制劑的血友病人、凝血酶產(chǎn)生障礙的病人、外科手術(shù)和嚴(yán)重創(chuàng)傷引發(fā)的大出血、先天性和獲得性FVII缺陷等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過表達(dá)元件的優(yōu)化，構(gòu)建新型的重組人凝血因子VII表達(dá)載體，并建立完善的表達(dá)體系，利用加壓篩選的方法使篩選基因獲得擴(kuò)增，該篩選基因加壓擴(kuò)增的同時(shí)又可以帶動(dòng)其側(cè)翼目的基因的拷貝數(shù)增加，從而實(shí)現(xiàn)重組人FVII在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高效表達(dá)。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體，自上游至下游順次包含以下表達(dá)元件
5
1)啟動(dòng)子，選用人延伸因子Ia亞基啟動(dòng)子(EF-Ia)或巨細(xì)胞病毒即刻早期啟動(dòng)子(CMV-IE)，優(yōu)選為EF-I α啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子不受細(xì)胞周期的限制，可以在細(xì)胞高密度培養(yǎng)時(shí)，持續(xù)地使目的基因表達(dá)；2)人凝血因子VII的cDNA基因；3) pIRESneo載體中的人工合成的內(nèi)含子(IVS)，用于增強(qiáng)目的基因轉(zhuǎn)錄后mRNA的穩(wěn)定性，從而提高目的基因的表達(dá)效率；4)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，用于連接并啟動(dòng)篩選基因的表達(dá)，這樣目的基因和篩選基因共用一個(gè)啟動(dòng)子，更有利于通過篩選基因的擴(kuò)增使得人凝血因子VII基因得到擴(kuò)增；5)篩選基因，選用谷氨酰胺合成酶基因(GS)或二氫葉酸還原酶基因(DHFR)，優(yōu)選為GS基因；6)牛生長激素poly A信號序列，作用是為轉(zhuǎn)錄后的mRNA加尾，使轉(zhuǎn)錄后的mRNA 結(jié)構(gòu)完整；7)質(zhì)粒的復(fù)制結(jié)構(gòu)域。在上述載體中，所述載體還可再包括抗生素篩選基因，如氨芐青霉素抗性基因，作用是載體復(fù)制過程中的篩選，位于載體中質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)的下游。用于構(gòu)建高效表達(dá)重組人凝血因子VII專用載體的出發(fā)載體可為任意的可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源基因的真核載體，如pIRESneo、pCIneo、pcDNA3或pcDNA5等，優(yōu)選為 pIRESneoο具體來講，有以下四種載體以pIRESneo為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶EF-I α啟動(dòng)子、人凝血因子VII的cDNA基因、 人工合成的內(nèi)含子、GS基因、牛生長激素poly A信號序列、氨芐青霉素抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制結(jié)構(gòu)域的用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體pEFIR-GS-FVII ；以pIRESneo為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶EF-I α啟動(dòng)子、人凝血因子VII的cDNA基因、 人工合成的內(nèi)含子、DHFR基因、牛生長激素poly A信號序列、氨芐青霉素抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制結(jié)構(gòu)域的用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體pEFIR-DHFR-FVII ；以pIRESneo為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶CMV-IE啟動(dòng)子、人凝血因子VII的cDNA基因、 人工合成的內(nèi)含子、GS基因、牛生長激素poly A信號序列、氨芐青霉素抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制結(jié)構(gòu)域的用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體pCMIR-GS-FVII ；以pIRESneo為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶CMV-IE啟動(dòng)子、人凝血因子VII的cDNA基因、 人工合成的內(nèi)含子、DHFR基因、牛生長激素poly A信號序列、氨芐青霉素抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制結(jié)構(gòu)域的用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體pCMIR-DHFR-FVII。