專利名稱：具有潛在抗豬瘟病毒作用的irg6基因克隆及其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程領(lǐng)域，具體涉及抗豬瘟病毒的基因克隆及其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建。
背景技術(shù)：
豬痕病毒(CSFV)是一種小囊膜、單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科、痕病毒屬。CSFV的基因組大約12. 5kb，只有I個(gè)大的開放性閱讀框架(ORF)，所有結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白均由該ORF所編碼，編碼多種蛋白在細(xì)胞和病毒的蛋白酶的加工和修飾下形成12種成熟的病毒蛋白，大約4000個(gè)氨基酸殘基，分子量約438ku (Moormann R. J. M et al.，1990)。豬瘟病毒(CSFV)是引起豬的高度傳染性致死性病毒性疫病一豬瘟的病原。豬瘟病毒的 感染可導(dǎo)致豬嚴(yán)重的白血球減少癥、免疫抑制、廣泛的血栓癥和內(nèi)皮損傷。豬瘟病毒引起的豬瘟疾病給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的挑戰(zhàn)和威脅。盡管目前使用的豬瘟疫苗對豬有很好的保護(hù)作用，但豬瘟卻始終無法得到徹底的根除，而且豬瘟病毒的感染也呈現(xiàn)了新的特點(diǎn)。目前豬瘟病毒感染除了一般看到的急性臨床癥狀以外，還有一些情況為宿主并不表現(xiàn)明顯的癥狀，呈現(xiàn)持續(xù)性感染狀態(tài)，長期攜帶病毒而不表現(xiàn)臨床癥狀的豬就成為重要的傳染源。病毒引起持續(xù)性感染，必須具備兩方面的功能一是不明顯表現(xiàn)溶細(xì)胞性，以免失去生存場所；二是逃避機(jī)體的免疫機(jī)制，以免遭到清除。CSFV的持續(xù)性感染的機(jī)理目前還不是很明確，但最近的研究標(biāo)明，CSFV與一些宿主基因的相互作用在其中起到了至關(guān)重要的作用。病毒的感染會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄譜劇烈的變化，這些變化基于病毒與宿主之間的共進(jìn)化，表現(xiàn)出兩種截然相反的策略，一種是病毒破壞細(xì)胞的新陳代謝，另一種則是宿主反擊病毒的感染(Hardwick & Griffin,1996)，病毒感染后宿主mRNA轉(zhuǎn)錄譜的變化究早前已經(jīng)有很多相關(guān)研究(Hsiang et al.，1996 ；Sorbara et al.，1996 ；Zhu et al.，1997 ；TalSinger et al.，1998 ；Boudinot etal.，1999 ；Zhang et al.，1999)，通過研究病毒感染后宿主mRNA表達(dá)變化，探索在抗病毒反應(yīng)和病毒誘導(dǎo)病理上存在潛力的基因蛋白。對感染豬瘟病毒后豬的基因轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)許多主效的抗病毒基因出現(xiàn)明顯的表達(dá)升高，如炎癥因子和免疫因子(ZixueSHI et al. , 2009 ；LI Jun et al.，2009)。而 Li 等的研究中觀察到，IRG6 (Inflammatoryresponse gene 6 protein, IRG6)在整個(gè)感染過程中，mRNA表達(dá)一直處在非常高的水平(Li Jun et al. , 2010) □有關(guān)IRG6的研究非常少，僅僅Dorf Ieutner等人發(fā)現(xiàn)其受NF_kB調(diào)控(文章未發(fā)表)。不過，我們通過NCBI BLAST系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，在基因結(jié)構(gòu)上，IRG6與其他物種中的干擾素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)病毒抑制蛋白(Virus inhibitory protein, endoplasmicreticulum-associated，interferon-inducible，viperin)有著非常高的同源性，而在主要的功能區(qū)域的同源性更達(dá)到90%左右。所以我們推測IRG6在功能上與viperin有著非常相似的特點(diǎn)。
