專利名稱：Vkorc1基因的第-1639位堿基的多態(tài)性檢測方法、以及用于該方法的核酸探針和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及VKORCl基因的第-1639位堿基的多態(tài)性檢測方法、以及用于該方法的核酸探針和試劑盒。
背景技術(shù)：
對于心肌梗塞、腦梗塞患者，廣泛使用華法林(warfarin)作為防止血液凝固的藥物。華法林的適用量根據(jù)人種而有大的差異，進(jìn)而，即便是相同人種，個(gè)體間也顯示出差異。 若過量投與華法林，則有可能發(fā)生例如鼻出血、皮膚內(nèi)出血，或者有時(shí)還會(huì)發(fā)生顱內(nèi)出血等副作用。因此，在治療中對各個(gè)患者分別確定華法林的適當(dāng)用量變得極為重要。在確定這樣的華法林的適用量值之際，近年來，有報(bào)道稱CYP2C9基因和VKORCl 基因的多態(tài)性關(guān)系到華法林的藥效(非專利文獻(xiàn)1、幻。CYP2C9基因是編碼用于制備華法林代謝酶的細(xì)胞色素P450的基因。VKORCl基因是編碼作用于維生素K的蛋白質(zhì)的基因， 該維生素K參與血液的凝固。因此，檢測出這兩種基因的多態(tài)性對于相應(yīng)于患者來確定華法林的適用量、并減少副作用而言也是非常重要的。另外，作為VKORCl基因的多態(tài)性，已知 1173C > T(rs9934438)、-1639G > A(rs9923231)等。這些 VKORCl 基因的多態(tài)性記載于非專利文獻(xiàn)3 5中。作為檢測堿基的多態(tài)性的方法，有PCR-RFLP法(聚合酶鏈_限制性長度多態(tài)性分析)(非專利文獻(xiàn)幻或利用焦磷酸測序(pyrosequencing)技術(shù)來檢測突變的方法(非專利文獻(xiàn)4)。然而，非專利文獻(xiàn)3的PCR-RFLP法需要花費(fèi)功夫和成本，例如在進(jìn)行DNA的提取純化和PCR后，需要對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制酶處理、進(jìn)行電泳等。另外，由于在進(jìn)行PCR后需要進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的處理，因此有擴(kuò)增產(chǎn)物混入下一反應(yīng)體系之虞，存在難以自動(dòng)化、無法同時(shí)檢測多個(gè)核酸序列的問題。非專利文獻(xiàn)4的焦磷酸測序是基于如下原理的，即，通過將核苷酸被引入DNA時(shí)所釋放的焦磷酸轉(zhuǎn)變成ATP來用于發(fā)光反應(yīng)，從而能夠定量有多少核苷酸被引入DNA中。實(shí)際上，是通過每次加入一種脫氧核糖核苷酸測定發(fā)光量后將之除去并重復(fù)進(jìn)行這種操作， 從而確定序列的。作為除去過剩核苷酸的方法，有固相化法，其將模板DNA結(jié)合到某些固相基質(zhì)上，通過用反應(yīng)液沖洗來除去過剩核苷酸；和液相法，其通過加入腺苷三磷酸雙磷酶 (apyrase)來分解核苷酸。雖然有自動(dòng)進(jìn)行這些繁雜作業(yè)的系統(tǒng)在售，但價(jià)格非常昂貴，需要成本。另外，存在必須進(jìn)行DNA的提取純化、前處理等，需要花費(fèi)功夫和成本的問題。另一方面，已知有通過PCR(聚合酶鏈反應(yīng))對包含突變的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增后，使用熒光染料標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行融解曲線分析，并基于融解曲線分析的結(jié)果來解析突變的方法(專利文獻(xiàn)1、幻。然而，在這些文獻(xiàn)中，關(guān)于探針的設(shè)計(jì)僅有如下教導(dǎo)，即，應(yīng)將探針設(shè)計(jì)成當(dāng)使末端部被熒光染料記的淬滅探針與目標(biāo)核酸雜交時(shí)，在末端部，探針-核酸雜交體的多個(gè)堿基對至少形成一個(gè)G-C對(pair)。