上述用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體可按照基因工程領(lǐng)域中的常規(guī)方法構(gòu)建。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種高效表達(dá)重組人凝血因子VII的方法。本發(fā)明所提供的高效表達(dá)重組人凝血因子VII的方法，是將上述專用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，然后通過MSX或MTX加壓篩選獲得陽性細(xì)胞克隆，進(jìn)而通過增加MSX或 MTX的濃度進(jìn)行持續(xù)壓力篩選，從而使人凝血因子VII基因隨篩選基因擴(kuò)增的同時(shí)獲得拷貝數(shù)的增加，人凝血因子VII基因拷貝數(shù)的增加又可以使表達(dá)量增加，使得重組人凝血因子VII得以高效表達(dá)。在上述高效表達(dá)重組人凝血因子VII的方法中，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞可為CHO細(xì)胞、 BHK細(xì)胞、HEK293細(xì)胞或Vero細(xì)胞等，優(yōu)選為BHK細(xì)胞和CHO細(xì)胞?？赏ㄟ^常用的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法(如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電擊轉(zhuǎn)染法或磷酸鈣轉(zhuǎn)染法等) 將上述專用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞。所述MSX或MTX加壓篩選陽性細(xì)胞克隆的方法為將轉(zhuǎn)染細(xì)胞用含有 300-500 μ g/mL MSX或MTX的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，間隔2_3天換液一次，待對照細(xì)胞全部死亡時(shí)，得到具有MSX或MTX抗性的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。通過增加MSX或MTX的濃度對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)壓力篩選的方法為將轉(zhuǎn)染細(xì)胞繼續(xù)用含有600-800 μ g/mL MSX或MTX的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，間隔2_3天換液一次，從而使人凝血因子VII基因隨篩選基因擴(kuò)增的同時(shí)獲得拷貝數(shù)的增加。本發(fā)明提供了一種高效表達(dá)重組人凝血因子VII的方法及其專用載體。檢測結(jié)果證明，轉(zhuǎn)染有本發(fā)明重組載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞不僅能穩(wěn)定、高效表達(dá)重組人凝血因子VII， 且具有較高的促凝活性，表達(dá)產(chǎn)物激活后能縮短血漿的凝血時(shí)間，通過活性計(jì)算，活性最高者相當(dāng)于524%血漿FVII的活性。根據(jù)促凝活性估算表達(dá)量平均約為正常人血漿含量的 2-5倍。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1)通過內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IREQ使目的基因與篩選標(biāo)記基因處于同一個(gè)開放讀碼框中，易于陽性細(xì)胞的篩選和克??；2)本發(fā)明中所采用的篩選基因(GS/DHFR)具有隨篩選壓力增大使得篩選基因拷貝數(shù)擴(kuò)增的能力；3)篩選基因拷貝數(shù)擴(kuò)增的同時(shí)可以帶動(dòng)其側(cè)翼的目的基因獲得拷貝數(shù)的擴(kuò)增，從而可以提高目的基因在細(xì)胞基因組中的拷貝數(shù)，達(dá)到提高表達(dá)效率的目的；4)常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞如CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HEK293細(xì)胞等均可以用作宿主細(xì)胞，易于培養(yǎng)和篩選。綜上所述，本發(fā)明將在重組人凝血因子VII的高效表達(dá)中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。


圖1為用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體的結(jié)構(gòu)示意2A為CHO抗性細(xì)胞中β-actin基因的拷貝數(shù)的SYBR GREEN Real Time Q-PCR 檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2B為CHO抗性細(xì)胞中人凝血因子VII基因的拷貝數(shù)的STOR GREEN Real Time Q-PCR檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖3為CHO抗性細(xì)胞表達(dá)上清中的重組人凝血因子VII的^festern Blotting鑒定結(jié)果