干擾素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)病毒抑制蛋白(Viperin)是一種能被I、II型干擾素和多種抗原所誘導(dǎo)，并對多種DNA和RNA病毒具有抑制作用的蛋白。Viperin基因包含一個(gè)氮端跨膜螺旋，一個(gè)高度保守的碳端，并在中間區(qū)域擁有一個(gè)CX3CX2C序列，該序列是腺苷蛋氨酸酶(SAMe)類特有的。SAM酶類內(nèi)包含了一個(gè)[4Fe_4S]區(qū)域，是SAM主要的結(jié)合位點(diǎn)，而這一結(jié)構(gòu)在所有的Viperin結(jié)構(gòu)中都可以找到。Viperin以SAM酶形式,在宿主對抗病毒的侵襲中起到非常重要的作用(Goyal Shaveta et al. , 2010 ；Kaitlin S. Duschene etal.，2010)。C端的芳香族氨基酸對它的抗病毒功能的發(fā)揮是必須的，而缺少N端區(qū)域氨基酸的Viperin，則無法正常起到有效的抗病毒效果，盡管這部分并不是絕對需要的(DongJiang et al. ,2008)。Viperin通過N端1_42位氨基酸殘基所具有的親水性α螺旋定位到脂滴上。N端區(qū)域的α螺旋與丙肝病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白5Α在脂滴上擁有相同的結(jié)合區(qū)域，并在結(jié)合機(jī)理上也非常相似，HCV非結(jié)構(gòu)蛋白5Α和HCV的復(fù)制復(fù)合物正是通過結(jié)合到該區(qū)域進(jìn)行復(fù)制的。而Viperin便是利用這一特點(diǎn)競爭性地與脂滴結(jié)合，從而抑制HCV的復(fù)制(Miyanari Y et al. , 2007 ；Ella R. Hinsona et al. ,2009)。很多囊膜病毒的感染都可以誘導(dǎo)Viperin的表達(dá)，如艾滋病毒、仙臺(tái)病毒、埃博拉病毒、流感病毒、人巨細(xì)胞病毒、皰疹病毒、水泡性口咽病毒以及與豬瘟病毒同屬于·黃病毒屬的丙肝病毒(Keh-Chuang Chin et al. , 2001 ；Martina Severa et al. , 2006 ；Pierre Boudinot et al. , 2000 ；Karla J. Helbig et al. , 2005 ；Dong Jiang et al. ,2008 ；CHRISTOPHER H. WOELK et al. , 2004 ；Yugen Zhang et al. , 2007 ；Xiuyan Wang et al.,2007 ；Abdul A. Waheedl et al.，2007)，這些事實(shí)也充分表明Viperin在宿主抵抗病毒感染的重要作用。Chin和其同事發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定表達(dá)Viperin的纖維母細(xì)胞系能夠非常有效得抑制人巨細(xì)胞病毒(HCMV)的感染，但通過人類巨細(xì)胞病毒(HCMV)直接誘導(dǎo)Viperin的表達(dá)，其復(fù)制卻未受到Viperin的抑制，HCMV可以通過將Viperin從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重配到高爾基體上，消除Viperin的影響。(Keh-Chuang Chin et al, 2001)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細(xì)胞生命活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用，包括粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)一些主要蛋白合成、膜蛋白整合的場所；其次，光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)則是脂質(zhì)合成的重要場所，包括了細(xì)胞內(nèi)磷脂、膽固醇和幾乎所有的脂膜的合成，因此，顯而易見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是病毒和Viperin相互作用的重要場所。隨后Wang等證實(shí)，Viperin是通過結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的法尼基二磷酸合成酶(FPPS)擾亂脂筏對流感病毒的出芽釋放作用。FPPS作為細(xì)胞內(nèi)一種重要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶，在很多囊膜病毒的組裝和釋放中起著非常重要的作用，也具備開發(fā)相關(guān)抗病毒藥物的潛力(Xiuyan Wang etal. ,2007 ；Abdul A. Waheedl et al. ,2007) 不過水泡性口咽病毒雖然能誘導(dǎo) Viperin 的表達(dá)，但其復(fù)制卻不受到抑制(Pierre Boudinot et al. , 2000),而水泡性口咽病毒并不通過脂筏途徑釋放。這一有趣的事實(shí)表明，Viperin主要對利用脂筏釋放的病毒有著抑制作用。當(dāng)然，Viperin與病毒的作用不是獨(dú)立的，它在體內(nèi)與很多其他的抗病毒反應(yīng)的基因一起構(gòu)成一個(gè)非常密切而復(fù)雜的防御系統(tǒng)。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)除了病毒和干擾素外，脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、雙鏈 RNA(poly (I-C))也能夠誘導(dǎo) Viperin 高量的表達(dá)。