專利名稱：鑒別冬蟲(chóng)夏草真?zhèn)蔚膒cr引物對(duì)、試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥材鑒別領(lǐng)域，具體涉及鑒別冬蟲(chóng)夏草真?zhèn)蔚腜CR引物對(duì)、試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
冬蟲(chóng)夏草Cordyceps sinensis (Berkeley) Saccardo為麥角菌科真菌冬蟲(chóng)夏草菌寄生在鱗翅目蝙蝠蛾科蝠蛾屬(Hepialus)幼蟲(chóng)上形成的蟲(chóng)生子囊真菌，為麥角菌科蟲(chóng)草屬真菌冬蟲(chóng)夏草的子座及其寄主鱗翅目蝙蝠蛾科昆蟲(chóng)蝙蝠蛾的幼蟲(chóng)尸體的復(fù)合物，主要分布青藏高原，菌性屬于低溫型，生長(zhǎng)在海拔3，800m的雪線以上，性甘平，補(bǔ)肺益腎，止血化痰，用于久咳虛喘，勞咳咯血，陽(yáng)痿遺精，腰膝酸痛，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材。由于冬蟲(chóng)夏草具有特殊的藥理作用和治療功效，市場(chǎng)上出現(xiàn)了許多與冬蟲(chóng)夏草形態(tài)相似的偽品，其中亞香棒蟲(chóng)草(Cordyc印s hawkesii Gray)是最為常見(jiàn)的偽品。亞香棒蟲(chóng)草又稱霍克斯蟲(chóng)草，其寄主為鱗翅目蝙蝠蛾科棒蝠蛾屬(Napialus)幼蟲(chóng)，分布于湖南、江西、湖北、安徽、浙江、福建、廣東等省山區(qū)及丘陵低海拔區(qū)域。亞香棒蟲(chóng)草與冬蟲(chóng)夏草在形態(tài)上相似，常被不法商販冒充冬蟲(chóng)夏草出售。此外，北蟲(chóng)草Cordyc印s militaris (Li) Link, 又稱蛹蟲(chóng)草也是最為常見(jiàn)的偽品之一。北冬蟲(chóng)夏草，為同屬真菌蛹蟲(chóng)草寄生在鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等昆蟲(chóng)蛹體上的復(fù)合物，菌性屬中溫型，生長(zhǎng)在低海拔的平原地域，主要分布在東北、華北、西北等省區(qū)，民間用于肺炎、腎虛、腰痛等疾病的治療。冬蟲(chóng)夏草由于生長(zhǎng)地理的特殊要求，以及嚴(yán)格的寄生性，造成其資源極其稀少，兼之采收的不易更使得野生冬蟲(chóng)夏草顯得十分珍貴，價(jià)格昂貴。而偽蟲(chóng)草在名稱、外形上與之相似，因而常作為冬蟲(chóng)夏草的混淆品出現(xiàn)在藥材市場(chǎng)。因而在本領(lǐng)域需要有一種特異性的檢測(cè)鑒別冬蟲(chóng)夏草的可靠方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種特異性的檢測(cè)鑒別冬蟲(chóng)夏草的可靠方法。本發(fā)明為了解決上述技術(shù)問(wèn)題所技術(shù)方案是提供一種鑒別冬蟲(chóng)夏草真?zhèn)蔚腜CR引物對(duì)。該鑒別冬蟲(chóng)夏草真?zhèn)蔚腜CR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))引物對(duì)的序列為上游引物(SEQID No. 1) :5，CAATAAATACCGATACAGGGC 3，；下游引物(SEQID No. 2) :5，TGTCTGGACCTGGTGAGTTT 3，。本發(fā)明還提供一種鑒別冬蟲(chóng)夏草真?zhèn)蔚腜CR試劑盒。該P(yáng)CR試劑盒包括從提取的樣品DNA中PCR擴(kuò)增待測(cè)樣品DNA片段的引物對(duì)，包括上述的引物對(duì)。當(dāng)然，該P(yáng)CR試劑盒還可包括一般的PCR擴(kuò)增所需的各種標(biāo)準(zhǔn)試劑。優(yōu)選采用超保真試劑。本發(fā)明另外還提供了一種鑒別冬蟲(chóng)夏草的方法。該方法包括以下步驟a、獲取樣品總DNA;b、采用上述的引物對(duì)在PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增；C、對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并與SEQ ID No. 3所示的序列比對(duì)，其中的與SEQ IDNo. 6對(duì)應(yīng)部分100%符 合者為真品，否則為偽品。100%符合者為真品，否則為偽品。其中，上述方法步驟b所述的PCR擴(kuò)增的條件為
預(yù)變性98 °C, Imin 變性98 °C, IOsec 退火60°C，20sec I 30 cycles 延伸72°C，30sec .