具體實(shí)施例方式實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、構(gòu)建用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體pCMIR-GS-FVII以pIRESneo (GenBank號U89673)為出發(fā)載體構(gòu)建攜帶CMV-IE啟動(dòng)子、人凝血因子VII的CDNA基因、人工合成的內(nèi)含子、GS基因、牛生長激素poly A信號序列、氨芐青霉素抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制結(jié)構(gòu)域的用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體 pCMIR-GS-FVII (載體的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1)，具體方法包括以下步驟一、用于擴(kuò)增人凝血因子VII基因cDNA序列的引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)已克隆的人凝血因子VII的cDNA序列(呂茂民等，人凝血因子VIIcDNA基因的克隆與鑒定.生物技術(shù)通報(bào).2007“4) :132-134.),設(shè)計(jì)并合成了兩條引物，分別在引物的兩端引入EcoR V和EcoR I酶切位點(diǎn)，引物序列為:f7f 5' -CGG GAT ATC ATG GTC TCC CAG GCC CTC AG-3'和 f7r :5' -GCG AAT TCC TAG GGA AAT GGG GCT CGC-3‘。二、重組表達(dá)表達(dá)載體pCMIR-GS-FVII的獲得以質(zhì)粒pT-FVII (呂茂民等，人凝血因子VII cDNA基因的克隆與鑒定.生物技術(shù)通報(bào).2007，(4) :132-134.)為模板，在引物f7f和f7r的引導(dǎo)下用PCR的方法擴(kuò)增人凝血因子VII的cDNA序列。擴(kuò)增結(jié)束后，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果PCR 擴(kuò)增出了約1335bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符。用凝膠回收試劑盒回收并純化PCR擴(kuò)增的約1335bp的DNA片段，對其用限制性內(nèi)切酶EcoR V和EcoR I雙酶切后，將其定向克隆入同樣經(jīng)EcoR V和EcoR I雙酶切的真核表達(dá)載體pIRESneo (購自CL0NTECH公司)中，得到攜帶CMV-IE啟動(dòng)子、人凝血因子VII cDNA基因的重組載體，命名為pCMIR-FVII。然后，用內(nèi)切酶Sma I和)(ba I從質(zhì)粒pGSRK_l (購自美國ATCC，No. 63067)中酶切得到GS基因；同樣，將載體pCMIR-FVII用內(nèi)切酶Sma I和)(ba I進(jìn)行雙酶切，回收含目的基因的載體大片段；再將GS基因與回收的載體大片段用T4DNA連接酶連接，得到攜帶CMV-IE 啟動(dòng)子、人凝血因子VII的cDNA基因、人工合成的內(nèi)含子(指存在于pIRESneo載體中的那段人工合成的內(nèi)含子)、GS基因、牛生長激素poly A信號序列(存在于pIRESneo載體中)、 氨芐青霉素抗性基因(存在于pIRESneo載體中)和質(zhì)粒復(fù)制結(jié)構(gòu)域(存在于pIRESneo載體中)的用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體pCMIR-GS-FVII。實(shí)施例2、構(gòu)建用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體pCMIR-DHFR-FVII以pIRESneo (GenBank號U89673)為出發(fā)載體構(gòu)建攜帶CMV-IE啟動(dòng)子、人凝血因子VII的cDNA基因、人工合成的內(nèi)含子、DHFR基因、牛生長激素poly A信號序列、氨芐青霉素抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制結(jié)構(gòu)域的用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體 pCMIR-DHFR-FVII (載體的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1)，具體方法包括以下步驟用內(nèi)切酶Sma I和Xba I從質(zhì)粒pSV2_dhfr (購自美國ATCC, No. 37146)中酶切得到DHFR基因；同樣，將載體pCMIR-FVII用內(nèi)切酶Sma I和)(ba I進(jìn)行雙酶切，回收含目的基因的載體大片段；再將DHFR基因與回收的載體大片段用T4DNA連接酶連接，得到攜帶 CMV-IE啟動(dòng)子、人凝血因子VII的cDNA基因、人工合成的內(nèi)含子(存在于pIRESneo載體中)、DHFR基因、牛生長激素poly A信號序列(存在于pIRESneo載體中)、氨芐青霉素抗性基因(存在于PlRESneo載體中)和質(zhì)粒復(fù)制結(jié)構(gòu)域(存在于pIRESneo載體中)的用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體pCMIR-DHFR-FVII。