而最近的對丙肝病毒研究中還發(fā)現(xiàn)，Viperin的表達(dá)受到干擾素刺激因子3正調(diào)控，同時(shí)正調(diào)節(jié)結(jié)合區(qū)域因子I則通過與干擾素刺激因子3競爭性地結(jié)合病毒的方式抑制viperin的誘導(dǎo)表達(dá)。在所有的丙肝病毒患者體內(nèi)，Viperin—直呈現(xiàn)一個(gè)比較高的表達(dá)水平，在體內(nèi)它與其他的ISGs (干擾素誘導(dǎo)因子)相互作用抵抗HCV的感染，如干擾素刺激因子20和蛋白酶R0 (Dong Jiang et al. ,2008 ；Martina Severa et al. ,2006 ；Karla J.Helbig et al.,2005)。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能是密不可分的，所以，IRG6與Viperin功能結(jié)構(gòu)上的高同源性提示，其必然在功能上與Viperin上有著相似性。在感染豬瘟病毒過程中，IRG6出現(xiàn)的mRNA高水平的表達(dá)(Li Jun et al.，2010)，也說明IRG6與豬瘟病毒感染的密切關(guān)系。而揭開這層神秘的關(guān)系，則需要在蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步分析IRG6的功能以及與豬瘟病毒的相互關(guān)系。利用IRG6潛在的抗病毒特性，通過基因工程的方法，克隆IRG6并構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系作為豬瘟病毒感染豬的機(jī)制研究的系統(tǒng)，有利于進(jìn)一步研究豬瘟持續(xù)性感染的機(jī)理以及開發(fā)抗豬瘟的治療藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種具有潛在抗病毒作用的蛋白基因和穩(wěn)定表達(dá)該基因蛋白的細(xì)胞系，進(jìn)行抗豬瘟病毒的基因克隆及其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建，用于研究豬瘟病毒感染機(jī)制，
本發(fā)明的具體技術(shù)方案是本發(fā)明的抗豬瘟病毒的基因克隆及其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建包括以下的步驟I、基因片段的獲得。2、載體的構(gòu)建。3、穩(wěn)定表達(dá)IRG6蛋白細(xì)胞系的篩選。4、檢測報(bào)告基因的表達(dá)。以上所述的基因片段的獲得，首先是采集豬瘟病毒感染豬的靜脈血，用淋巴細(xì)胞分離液分離血液中的淋巴細(xì)胞，淋巴細(xì)胞分離步驟如下①靜脈采集豬外周血IOml (加肝素作為抗凝劑)，用等量的PBS稀釋。②取四個(gè)離心管，分別加入5ml的淋巴細(xì)胞分離液，將20ml稀釋的血液平均分成四份，分別沿管壁小心地注入已經(jīng)加有分離液的離心管中，務(wù)必使其分層。③2000rpm，20 分鐘。④吸取離心管中分離層的第二層白色的淋巴細(xì)胞，用相同體積的的PBS稀釋，2000rpm離心5分鐘。⑤棄上清，加入5ml的紅細(xì)胞裂解液，充分混勻，作用5-10分鐘，2000rpm, 5分鐘。⑥棄上清，加入5mlPBS，吹散細(xì)胞，2000rpm，離心5分鐘。⑦棄上清，加入適量的PBS或者細(xì)胞培養(yǎng)液，吹散分裝到小EP管中。抽提細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄，然后根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的IRG6序列為模板，利用IRG6-R/F擴(kuò)增出包含IRG6-0RF的IRG6-KZ大片段。所述的載體構(gòu)建是以IRG6-KZ和P⑶NA-GFP質(zhì)粒為模板分別設(shè)計(jì)兩對含有酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增出IRG6-E和GFP-E，并運(yùn)用雙酶切、T4連接酶將GFP和IRG6分別亞克隆到P⑶NA3. I載體上。所述的雙酶分別為核酸內(nèi)切酶Hind III和Xho I。所述的IRG6穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的篩選是將構(gòu)建好的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后傳代轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞，并使用終濃度為1000-1600tg/mL的G418篩選細(xì)胞，以終濃度為400-800 μ g/mL G418為維持篩選濃度，連續(xù)篩選約10-14天后，挑單個(gè)克隆細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得IRG6蛋白與GFP穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，通過RT-PCR檢測到IRG6-GFP嵌合基因。