延伸72 °C, 5min其中，上述方法步驟b所述的PCR擴(kuò)增的體系為PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體積為 50 μ 1，其中 13. 6μ 1 ddH20, 2XPhusion Master mix 25. Ομ 1,7. 4μ 1 的 5MBetaine，上、下游引物(10ym/L)各 1· 0μ 1，DNA 模板 2· 0μ 1。為確保PCR擴(kuò)增時(shí)序列的正確性，PCR試劑優(yōu)選采用超保真試劑2XPhusi0n Master Mix (產(chǎn)品編號(hào)F-532L，購(gòu)自NEB公司)，5M Betaine (產(chǎn)品編號(hào)B 0300)購(gòu)自 sigma公司ο本發(fā)明經(jīng)過(guò)充分的前期試驗(yàn)篩選和優(yōu)化，得到有效的PCR引物對(duì)。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明引物對(duì)能夠有效地?cái)U(kuò)增冬蟲(chóng)夏草及其常見(jiàn)贗品的目標(biāo)片段，并且能夠準(zhǔn)確地鑒別，使用該引物對(duì)進(jìn)行鑒別的方法是特異性的檢測(cè)鑒別冬蟲(chóng)夏草的可靠方法，具有很好的應(yīng)用前
旦
ο


圖1、本發(fā)明的引物設(shè)計(jì)示意圖，其中有下劃線的斜體部分為所設(shè)計(jì)的引物特異性結(jié)合的位置。只有下劃線的部分為主要用于比對(duì)的579個(gè)堿基的區(qū)域?yàn)榭尚艆^(qū)間。圖2、使用本發(fā)明引物對(duì)擴(kuò)增的玉樹(shù)冬蟲(chóng)夏草18S片段序列與亞香棒蟲(chóng)草、北蟲(chóng)草 18S序列片段比較結(jié)果，2-A和2-B的結(jié)果是連續(xù)的。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖通過(guò)具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說(shuō)明。實(shí)施例一檢測(cè)PCR引物的設(shè)計(jì)與合成及對(duì)樣品進(jìn)行檢驗(yàn)1、設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物根據(jù)GenBank上公開(kāi)登錄的冬蟲(chóng)夏草18s核糖體基因序列信息進(jìn)行引物的設(shè)計(jì) (設(shè)計(jì)引物的部分參見(jiàn)圖1)。序列信息為GenBank :HM135169(共 1741bp)，(Cordyceps sinensis, 18S ribosomal RNA, http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/HM135169)。在446-466 設(shè)計(jì)上游引物，命名為CC18s_F。序列為5，CAATAAATACCGATACAGGGC 3，(SEQ ID No. 1)；在1179-1198 設(shè)計(jì)下游引物，命名為CC18s_R。序列為5，TGTCTGGACCTGGTGAGTTT3，(SEQ ID No. 2)。擴(kuò)增的目標(biāo)序列為SEQ ID No. 3所示(446-1198)。優(yōu)選中間的共計(jì)579個(gè)堿基的區(qū)域?yàn)榭尚艆^(qū)間(參見(jiàn)圖1中下劃線部分)2、提取蟲(chóng)草DNA冬蟲(chóng)夏草為本公司購(gòu)自 青海玉樹(shù)；亞香棒蟲(chóng)草購(gòu)自浙江；北蟲(chóng)草購(gòu)自遼寧；由中科院西北高原生物研究所中藥鑒定室鑒定。提取蟲(chóng)草DNA所用試劑為“柱式真菌DNAout基因提取試劑盒”(產(chǎn)品編號(hào) 70901-50)購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提??；準(zhǔn)確稱取干燥樣品lOOmg，液氮研磨成粉后轉(zhuǎn)移到1. 5mL離心管中，加入ImL溶液 A充分混勻，65°C保溫30分鐘；12，OOOrpm離心3分鐘；轉(zhuǎn)移上清到新離心管中，加入等體積的溶液B，混勻，冰浴5分鐘；室溫12，OOOrpm離心3分鐘，轉(zhuǎn)移上清到新的離心管中；力口入0. 2mL氯仿，振蕩30秒混勻；室溫12，OOOrpm離心3分鐘，轉(zhuǎn)移上清到新離心管中；加入 1. 5倍體積的溶液C，混勻，將混合液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，室溫放置5分鐘；12，OOOrpm離心1分鐘；加入0. 7mL洗柱液，室溫離心1分鐘；加入0. 3mL洗柱液重復(fù)一次；空甩1分鐘去除殘留液體；將離心柱放置在一新的1. 5mL離心管中，加入30uL通用洗脫液。室溫放置 5分鐘后離心1分鐘，即獲得DNA溶液，-20°C保存。3、PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列為確保擴(kuò)增的正確性，PCR試劑采用超保真試劑2XPhusi0n Master Mix (產(chǎn)品編號(hào)F-532L，試劑購(gòu)自 NEB 公司)，5M Betaine (B 0300)購(gòu)自 sigma 公司。PCR反應(yīng)體系如下表1 PCR反應(yīng)體系
組分.體積(μ )"ddH^O^
2χ Phusion MMix25.0
5M Betaine7.4
SEQ ID No. 1 (ΙΟμηι/L)1.0
SEQ ID No. 2 (ΙΟμηι/L)1.0
_DNA2.0
Total Volume (總體積)50PCR反應(yīng)條件如下
預(yù)變性98 °C,Imin 變性98 °C，IOsec ^ 退火60°C，20sec I 30 cycles 延伸72°C，30sec -
延伸72 °C,5min