實(shí)施例3、構(gòu)建用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體pEFIR-GS-FVII以pIRESneo (GenBank號U89673)為出發(fā)載體構(gòu)建攜帶EF-1 α啟動(dòng)子(存在于 pEF/bsd載體中，購自美國hvitrogen公司)、人凝血因子VII的cDNA基因、人工合成的內(nèi)含子、GS基因、牛生長激素poly A信號序列、氨芐青霉素抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制結(jié)構(gòu)域的用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體pEFIR-GS-FVII (載體的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1)，具體方法包括以下步驟以質(zhì)粒pEF/bsd(購自美國Invitrogen公司)為模板，在引物EFF :5’ -TCG CGA CGT GAG GCT CCG GTG CCC GTC-3'禾PEFR:5' -ATC GAT CCG AGC TCG TCA CGA CAC CTG AAA TGG AAG-3’的引導(dǎo)下用PCR的方法擴(kuò)增EF-I α啟動(dòng)子，擴(kuò)增結(jié)束后，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果PCR擴(kuò)增出了約1. 2kb的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符， 用凝膠回收試劑盒回收并純化PCR擴(kuò)增的約1. 2kb的DNA片段，對其用限制性內(nèi)切酶Nru I和Cla I雙酶切后，回收EF-I α啟動(dòng)子DNA片段；同樣，將載體pCMIR-GS_FVII (實(shí)施例 1構(gòu)建)經(jīng)Nru I和Cla I雙酶切，回收含目的基因的載體大片段；再將EF-I α啟動(dòng)子與回收的載體大片段用T4DNA連接酶連接，得到攜帶EF-I α啟動(dòng)子、人凝血因子VII cDNA基因、人工合成的內(nèi)含子(存在于pIRESneo載體中)、GS基因、牛生長激素poly A信號序列 (存在于pIRESneo載體中)、氨芐青霉素抗性基因(存在于pIRESneo載體中)和質(zhì)粒復(fù)制結(jié)構(gòu)域(存在于pIRESneo載體中)的用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體的重組載體，命名為pEFIR-GS-FVII。實(shí)施例4、構(gòu)建用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體pEFIR-DHFR-FVII以pIRESneo (GenBank號U89673)為出發(fā)載體構(gòu)建攜帶EF-I α啟動(dòng)子、人凝血因子VII的cDNA基因、人工合成的內(nèi)含子、DHFR基因、牛生長激素poly A信號序列、氨芐青霉素抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制結(jié)構(gòu)域的用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體 pEFIR-DHFR-FVII (載體的結(jié)構(gòu)示意圖見圖1)，具體方法包括以下步驟以質(zhì)粒pEF/bsd(購自美國^ivitrogen公司)為模板，用與實(shí)施例3中相同的方法擴(kuò)增EF-Ia啟動(dòng)子，擴(kuò)增結(jié)束后，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果PCR 擴(kuò)增出了約1. 2kb的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符，用凝膠回收試劑盒回收并純化PCR擴(kuò)增的約1.21Λ的DNA片段，對其用限制性內(nèi)切酶Nru I和Cla I雙酶切后，回收EF-I α啟動(dòng)子 DNA片段；同樣，將載體pCMIR-DHFR-FVII (實(shí)施例2構(gòu)建)經(jīng)Nru I和Cla I雙酶切，回收含目的基因的載體大片段；再將EF-I α啟動(dòng)子與回收的載體大片段用T4DNA連接酶連接， 得到攜帶EF-I α啟動(dòng)子、人凝血因子VII cDNA基因、人工合成的內(nèi)含子(存在于pIRESneo 載體中)、GS基因、牛生長激素poly A信號序列(存在于pIRESneo載體中)、氨芐青霉素抗性基因(存在于PlRESneo載體中)和質(zhì)粒復(fù)制結(jié)構(gòu)域(存在于pIRESneo載體中)的用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體的重組載體，命名為pEFIR-DHFR-FVII。