本發(fā)明所述的編碼IRG6的基因，其功能與突變的核苷酸序列相同，突變形式包括缺失、無義、插入、錯(cuò)義。本發(fā)明的具體做法是從感染豬痕病毒的廣西巴馬香豬(Sus scrofa domestica)外周血中分離得到淋巴細(xì)胞，通過抽提總RNA，使用PCR擴(kuò)增目的基因，得到了一種潛在抗病毒基因豬炎癥反應(yīng)基因 6 (Inflammatory response gene 6 protein, IRG6)。IRG6 基因是由1089個(gè)堿基組成，含有完整的0RF，它的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。IRG6基因編碼的蛋白質(zhì)是一類腺苷蛋氨酸酶，由361個(gè)氨基酸組成，和其他動(dòng)物基因組中的干擾素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)病毒抑制蛋白(Virus inhibitory proteinendoplasmic reticulum-associated interferon-inducible, viperin)基因同源性非常高。該基因含有Viperin非常相似的作用元件，因此具備類似的抑制豬瘟病毒或者其他病 毒復(fù)制的能力。以下是本發(fā)明人對IRG6的基因進(jìn)行核苷酸測序并對所得核苷酸序列進(jìn)行氨基酸序列推導(dǎo)，列表如下I、源于廣西巴馬豬基因組的潛在抗豬瘟病毒基因IRG6(I)序列特征a.長度1089堿基對b.類型DNA/RNAc.鏈型雙鏈d.幾何結(jié)構(gòu)線性(2)分子類型核苷酸(3)序列描述ATGTGGACACTGGTACCTGTCACCTTTGCCCTCAGGCTGCTGAGCACCTTCGTGCAGCCCCTGGGCTCGCTGGGCAGCAGCCTGGGACCCCTGTTCCTCTGGCTCTGGGCAGCTTTCTGGCGGGCAGGGGGTGATAGGAGCCGGCAGCAGCTGCAGGGTAAAACAGAAG
CTGGGGAACCCCCGAGGGCACAGGAGGACAGCCATCTGCCCACCACCCCCACTAGCGTCAATTACCACTTCACCCGCCAGTGCAACTACAAGTGTGGCTTCTGCTTCCACACGGCCAAGACATCCTTCGTGCTGCCCCTGGAGGAAGCCAAGAGAGGCTTGTGGCTGCTGAAGGAAGCGGGTATGGAGAAGATCAACTTTTCAGGCGGAGAGCCGTTTATCCACGACCGGGGCGAGTACCTGGGCAAGCTGGTCAGGTTCTGCAAGGAGGAGCTACAGCTGCCCAGTGTCAGCATCGTGAGCAACGGGAGCCTGATCTGGGAGAGGTGGTTCAAGAGCTATGGTGAATATCTGGACATTCTTGCCATCTCCTGTGACAGCTTTGATGAGCAGGTCAATGTCCTTATTGGCCGTGGTCAGGGAAAGAAGAACCATGTGGAAAATCTCCAAAAACTGAGGACGTGGTGCAGGGATTATAAAGTGGCCTTCAAGATAAATTCAGTCATCAATCGCTTCAATGTGGAAGAAGATATGACAGAACACATCAAAGCTCTGAACCCTGTCCGCTGGAAGGTCTTCCAATGCCTCTTAATTGAGGGTGAGAATGTTGGAGAAGATGCTCTGAGAGAAGCAGAGCAGTTTGTTATCAGCGACGAAGAGTTTGAGGAATTCTTAGACCGCCACAAAGACGTGTCCTGCTTGGTGCCCGAGTCTAACCGGCAGATGAGA
GATTCCTACCTTATTCTGGATGAATATATGCGCTTCCTGAACTGTAGAAACGGGCGGAAGGATCCATCCAAGTCCATCCTGGATGTCGGGGTAGAAAAAGCCATAAAATTCAGTGGCTTTGATGAAAAGATGTTTCTAAAGCGAGGAGGAAAATATGTATGGAGCAAGGCGGACCTGAAGCTGGACTGGTGA2、IRG6基因推導(dǎo)的氨基酸序列(I)序列特征a.長度361氨基酸b.類型多肽 c.鏈型單鏈d.幾何結(jié)構(gòu)立體(2)分子類型蛋白質(zhì)(3)序列描述MWTLVPVTFALRLLSTFVQPLGSLGS SLGPLFLffLffAAFffRAGGDRSRQQLQGKTEAGEPPRAQEDSHLPTTPTSVNYHFTRQCNYKCGFCFHTAKTSFVLPLEEAKRGLWLLKEAGMEKINFSGGEPFIHDRGEYLGKLVRFCKEELQLPSVSIVSNGSLIWERWFKSYGEYLDILAISCDSFDEQVNVLIGRGQGKKNHVENLQKLRTWCRDYKVAFKINSVINRFNVEEDMTEHIKALNPVRWKVFQCLLIEGENVGEDALREAEQFVISDEEFEEFLDRHKDVSCLVPESNRQMRDSYLILDEYMRFLNCRNGRKDPSKSILDVGVEKAIKFSGFDEKMFLKRGGKYVffSKADLKLDff。