PCR反應(yīng)結(jié)束后，取各PCR反應(yīng)產(chǎn)物3 μ 1加1 μ 1加樣緩沖液(6XLoading Buffer)在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。電壓100V，電泳時(shí)間30-40min。紫外光下觀察電泳結(jié)果，可使用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后凝膠回收試劑盒回收純化，進(jìn)行測(cè)序(英駿生物有限公司)。測(cè)序結(jié)果，玉樹(shù)冬蟲(chóng)夏草(SEQ ID No. 4)，亞香棒蟲(chóng)草(SEQ ID No. 5)，北蟲(chóng)草(SEQ ID No. 6)
4、測(cè)序結(jié)果分析 待擴(kuò)增的冬蟲(chóng)夏草標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)序列長(zhǎng)度為753個(gè)堿基。測(cè)序時(shí)，以上游引物和下游引物作為測(cè)序反應(yīng)的引物進(jìn)行測(cè)序，由于進(jìn)行的是PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，最初的50-70個(gè)堿基可能出現(xiàn)的錯(cuò)讀現(xiàn)象。因此，需要剔除首、尾各70個(gè)堿基序列，然后進(jìn)行對(duì)比。我們選擇中間的共計(jì)579個(gè)堿基的區(qū)域?yàn)榭尚艆^(qū)間(圖1中下劃線部分)，進(jìn)行比較。應(yīng)用DNAMAN序列比對(duì)軟件，將玉樹(shù)冬蟲(chóng)夏草、亞香棒蟲(chóng)草、北蟲(chóng)草的測(cè)序結(jié)果與 GenBank登錄的冬蟲(chóng)夏草(HM135169)的18S序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，玉樹(shù)冬蟲(chóng)夏草與冬蟲(chóng)夏草相應(yīng)序列的相似度均為100% ；亞香棒蟲(chóng)草與冬蟲(chóng)夏草18S序列的相似度為91. 39%, 北蟲(chóng)草的相似度為91. 74%。具體比對(duì)結(jié)果參照?qǐng)D2。本發(fā)明PCR擴(kuò)增引物對(duì)可以有效地鑒別冬蟲(chóng)夏草及其混淆品北蟲(chóng)草和亞香棒蟲(chóng)草。可以以適量的PCR擴(kuò)增引物對(duì)，添加進(jìn)行PCR的必要試劑，制備成PCR試劑盒，用于快速的冬蟲(chóng)夏草PCR擴(kuò)增鑒別。
權(quán)利要求
1.鑒別冬蟲(chóng)夏草真?zhèn)蔚腜CR引物對(duì)，其特征在于所述引物對(duì)的序列為 上游引物5’ CAATAAATACCGATACAGGGC 3’ ；下游引物5’ TGTCTGGACCTGGTGAGTTT 3，。
2.鑒別冬蟲(chóng)夏草真?zhèn)蔚腜CR試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求1所述的引物對(duì)。
3.鑒別冬蟲(chóng)夏草真?zhèn)蔚姆椒?，其特征在于該方法包括以下步驟a、獲取樣品總DNA；b、采用權(quán)利要求1所述的引物對(duì)在PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增；C、對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并與SEQ ID No. 3所示的序列比對(duì)，其中的與SEQ ID No. 6對(duì)應(yīng)部分100%符合者為真品，否則為偽品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于 步驟b所述的PCR擴(kuò)增的條件為預(yù)變性98 °C, Imin變性98 °C, IOsec退火60°C，20sec 30 cycles延伸72°C，30sec .延伸72 °C，5min 。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或所述的方法，其特征在于； 步驟b所述的PCR擴(kuò)增的體系為每 50μ IPCR 擴(kuò)增反應(yīng)體積中包含 13. 6μ 1 ddH20, 2XPhusion Master mix 25. 0 μ 1, 7. 4 μ 1 的 5MBetaine, 10 μ m/L 的上、下游引物各 1. 0 μ 1，DNA 模板 2. 0 μ 1。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥材鑒別領(lǐng)域，具體涉及冬蟲(chóng)夏草真?zhèn)蔚蔫b別。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種特異性的檢測(cè)鑒別冬蟲(chóng)夏草的可靠方法。本發(fā)明為了解決上述技術(shù)問(wèn)題所技術(shù)方案是提供一種鑒別冬蟲(chóng)夏草真?zhèn)蔚腜CR引物對(duì)、試劑盒及方法。引物對(duì)的序列為上游引物5’CAATAAATACCGATACAGGGC 3’；下游引物5’TGTC TGGACCTGGTGAGTTT 3’。本發(fā)明引物對(duì)能夠有效地?cái)U(kuò)增冬蟲(chóng)夏草及其常見(jiàn)贗品的目標(biāo)片段，并且能夠準(zhǔn)確地鑒別，具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102226217SQ201110147608
公開(kāi)日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2011年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月2日
發(fā)明者張雪峰, 徐麗 申請(qǐng)人:張雪峰