實(shí)施例5、CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染、篩選及克隆化一、CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染用hvitragen公司的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將實(shí)施例1構(gòu)建的重組表達(dá)載體 pCMIR-GS-FVII (實(shí)施例5中以實(shí)施例1構(gòu)建的pCMIR-GS_FVII為例，實(shí)施例2_4構(gòu)建的載體也用相同的方法進(jìn)行細(xì)胞的轉(zhuǎn)染、篩選及克隆化)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞(購自美國^witrogen 公司，其它哺乳動(dòng)物細(xì)胞如BHK細(xì)胞、HEK293細(xì)胞或Vero細(xì)胞也可)，具體方法包括以下步
9驟1、細(xì)胞的準(zhǔn)備用25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶將CHO細(xì)胞按1 4傳代，37°C、5 % CO2飽和濕度中培養(yǎng)M-3^1，待細(xì)胞長成50% -70%單層時(shí)傾去細(xì)胞培養(yǎng)液，用無血清DMEM培養(yǎng)基 (購自美國^witrogen公司)洗滌細(xì)胞兩次，即為備用細(xì)胞。2、脂質(zhì)體/DNA的準(zhǔn)備a.將20yL Lipofectine溶入200 μ 1無血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫放置 40min ；b.將2 μ 1 (約2 μ g)經(jīng)除菌的重組質(zhì)粒DNA pCMIR-GS-FVII溶入200 μ 1無血清 DMEM培養(yǎng)基中，混勻后，置于室溫備用；c.將制備好的DNA與脂質(zhì)體輕輕混合均勻，室溫放置10-15min ；d.然后加入2. 6mL無血清DMEM培養(yǎng)基，輕輕混合，得到包裹好的脂質(zhì)體/DNA。3、細(xì)胞的轉(zhuǎn)染a.將制備好的脂質(zhì)體/DNA混合物小心滴加至備用細(xì)胞表面，于37°C、5% CO2飽和濕度中孵育12h ；b.棄去混合液，加入含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48_7池，視細(xì)胞生長情況進(jìn)行傳代。二、CHO抗性細(xì)胞的篩選及克隆化1、抗性細(xì)胞的篩選將步驟一獲得的轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行傳代，生長24h后，更換為選擇性培養(yǎng)基(含5%新生牛血清和400 μ g/mL的MSX (300-500 μ g/mL均可)MSX (轉(zhuǎn)染細(xì)胞中攜帶GS基因的用MSX 篩選，攜帶DHFR基因的用MTX篩選)的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，間隔2_3d換液一次，待對照細(xì)胞全部死亡時(shí)，得到具有MSX抗性的CHO細(xì)胞。2、抗性細(xì)胞的克隆化利用有限稀釋法對獲得的MSX抗性的CHO細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，具體方法如下1)待抗性細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)，用適量的0. 25%胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞收縮變圓，用吸管充分吹打細(xì)胞，將細(xì)胞分散為單個(gè)細(xì)胞懸液；2)取少量細(xì)胞懸液，用臺盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)活細(xì)胞；3)細(xì)胞懸液進(jìn)行連續(xù)倍數(shù)稀釋后，將制備好的細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，使細(xì)胞濃度在每孔有1-2個(gè)細(xì)胞的水平，每孔加入0. ImL含10%新生牛血清的普通DMEM培養(yǎng)基，于37°C、5% (X)2飽和濕度培養(yǎng)；4)每日觀察培養(yǎng)板各孔細(xì)胞情況，孵育4-5d，挑選含單個(gè)細(xì)胞的孔，繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)增加MSX)的濃度至600 μ g/mL (600 μ g/mL-800 μ g/mL均可)繼續(xù)加壓，以使目的基因獲得擴(kuò)增；5)待克隆長至孔底面積的1/3-1/2時(shí)，用適量的0. 25%胰蛋自酶消化，轉(zhuǎn)種至M 孔培養(yǎng)板擴(kuò)大培養(yǎng)；6)按照同樣的方法，待細(xì)胞長滿孔底面積的1/3-1/2時(shí)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)種至6孔板，繼而擴(kuò)大培養(yǎng)直至轉(zhuǎn)入25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，即可按常規(guī)方法培養(yǎng)、傳代及凍存細(xì)胞。實(shí)施例6、CH0抗性細(xì)胞中人凝血因子VII基因的拷貝數(shù)的STOR GREEN Real Time Q-PCR驗(yàn)證