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是I、從廣西壯族自治區(qū)巴馬縣本土的香豬(Sus scrofa domestica)外周血中分離得到淋巴細(xì)胞，抽提總RNA，PCR擴(kuò)增，得到了一種潛在抗病毒基因豬炎癥反應(yīng)基因6 (Inflammatory response gene 6 protein, IRG6),進(jìn)一步分析 IRG6 的功能及其與豬痕病毒的相互作用關(guān)系。利用IRG6潛在的抗病毒特性，通過基因工程的方法，克隆IRG6基因并構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系作為豬瘟病毒致病機(jī)制研究的系統(tǒng)，有利于進(jìn)一步研究豬瘟持續(xù)性感染的機(jī)理以及開發(fā)抗豬瘟病毒的治療藥物。2、目前關(guān)于抗病毒基因豬炎癥反應(yīng)基因6(Inflammatory response gene 6protein, IRG6)還沒有相關(guān)的任何報(bào)道，而利用構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)IRG6蛋白的細(xì)胞系可以進(jìn)行抗病毒研究，因此本發(fā)明在抗病毒研究中具有重要學(xué)術(shù)價(jià)值和實(shí)踐意義。3、利用構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)IRG6蛋白的細(xì)胞系進(jìn)行抗病毒研究，可以分析IRG6的功能，為下一步研發(fā)帶有抗豬瘟病毒基因的克隆豬“抗豬瘟克隆豬”的打下基礎(chǔ)?？关i瘟克隆豬意味著它們由于自身肌體“不易感”，終生無需注射任何疫苗，就能抵抗豬瘟。對作為世界上最大的豬肉生產(chǎn)國和消費(fèi)國的中國來說，意義十分重大。在養(yǎng)殖生產(chǎn)的實(shí)際過程中，就可以減少投入、降低成本。同時(shí)，這種克隆豬對人類的健康不會(huì)有任何負(fù)面影響，而且更有益于食品的安全。4、通過本發(fā)明的基因分析和構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)，能夠進(jìn)行一些囊膜病毒如艾滋病毒、仙臺(tái)病毒、埃博拉病毒、流感病毒、人巨細(xì)胞病毒、皰疹病毒、水泡性口咽病毒的基因分析和構(gòu)建表達(dá)，揭示這些病毒的致病機(jī)制，找出相應(yīng)的抗病毒制劑，為人類服務(wù)。
具體實(shí)施方式
下面的優(yōu)選例對本發(fā)明作詳細(xì)敘述，但并不意味著限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中常規(guī)分子克隆操作參照文獻(xiàn)(《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，金冬燕等譯，1995年，科學(xué)出版社)。本發(fā)明的實(shí)施例中所用到的材料包括病毒豬瘟病毒石 門株；細(xì)胞PK-15(豬腎傳代細(xì)胞系)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物廣西巴馬香豬。IRG6 基因的序列以 Sus scrofa inflammatory response protein 6 (IRG6)mRNA序列為模板(NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫，索引號(hào)為NM_213817. I);大腸桿菌(Escherichiacoli)株DH5a為本實(shí)驗(yàn)室保存；限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、PCR擴(kuò)增DNA克隆載體pMD18_TVector購自TAKARA公司。質(zhì)粒抽提試劑盒及凝膠DNA回收試劑盒購自天根生物公司；DNA Marker、普通Taq酶等購自東盛生物公司公司；脂質(zhì)體、淋巴細(xì)胞分離液、TRIZOL購自Invitrogen公司；氯仿購自廣東汕頭市光華化學(xué)廠；異丙醇購自廣州化學(xué)試劑二廠；無水乙醇購自廣東汕頭市西隴化工廠；M_MuLV Reverse Transcriptase購自Promega公司。大腸桿菌培養(yǎng)基為普通的LB(蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 5g，水1000ml，pH7. O)和LA液體培養(yǎng)基(LB液體培養(yǎng)基中每升加12g瓊脂粉，調(diào)PH值到7. 2，高壓滅菌)。實(shí)施例I基因片段的獲得(I)淋巴細(xì)胞分離靜脈采集感染了豬瘟病毒的廣西巴馬香豬外周血10ml，用等量的PBS稀釋。取4個(gè)離心管，分別加入5ml的淋巴細(xì)胞分離液，將20ml稀釋的血液平均分成四份，分別沿管壁小心地注入已經(jīng)加有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，務(wù)必使其分層。2000rpm，20min。小心吸取離心管中分離層的第二層白色的淋巴細(xì)胞，用等體積的PBS稀釋，2000rpm離心5min。