專利名稱：豬精子二層percoll密度梯度離心分離法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從豬精液中分離高活力精子的方法，具體涉及豬精子二層 percoll密度梯度離心分離法。
背景技術(shù)：
受精(fertilization)是卵子和精子融合為合子的過程，是有性生殖的基本特征。隨著胚胎工程和輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，體外受精技術(shù)得到越來越多的應(yīng)用。完成體外受精首先需要體外獲取高活力精子，精子分離法主要是將活動的精子與不活動的精子分開，目前應(yīng)用的有精子上游法、白蛋白柱分離法、玻璃纖維濾過技術(shù)、Percoll密度梯度分離法等。由于豬冷凍精液技術(shù)不成熟，目前主要從新鮮的豬精子稀釋液中獲取精子[1]。豬的精子分離法主要采取精子上游法。目前存在的問題有上游的精子易抱團影響精子受精能力[2]；獲取的精子活力低下[3]；精漿中存在抗精子抗體影響精子活力和精子獲能M ；獲取精子的同時白細胞、細菌、碎片和一些精子保護液殘留高影響精子活力；雙頭、雙尾等劣質(zhì)精子難以去除等。(參考文獻[l]Fahy G Μ. . Effect of rapid warming of boar semen on sperm morphology and physiology [J] Cryobiology, 1986, 23 :1 13。[2]江峰，王益鑫，盛新福，等.精液體外處理方法的選擇.中國男科學(xué)雜志，2000，14 ) :134。[3]趙邦榮.通過L_4膜過濾后精液質(zhì)量和精子受精能力的改善與上游法結(jié)果的比較.國外醫(yī)學(xué) (計劃生育分冊)，1993，12(1)。[4]張海峰，李建忠，張春影.精漿抗精子抗體陽性不育患者頂體酶、一氧化氮合酶及超氧化物歧化酶活力變化的研究.中華男科學(xué)雜志，2006，12 ) ；349-；351。)

發(fā)明內(nèi)容
為了解決已有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供豬精液二層percoll密度梯度離心法。其原理是市售的Percoll (Percoll是硅石膠態(tài)懸浮液的商品名)是經(jīng)過聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrolidone, PVP)處理的硅膠顆粒懸濁液，對活細胞無毒性無刺激，根據(jù)不同濃度的percoll具有不同的密度，在離心狀態(tài)下，可將精液中的精液成分按密度不同進行分離。運用45%和90%兩種不同濃度percoll分離精子稀釋液，經(jīng)離心后分出兩層界面中均有精子，第二層界面中精子的活力高且雜質(zhì)少。本發(fā)明提供的豬精液二層percoll密度梯度離心法，步驟和條件如下I,Percoll的配制市售Percoll為體積濃度100%，需要與1. 5M精子洗滌液混合后達到生理性滲透壓，然后用精子洗滌液稀釋到所需濃度。(1)比重為1. 113g/mL、體積濃度為90%的percoll溶液的配制取市售45mL Percoll，加入5mL精子洗滌液，混勻后，棄掉3. 75mL,補入3. 75mL的水，混勻后用0. 22微米濾膜過濾備用；(2)比重為1. 066g/mL、體積濃度為45%的percolll溶液的配制用等體積的體積濃度為90% percoll與精子洗滌液混勻，0. 22微米濾膜過濾備用；
II、制備二層percoll密度梯度稀釋液取一只15mL的尖底離心管，先向其中加入 2mL比重為1. 066g/mL、體積濃度為45%的percoll溶液，再用加樣槍插入試管底部緩慢注入2mL比重為1. 113g/mL、體積濃度為90%的percoll溶液，兩層之間形成一明顯界面，注意避免劇烈震動破壞該界面；III、如圖1所示，將3mL精子稀釋液沿管壁緩慢加入到步驟II制備二層percoll 密度梯度液上，比重為1. 066g/mL、體積濃度為45%的percoll與比重為1. 113g/mL、體積濃度為90%的percoll和精子稀釋液的體積配比為1 1 ； 1. 5，其中，精子稀釋液層在上面， 比重為1. 066g/mL、體積濃度為45%的percoll液層在中間，比重為1. 113g/mL、體積濃度為 90%的percoll液層在下面；IV、如圖2所示，400gX10min離心，離心后可看到試管內(nèi)出現(xiàn)兩個明顯白色分界面層，其中，第一界面層在上面，第二界面層在下面；用加樣槍將第二界面層的液體吸出，移到另一支含有5mL精子洗滌液的試管中混勻，300gX IOmin離心；V、棄去上清，再向其中加入5mL的精子洗滌液，混勻后300gX IOmin離心，棄上清， 用培養(yǎng)液重懸精子，調(diào)節(jié)精子至所需濃度。有益效果本發(fā)明提供的豬精液二層percoll密度梯度離心法，適用于正常的精液標(biāo)本及精子密度低或精子活力低的精液標(biāo)本，是一種簡單、便捷的精子處理方法。該方法能除去精液中的白細胞、細菌、碎片及抗精子抗體；改善精液液化不良和精子體外獲能等， 使之能有效地與卵子受精，以提高妊娠率，獲得的精子中有運動能力且形態(tài)正常的百分率為95%左右。本發(fā)明的方法適用于豬鮮精及稀釋后精液中活力精子的篩選，為豬精子獲能機制及體外受精的研究提供高質(zhì)量的精子。