提取實(shí)施例5獲得的經(jīng)不同壓力000、600 μ g/mL)篩選后的轉(zhuǎn)染有 pCMIR-GS-FVII的抗性CHO細(xì)胞的總RNA (用購自hvitrogen公司的TRIzol試劑獲得)和基因組DNA (用購自promega公司的細(xì)胞基因組純化試劑盒提取)，貯存于4°C或_20°C備用 (轉(zhuǎn)染有 pCMIR-DHFR-FVII、pEFIR-GS-FVII、pEFIR-DHFR-FVII 的抗性 CHO 細(xì)胞的總 RNA 和基因組DNA也分別按上述方法制備)。然后以此為模板，在待測基因-人凝血因子VII基因 (簡稱 F7)所用引物 F7-QF(序列為5，-GGT CCT GTT GTT GGT GAA TG-3，)禾口 F7-QR(序列為5，-CGA TGT CGT GGT TGG TGG-3，)的引導(dǎo)下用 SYBR GREEN Real Time Q-PCR 的方法對CHO抗性細(xì)胞中人凝血因子VII的基因的拷貝數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，檢測內(nèi)參基因β-actin所用引物為 Q-ACTB1(序列為 5，-GCC AAC CGT GAA AAG ATG-3，)和 Q-ACTB2 (序列為 5，_AGA AGG AAG GCT GGA AAA-3，)。將合成的引物稀釋到50pmol/y L0 10 μ L反應(yīng)體系如下
標(biāo)準(zhǔn)品cDNA基因組DNA
DNA模板1. 512上游引物0. 250. 250. 25下游引物0. 250. 250. 25MIX (購自Toyobo) 555水33. 52. 5本反應(yīng)所用STOR GREEN Real Time Q-PCR為兩步法(裂解一延伸)，程序條件為 95°C 5min,95°C 10s，60°C :35s，；35 個(gè)循環(huán)。用 Rotor-Gene 公司定量 PCR 儀(型號 6000)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品檢測的熒光值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示，結(jié)果內(nèi)參i3-aCtin(y =-3. 641x+42. 85)和 F7 (y = -3. 734x+42. 30)標(biāo)準(zhǔn)曲線的 R 值分別為 0. 99786,0. 99883， 標(biāo)準(zhǔn)品熒光曲線間隔均一，說明檢測體系可靠。經(jīng)過STOR GREEN Real Time Q-PCR定量分析，所篩選的轉(zhuǎn)染有實(shí)施例1_4所構(gòu)建的載體的不同抗性CHO細(xì)胞株中，目的基因的整合與轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)出一定的倍比關(guān)系，分別將目的基因(人凝血因子VII基因)與內(nèi)參基因β-actin進(jìn)行對比，以400yg/ mL的MSX篩選的不同載體轉(zhuǎn)染的陽性細(xì)胞基因組結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)(設(shè)定值為1)對照， 600 μ g/mL的MSX篩選的不同載體轉(zhuǎn)染的陽性細(xì)胞基因組與之相比較得到如下結(jié)果載體 pCMIR-GS-FVII轉(zhuǎn)染的抗性細(xì)胞基因組水平得比值為1. 6791，cDNA水平比值為1. 7359 ； 載體pCMIR-DHFR-FVII轉(zhuǎn)染的抗性細(xì)胞基因組水平得比值為1.6352，cDNA水平比值為 1. 7048 ；載體pEFIR-GS-FVII轉(zhuǎn)染的抗性細(xì)胞基因組水平得比值為1. 5983，cDNA水平比值為1. 6974 ；載體pEFIR-DHFR-FVII轉(zhuǎn)染的抗性細(xì)胞基因組水平得比值為1. 6880，cDNA水平比值為1. 7569。以上比值說明轉(zhuǎn)染有實(shí)施例1-4所構(gòu)建的載體的不同抗性CHO細(xì)胞經(jīng)過持續(xù)加壓篩選后目的基因在基因組水平和cDNA水平均有拷貝數(shù)增加的趨勢。實(shí)施例7、重組人凝血因子VII的表達(dá)與鑒定一、表達(dá)樣品收集將實(shí)施例5獲得的分別轉(zhuǎn)染有pCMIR-GS-FVII的抗性CHO細(xì)胞克隆(1A5、1B3UB8)、轉(zhuǎn)染有 pCMIR-DHFR-FVII 的抗性 CHO 細(xì)胞克隆(2C2、2C4、2D5)、轉(zhuǎn)染有 pEFIR-GS-FVII 的抗性 CHO 細(xì)胞克隆(3E3、3E4、3F2)、轉(zhuǎn)染有 pEFIR-DHFR-FVII 的抗性 CHO 細(xì)胞克隆(4G5、4G6、4H2)進(jìn)行表達(dá)樣品收集，在M孔細(xì)胞培養(yǎng)板中待細(xì)胞長至80% -90% 匯片，更換為含10 μ g/mL維生素Kl的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基(購自Invitrogen公司)， 于37°C、5% CO2飽和濕度中誘導(dǎo)培養(yǎng)24h后收液，_20°C儲存?zhèn)溆?。