棄上清，加入5ml的紅細(xì)胞裂解液，充分混勻，室溫作用5-10min后，2000rpm，5min。棄上清，加入5mlPBS，吹散細(xì)胞，2000rpm,離心5min。棄上清，加入適量的PBS或者細(xì)胞培養(yǎng)液，吹散分裝到小EP管中，每管300 μ I。(2)淋巴細(xì)胞的處理取300 μ I的細(xì)胞懸液，加入600 μ I的Trizol，冰浴作用lOmin。放入_80°C保存，或者直接用于RNA的抽提。(3) IRG6-KZ大片段的獲得，設(shè)計(jì)如下一對引物IRG-6KZ-R 5/ TGC TGC CAT GTG GAC ACT GGT AC 3'IRG-6KZ-F 5/ GGT TTC TTC TCC CAG GTA CTC ACT C 3'抽提淋巴細(xì)胞的總RNA，并42°C反轉(zhuǎn)錄I小時(shí)。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳，在大約1588bp處有很亮的目的條帶(如圖I)，回收目的片段，PCR產(chǎn)物插入PMD18-T vector (TAKARA產(chǎn)品)。命名為IRG6-KZ。(4) IRG6開放閱讀框(ORF)基因的獲得，設(shè)計(jì)如下一對引物p-IRG6-R 5/ CC aag ctt ACC ATG GGG ACA CTG GTA CCT GTC AC-3/p-IRG6-F 5/ -CG ctc gag CCA GTC CAG CTT CAG GTC C~3/以IRG6-KZ質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)I. O %瓊脂糖電泳，在大約1102bp處有很亮的目的條帶(如圖2)，即IRG6基因，回收目的片段進(jìn)行測序，得到包括完整ORF的IRG6核苷酸序列(如圖7)，經(jīng)推導(dǎo)獲得IRG6的氨基酸序列(如圖8)。PCR產(chǎn)物插入 PMDl8-T vector (TAKARA 產(chǎn)品)。命名為 IRG6_E。(5)GFP基因的獲得，設(shè)計(jì)如下一對引物GFP-R 5' -CGCTCGAGACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3'GFP-F 5/ GCTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCAT-3'以P-GFP質(zhì)粒(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，含有GFP基因)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)I. 2%瓊脂糖電泳，在大約732bp處有很亮的目的條帶，即GFP基因(如圖3)，回收目的片段，PCR 產(chǎn)物插入 pMD18-T vector (TAKARA 產(chǎn)品)。命名為 GFP-E。·
實(shí)施例2載體的構(gòu)建pcDNA3. 1+(本實(shí)驗(yàn)室保存)用Xho I和Xba I雙酶消化，回收酶切產(chǎn)物(5. 4kb)。GFP-E plasmid也用Xho I和Xba I雙酶消化，回收700bp左右的片段。兩段回收產(chǎn)物用T4DNA Iigase連接。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。此載體命名為pC-GFP。pC-GFP plasmid用HindIII I和Xho I雙酶消化，回收酶切產(chǎn)物(6kb)。IRG6-E plasmid也用Hind III和Xho I雙酶消化，回收1102bp左右的片段。兩段回收產(chǎn)物用T4 DNA Iigase連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。此載體命名為pC-IRG6-GFP(圖4)。實(shí)施例3穩(wěn)定表達(dá)IRG6蛋白細(xì)胞系的篩選載體p-IRG6-GFP通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入PK-15細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24小時(shí)用胰酶消化轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按照I : 4的比例傳代，在細(xì)胞貼壁后向細(xì)胞上清中添加終濃度為1000-1600 μ g/mL的G418進(jìn)行篩選，繼續(xù)培養(yǎng)約7天左右，期間每三天換一次液，并補(bǔ)適量的G418，待對照孔的細(xì)胞(未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞)全部脫落后，將篩選濃度下調(diào)到400-800 μ g/mL,繼續(xù)培養(yǎng)大約7天。通過熒光顯微鏡觀察篩選目的細(xì)胞株，將表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞團(tuán)標(biāo)記，添加少量胰酶消化10秒鐘，小心用小濾紙片覆蓋上，約10秒后取回小濾紙，用培養(yǎng)液洗滌數(shù)次。將洗滌液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)板中，添加終濃度為400-800 μ g/ml的G418擴(kuò)大培養(yǎng)。經(jīng)過2代的擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得IRG6蛋白與GFP穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系(如圖5)，通過RT-PCR檢測到IRG6-GFP嵌合基因(圖6)。