圖1為制備的二層percoll密度梯度稀釋液。圖2為加入精子后的二層percoll密度梯度稀釋液。圖3為洗滌后的精子。
具體實施例方式實施例1本發(fā)明提供的豬精液二層percoll密度梯度離心法，步驟和條件如下I,Percoll的配制市售Percoll為體積濃度100%，需要與1. 5M精子洗滌液混合后達到生理性滲透壓，然后用精子洗滌液稀釋到所需濃度。(1)比重為1. 113g/mL、體積濃度為90%的percoll溶液的配制取市售45mL Percoll，加入5mL精子洗滌液，混勻后，棄掉3. 75mL,補入3. 75mL的水，混勻后用0. 22微米濾膜過濾備用；(2)比重為1. 066g/mL、體積濃度為45%的percolll溶液的配制用等體積的體積濃度為90% percoll與精子洗滌液混勻，0. 22微米濾膜過濾備用；II、制備二層percoll密度梯度稀釋液取一只15mL的尖底離心管，先向其中加入 2mL比重為1. 066g/mL、體積濃度為45%的percoll溶液，再用加樣槍插入試管底部緩慢注入2mL比重為1. 113g/mL、體積濃度為90%的percoll溶液，兩層之間形成一明顯界面，注意避免劇烈震動破壞該界面；III、如圖1所示，將3mL精子稀釋液沿管壁緩慢加入到步驟II制備二層percoll 密度梯度液上，比重為1. 066g/mL、體積濃度為45%的percoll與比重為1. 113g/mL、體積濃度為90%的percoll和精子稀釋液的體積配比為1 1 ； 1. 5，其中，精子稀釋液層在上面， 比重為1. 066g/mL、體積濃度為45%的percoll液層在中間，比重為1. 113g/mL、體積濃度為 90%的percoll液層在下面；IV、如圖2所示，400gX10min離心，離心后可看到試管內(nèi)出現(xiàn)兩個明顯白色分界面層，其中，第一界面層在上面，第二界面層在下面；用加樣槍將第二界面層的液體吸出，移到另一支含有5mL精子洗滌液的試管中混勻，300gX IOmin離心；V、棄去上清，再向其中加入5mL的精子洗滌液，混勻后300gX IOmin離心，棄上清，
用培養(yǎng)液重懸精子，調(diào)節(jié)精子至所需濃度。
權(quán)利要求
1.豬精液二層percoll密度梯度離心法，步驟和條件如下I、(1)比重為1.113g/mL、體積濃度為90%的percoll溶液的配制取市售45mL PercollJnA 5mL精子洗滌液，混勻后，棄掉3. 75mL,補入3. 75mL的水，混勻后用0. 22微米濾膜過濾備用；(2)比重為1. 066g/mL、體積濃度為45%的percolll溶液的配制用等體積的體積濃度為90% percoll與精子洗滌液混勻，0. 22微米濾膜過濾備用；II、制備二層percoll密度梯度稀釋液取一只15mL的尖底離心管，先向其中加入2mL 比重為1. 066g/mL、體積濃度為45%的percoll溶液，再用加樣槍插入試管底部緩慢注入 2mL比重為1. 113g/mL、體積濃度為90%的percoll溶液，兩層之間形成一明顯界面，注意避免劇烈震動破壞該界面；III、將3mL精子稀釋液沿管壁緩慢加入到步驟II制備二層percoll密度梯度液上， 比重為1.066g/mL、體積濃度為45%的percoll與比重為1. 113g/mL、體積濃度為90% 的percoll和精子稀釋液的體積配比為1 1 1. 5，其中，精子稀釋液層在上面，比重為 1. 066g/mL、體積濃度為45%的percoll液層在中間，比重為1. 113g/mL、體積濃度為90%的 percoll液層在下面；IV、400gXIOmin離心，離心后可看到試管內(nèi)出現(xiàn)兩個明顯白色分界面層，其中，第一界面層在上面，第二界面層在下面；用加樣槍將第二界面層的液體吸出，移到另一支含有5mL 精子洗滌液的試管中混勻，300gX IOmin離心；V、棄去上清，再向其中加入5mL的精子洗滌液，混勻后300gXIOmin離心，棄上清，用培養(yǎng)液重懸精子，調(diào)節(jié)精子至所需濃度。
全文摘要
本發(fā)明提供的豬精液二層percoll密度梯度離心法，適用于正常的精液標(biāo)本及精子密度低或精子活力低的精液標(biāo)本，是一種簡單、便捷的精子處理方法。該方法能除去精液中的白細胞、細菌、碎片及抗精子抗體；改善精液液化不良和精子體外獲能等，使之能有效地與卵子受精，以提高妊娠率，獲得的精子中有運動能力且形態(tài)正常的百分率為95％左右。本發(fā)明的方法適用于豬鮮精及稀釋后精液中活力精子的篩選，為豬精子獲能機制及體外受精的研究提供高質(zhì)量的精子。
文檔編號C12N5/076GK102250836SQ20111018450
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月4日
發(fā)明者關(guān)繼羽, 劉麗梅, 唐博, 孔德龍, 宋光啟, 張鵬, 李子義, 殷玉鵬, 王中偉, 花明, 馬馨, 高飛 申請人:吉林大學(xué)