二、表達(dá)上清的促凝活性測定用購自四川協(xié)和生物技術(shù)有限責(zé)任公司的凝血因子VII促凝活性檢測試劑盒對抗性CHO細(xì)胞的表達(dá)上清進(jìn)行促凝活性測定，原理以FVII缺陷血漿為基質(zhì)，在組織凝血活酶和Ca2+參與下，受檢血漿(樣品)出現(xiàn)凝固所需的時(shí)間與其含量(FVII:C)水平有關(guān)，測定不同稀釋度的參比血漿(參比血漿為標(biāo)準(zhǔn)正常人血漿，由試劑盒提供)的凝固時(shí)間，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)測定樣品的凝固時(shí)間，將數(shù)據(jù)代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，即可算出樣品中FVII 相當(dāng)于正常水平的百分率。具體檢測方法如下1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將正常參比血漿用稀釋液作1/5、1/10、1Λ0、1/40、1/80倍比稀釋，其對應(yīng)FVII C 百分比活性為 200%、100%、50%、25%、12. 5%。2)將CaCl2和復(fù)溶后的PT試劑(試劑盒提供)置于37°C保溫。3)取某一稀釋度的正常參比血漿0. lmL、凝血因子VII缺陷血漿0. ImL, PT試劑 0. ImL加入透明小試管中，混勻后置于37°C保溫^iin。4)迅速加入保溫的0. 025mol/L CaCl2溶液0. ImL,同時(shí)啟動(dòng)秒表，在水浴中以1-2 次/秒的頻率搖動(dòng)小試管，當(dāng)觀察到出現(xiàn)凝固時(shí)立刻停表記錄凝固時(shí)間。5)以不同稀釋度正常參比血漿FVII:C百分活性為X，對應(yīng)的凝固時(shí)間(秒)為Y， 按照統(tǒng)計(jì)學(xué)方法作直線回歸方程(方程式為logY = blogX+a)，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線。參比血漿的凝固時(shí)間及標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程按凝血因子VII促凝活性檢測試劑盒的要求，測定參比血漿不同稀釋倍數(shù)的促凝時(shí)間，結(jié)果如表1所示。表1不同稀釋度的參比血漿的凝固時(shí)間
權(quán)利要求
1.一種用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體，包含自上游至下游順次排列的以下表達(dá)元件1)啟動(dòng)子，選用人延伸因子Ia亞基啟動(dòng)子(EF-Ia)或巨細(xì)胞病毒即刻早期啟動(dòng)子 (CMV-IE)，優(yōu)選為EF-I α啟動(dòng)子；2)人凝血因子VII的cDNA基因；3)pIRESne0載體中的人工合成的內(nèi)含子序列(IVS)；4)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)；5)篩選基因，選用谷氨酰胺合成酶基因(GQ或二氫葉酸還原酶基因(DHFI )，優(yōu)選為GS基因；6)牛生長激素polyA信號序列；7)質(zhì)粒的復(fù)制結(jié)構(gòu)域。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的專用載體，其特征在于所述載體還可再包括抗生素篩選基因，如氨芐青霉素抗性基因，位于載體中的質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)的下游。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的專用載體，其特征在于用于構(gòu)建所述高效表達(dá)重組人凝血因子VII專用載體的出發(fā)載體為任意的可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)外源基因的真核載體， 如 pIRESneo、pCIneo、pcDNA3 或 pcDNA5 等，優(yōu)選為 pIRESneo。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的專用載體，其特征在于，為以下專用載體之一以pIRESneo為出發(fā)載體構(gòu)建的用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體為 pEFIR-GS-FVII，其攜帶EF-lα啟動(dòng)子、人凝血因子VII的cDNA基因、合成的內(nèi)含子、GS基因、牛生長激素poly A信號序列、氨芐青霉素抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制結(jié)構(gòu)域；以pIRESneo為出發(fā)載體構(gòu)建的用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體為 