圖 I 是 IRG6-KZ 大片段 DNA 的 PCR 電泳圖。M，DNAMarker ;1，IRG6-KZ 大片段 DNA。圖 2 是 IRG6-0RF DNA 片段 PCR 電泳圖。M，DNA Marker ;1，IRG6-0RF DNA 片段。圖 3 是 p-IRG6-GFP Hind ΙΙΙ/Xba I 雙酶切圖。M, DNA Marker ;1，HindiI/Xbal雙酶切的IRG6-GFP基因片段。圖4A是倍數(shù)物鏡下的IRG6-GFP融合蛋白穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞。圖4B為穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞。圖5是IRG6-GFP融合蛋白穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系進(jìn)行RT-PCR檢測。M，DNA Marker ；1，IRG6 片段；2，GFP 片段；3，IRG6-GFP 片段。
權(quán)利要求
1.一種抗豬瘟病毒的IRG6基因克隆及其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建，其特征在于包括以下的步驟 (I)基因片段的獲得；(2)載體的構(gòu)建；(3)穩(wěn)定表達(dá)IRG6蛋白細(xì)胞系的篩選；(4)檢測報(bào)告基因的表達(dá)； 所述的基因片段的獲得，首先是采集豬瘟病毒感染豬的靜脈血，用淋巴細(xì)胞分離液分離血液中的淋巴細(xì)胞，抽提細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄，然后根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的IRG6序列為模板，擴(kuò)增出包含IRG6開放閱讀框ORF的IRG6-KZ大片段； 所述的載體構(gòu)建是以IRG6-KZ和PCDNA-GFP質(zhì)粒為模板分別設(shè)計(jì)兩對含有酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增出IRG6-E和GFP-E，并運(yùn)用雙酶切、T4連接酶將GFP和IRG6分別亞克隆到P⑶NA3. I載體上；所述的雙酶分別為核酸內(nèi)切酶Hind III和Xho I ； 所述的IRG6穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的篩選是將構(gòu)建好的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞24小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞傳代，并使用終濃度為1000-1600 μ g/ml的G418篩選，以終濃度為400-800 μ g/ml G418為維持篩選濃度，連續(xù)篩選約14天后，挑單個(gè)克隆細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得IRG6蛋白與GFP穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，通過RT-PCR檢測到IRG6-GFP嵌合基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗豬瘟病毒的IRG6基因克隆及其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建，其特征在于淋巴細(xì)胞分離是靜脈采集感染了豬瘟病毒的廣西巴馬香豬外周血10ml，用等量的PBS稀釋。取4個(gè)離心管，分別加入5ml的淋巴細(xì)胞分離液，將20ml稀釋的血液平均分成四份，分別沿管壁小心地注入已經(jīng)加有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，使其分層，2000rpm，20min，小心吸取離心管中分離層的第二層白色的淋巴細(xì)胞，用等體積的PBS稀釋，2000rpm離心5min,棄上清，加入5ml的紅細(xì)胞裂解液,充分混勻，室溫作用5_10min后,2000rpm,5min，棄上清，加入5ml PBS,吹散細(xì)胞，2000rpm,離心5min，棄上清，加入適量的PBS或者細(xì)胞培養(yǎng)液，吹散分裝到小EP管中，得細(xì)胞懸液；然后取300 μ I的細(xì)胞懸液，加入600 μ I的Trizol，冰浴作用lOmin，放入_80°C保存，或者直接用于RNA的抽提。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的抗豬瘟病毒的IRG6基因克隆及其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建，其特征在于 所述的編碼IRG6的基因，其功能與突變的核苷酸序列相同，突變形式包括缺失、無義、插入、錯(cuò)乂。