pEFIR-DHFR-FVII，其攜帶EF-la啟動(dòng)子、人凝血因子VII的cDNA基因、合成的內(nèi)含子、 DHFR基因、牛生長激素poly A信號序列、氨芐青霉素抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制結(jié)構(gòu)域；以pIRESneo為出發(fā)載體構(gòu)建的用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體為 pCMIR-GS-FVII，其攜帶CMV-IE啟動(dòng)子、人凝血因子VII的cDNA基因、合成的內(nèi)含子、GS基因、牛生長激素poly A信號序列、氨芐青霉素抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制結(jié)構(gòu)域；以pIRESneo為出發(fā)載體構(gòu)建的用于高效表達(dá)重組人凝血因子VII的專用載體為 pCMIR-DHFR-FVII，其攜帶CMV-IE啟動(dòng)子、人凝血因子VII的cDNA基因、合成的內(nèi)含子、 DHFR基因、牛生長激素poly A信號序列、氨芐青霉素抗性基因和質(zhì)粒復(fù)制結(jié)構(gòu)域。
5.一種高效表達(dá)重組人凝血因子VII的方法，是將權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的專用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，然后通過MSX或MTX加壓篩選獲得陽性細(xì)胞克隆，進(jìn)而通過增加 MSX或MTX的濃度進(jìn)行持續(xù)壓力篩選，從而使人凝血因子VII基因隨篩選基因擴(kuò)增的同時(shí)獲得拷貝數(shù)的增加，目的基因拷貝數(shù)的增加又可以使表達(dá)量增加，使得重組人凝血因子VII 得以高效表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的表達(dá)方法，其特征在于所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為CHO細(xì)胞、BHK 細(xì)胞、HEK293細(xì)胞或Vero細(xì)胞，優(yōu)選為BHK細(xì)胞和CHO細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的表達(dá)方法，其特征在于所述MSX或MTX加壓篩選陽性細(xì)胞克隆的方法為將轉(zhuǎn)染細(xì)胞用含有300-500 μ g/mL MSX或MTX的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，間隔2-3天換液一次，待對照細(xì)胞全部死亡時(shí)，得到具有MSX或MTX抗性的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7任一所述的表達(dá)方法，其特征在于通過增加MSX或MTX的濃度對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)壓力篩選的方法為將轉(zhuǎn)染細(xì)胞繼續(xù)用含有600-800 μ g/mLMSX或MTX 的選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，間隔2-3天換液一次，從而使人凝血因子VII基因隨篩選基因擴(kuò)增的同時(shí)獲得拷貝數(shù)的增加。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效表達(dá)重組人凝血因子VII的方法及其專用載體。該載體自上游至下游順次包含人延伸因子1α亞基啟動(dòng)子EF-1α或巨細(xì)胞病毒即刻早期啟動(dòng)子CMV-IE，人凝血因子VII的cDNA基因，人工合成的內(nèi)含子，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)IRES，谷氨酰胺合成酶基因GS或二氫葉酸還原酶基因DHFR，牛生長激素poly A信號序列和質(zhì)粒的復(fù)制結(jié)構(gòu)域。對表達(dá)樣品的檢測結(jié)果證明，轉(zhuǎn)染有本發(fā)明4種重組載體的CHO細(xì)胞能穩(wěn)定、高效表達(dá)重組人凝血因子VII，平均表達(dá)量約為5-13mg/L，而且表達(dá)樣品具有較高的促凝活性，表達(dá)產(chǎn)物能縮短血漿的凝血時(shí)間，通過活性計(jì)算，活性最高者相當(dāng)于524％血漿FVII的活性。本發(fā)明將在重組人凝血因子VII的高效表達(dá)中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12N15/85GK102321668SQ201110187960
公開日2012年1月18日 申請日期2011年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月6日
發(fā)明者馮晶晶, 呂茂民, 唐倩, 尹惠瓊, 楊姝, 王卓, 章金剛, 趙雄, 馬玉媛 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所