4.如權(quán)利要求I所述的抗豬瘟病毒的IRG6基因克隆及其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建，其特征在于豬的抗豬痕病毒基因豬炎癥反應(yīng)基因6蛋白(Inflammatory response gene 6protein, IRG6)基因,其核苷酸和蛋白質(zhì)序列如下 (I)核苷酸序列為ATGTGGACACTGGTACCTGTCACCTTTGCCCTCAGGCTGCTGAGCACCTTCGTGCAGCCCCTGGGCTCGCTGGGCAGCAGCCTGGGACCCCTGTTCCTCTGGCTCTGGGCAGCTTTCTGGCGGGCAGGGGGTGATAGGAGCCGGCAGCAGCTGCAGGGTAAAACAGAAGCTGGGGAACCCCCGAGGGCACAGGAGGACAGCCATCTGCCCACCACCCCCACTAGCGTCAATTACCACTTCACCCGCCAGTGCAACTACAAGTGTGGCTTCTGCTTCCACACGGCCAAGACATCCTTCGTGCTGCCCCTGGAGGAAGCCAAGAGAGGCTTGTGGCTGCTGAAGGAAGCGGGTATGGAGAAGATCAACTTTTCAGGCGGAGO 自}n_SMS_lsHCHoS^IVimMMSISMSdaMoNHoNUHMWsnASSMCIMSSinoSACHΗΗα 3￡33α3ΙΛ&3ν πνα3οΛΝ3ο333ο·Λ\ΜΜαΗΝ ν}ΙΙΗ3ΧΜΗ3ΛΝ^ΗΝΙΛ3ΝΙΜνΛ}ΙΑ§3Μ π}Ι3Ν3ΛΗΝ}Η050Η0ΠΛΝΛ53ε3α33Ιν α Α30ASMM3MnsoNSMSASCn333}DfeinxnA3c)HaHI&3ssfeI}mM}v3}nlAnoMvslcniusxwxMMooMNomlJ^HAMSXdxxcnHsasVHddsvaχχ}3ο·§^αοονΗδννΛΠΛΓΜ αΗο 33ο 3ο αΗ5Λ&3υπν&ΛαΗΛκ-1χ 義"S ^ voxs X3VSX3 義0SV§_V3S_X_XVVVV__§VVVX3XX xoxvovvvvoxvoxxxoooxovoxxvvvvxvooovvvvvovxssoxoxvsx 00^<00^0<<00^<00^<00 0000000< 0<^0^0 0^00^^0000^<^< Χννοχνοοχ3χχνχχ33νχ33χχνονονοχνονοοο33ννχ3χονο333οχοοχχ 3οχ33χοχο3νοννν3ν33ο33νονχχ3χχννοονοχχχονοννο3νο3ον3χν χχοχχχονοονονοοννονονοχοχοοχνοννονοοχχοχννονοχοοονοχχν <^^0^000^<<00^^0^00 00^0000^0^000 0^0^00< 0^<0<0 0< :}νοχνχνοννοννοοχοχνν3χχ3ο3χνν3χν3χον3χχνννχνοννοχχ33οο ^0 <^<^^<000<00^00^00<00<0^0 <00^0^<< 00^0^<00 0 VVOVVVOSVOXOOXOCJOOOXXVXXOOXOXVVOXSVOOVOXVOXXXOOVOVOX Οχ33χ3χν33οχχ3χχν3νοοχ3χνχννοχοοχνχ3ονοννοχχοοχοονονοοο ^0^<0^000<0000<<00<0^00^<00<0^ 0^0<0000^00<0<^00<00<00< vooxoxxsvoxooxoovvoosxoovxovoossoovoovooxvxxxoooovX S/S f ^ ^ r-令Kl V 8coco668sT—Iδ
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有潛在抗豬瘟病毒特性的IRG6基因克隆及其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建，其特征在于包括以下的步驟(1)基因片段的獲得；(2)載體的構(gòu)建；(3)穩(wěn)定表達(dá)IRG6蛋白細(xì)胞系的篩選；(4)檢測報(bào)告基因的表達(dá)；本發(fā)明能夠用于研究豬瘟病毒感染機(jī)制，并通過揭示該蛋白基因抗豬瘟病毒的機(jī)制，開發(fā)一種治療豬瘟的藥物。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102899338SQ201110180019
公開日2013年1月30日 申請日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月30日
發(fā)明者羅廷榮, 孫石開, 蔡新斌, 李曉寧, 蘇麗娟, 尹珊, 李曉泉, 李延生 申請人:廣西大學(xué)