專利文獻(xiàn)3中記載有，使用5’末端熒光標(biāo)記的探針，通過融解曲線分析來同時(shí)檢測VKORCl 1173C > T (rs9934438)和CYP2C9*3的方法。但是，并沒有記載檢測 VK0RC1-1639G > A (rs9923231)的多態(tài)性的方法。另外，也沒有記載同時(shí)檢測VK0RC1-1639G > A(rs9923231)的多態(tài)性和CYP2C9*3突變位點(diǎn)的多態(tài)性的方法?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 日本特開2001-286300號公報(bào)專利文獻(xiàn)2 日本特開2002-11擬91號公報(bào)專利文獻(xiàn)3 國際公開公報(bào)W0/2008/117782非專利文獻(xiàn) 1 :Simone Rost et al. , Nature Vol. 427 20041etters to nature2 :Mark J. Rieder et al. ， The New England Journal of Medicine 352 ；22，2005非專利文獻(xiàn)3 :TDM 研究 Vol. 25 No. 4(2008) 141-144非專利文獻(xiàn)4 :BL00D，1 SEPTEMBER 2007 VOLUME 110，NUMBER 5非專利文獻(xiàn)5 =Genet Med. 2008 Feb ； 10 (2) :89-98發(fā)明內(nèi)容。發(fā)明要解決的問題本發(fā)明的課題在于確立一種能有效地檢測VK0RC1基因的第-1639位堿基的多態(tài)性的淬滅探針，并提供一種檢測VK0RC1基因的第-1639位堿基的多態(tài)性的方法，以及用于該方法的試劑盒。用于解決問題的方案本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過基于VK0RC1基因的包含第-1639位堿基的多態(tài)性的特定區(qū)域設(shè)計(jì)淬滅探針，并進(jìn)行使用該淬滅探針的融解曲線分析，從而能夠檢測出該突變，至此完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明如下所述。(1) 一種多態(tài)性檢測用探針，其特征在于，其為用于檢測VK0RC1基因的第-1639位堿基的多態(tài)性的探針，所述探針由寡核苷酸構(gòu)成，該寡核苷酸為序列號1或序列號2所示的堿基序列中包含堿基序號80 89的10 50個(gè)堿基長度的堿基序列，該寡核苷酸除了對應(yīng)于序列號1或序列號2中第80號堿基的堿基為胞嘧啶以外與序列號1或序列號2具有同源性，且對應(yīng)于堿基序號80的堿基被熒光染料標(biāo)記。(2)根據(jù)(1)所述的多態(tài)性檢測用探針，所述寡核苷酸中，在從5’末端數(shù)起第1 3號位置具有被熒光染料標(biāo)記的對應(yīng)于堿基序號80的堿基。(3)根據(jù)(1)所述的多態(tài)性檢測用探針，所述寡核苷酸在5’末端具有被熒光染料標(biāo)記的對應(yīng)于堿基序號80的堿基。(4)根據(jù)(1) C3)任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針，所述寡核苷酸當(dāng)未與目標(biāo)序列雜交時(shí)發(fā)出熒光，且當(dāng)與目標(biāo)序列雜交時(shí)熒光強(qiáng)度減少或增加。(5)根據(jù)(4)所述的多態(tài)性檢測用探針，所述寡核苷酸當(dāng)未與目標(biāo)序列雜交時(shí)發(fā)出熒光，且當(dāng)與目標(biāo)序列雜交時(shí)熒光強(qiáng)度減少。(6)根據(jù)⑴ (5)任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針，所述寡核苷酸的堿基長度為10 40。 (7)根據(jù)⑴ (6)任一項(xiàng)臓的多態(tài)性檢測用探針，臓寡核苷酸的藤長度為15 30。(8)根據(jù)⑴ (7)任一項(xiàng)腿的多態(tài)性檢測用探針，腿寡核苷酸的 藤長度為15 25。(9)根據(jù)⑴ (8)任一項(xiàng)臓的多態(tài)性檢測用探針，戶腦探針是融解曲線分析用的探針。(10)根據(jù)⑴ (9)任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針，所述寡核苷酸以序列號6表示。(11) 一種多態(tài)性檢測方法，其為使用(1) (10)任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針來檢測VKORCl基因附近區(qū)域的多態(tài)性的方法。(12)根據(jù)(11)所述的多態(tài)性檢測方法，該方法包括(I)使(1) (10)任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針和試樣中的單鏈核酸接觸，從而使所述熒光標(biāo)記寡核苷酸和所述單鏈核酸進(jìn)行雜交來獲得雜交產(chǎn)物的步驟；(II)通過改變包含所述雜交產(chǎn)物的試樣的溫度，從而使所述雜交產(chǎn)物解離，并測定基于所述雜交產(chǎn)物的解離的、熒光信號的變動(dòng)的步驟；(III)基于所述信號的變動(dòng)來確定雜交產(chǎn)物的解離溫度、即Tm值的步驟；以及(IV)基于所述Tm值，確定VKORCl基因中的多態(tài)性的存在或者具有多態(tài)性的核酸的存在比的步驟。(13)根據(jù)(12)所述的多態(tài)性檢測方法，該方法還包括在所述步驟⑴之前或與所述步驟(I)同時(shí)進(jìn)行核酸的擴(kuò)增的步驟。(14) 一種判斷華法林的適用量的方法，該方法包括通過(11) (13)任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測方法來檢測VKORCl基因附近區(qū)域的多態(tài)性的步驟；以及，基于所檢測出的多態(tài)性的有無來判斷華法林的適用量的步驟。(15) 一種多態(tài)性檢測用試劑盒，其包含(1) (10)任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針。(16)根據(jù)(15)所述的多態(tài)性檢測用試劑盒，還包含能夠以序列號1所示堿基序列中包含所述寡核苷酸所雜交的序列的區(qū)域?yàn)槟０暹M(jìn)行擴(kuò)增的引物。(17)根據(jù)(16)所述的多態(tài)性檢測用試劑盒，所述引物是序列號3和4所記載的引物。(18)根據(jù)(16)或(17)所述的多態(tài)性檢測用試劑盒，還包含序列號8、9所記載的引物和序列號10所記載的探針。另外，上述說明中，所謂VKORCl基因的多態(tài)性還包括該基因的附近區(qū)域的多態(tài)性。發(fā)明的效果通過在基因擴(kuò)增體系中添加本發(fā)明的探針，在PCR反應(yīng)結(jié)束后僅進(jìn)行融解曲線分析(Tm解析)就能進(jìn)行多個(gè)基因突變型的分型。進(jìn)而，由于能夠直接檢查全血、口腔粘膜懸浮液，因此能夠減少所花費(fèi)的功夫、成本。本發(fā)明的探針特異性高，檢測靈敏度高。通過使用本發(fā)明的方法，在進(jìn)行PCR的情況下，也無需取出擴(kuò)增產(chǎn)物，因此幾乎不存在污染(contamination)的危險(xiǎn)。另外，本發(fā)明的方法由于裝置簡單，因此容易自動(dòng)化。通過本發(fā)明的方法，還能夠同時(shí)檢測VKORCl基因的第-1639位堿基的多態(tài)性和 CYP2C9*3突變位點(diǎn)的多態(tài)性。


圖1示出了 實(shí)施例1的人基因組1和人基因組2 (純化基因組)的Tm分析中，每單位時(shí)間的TAMRA(VK0RC1探針1)的熒光強(qiáng)度變化量(d熒光強(qiáng)度增加量/t)的變化。縱軸為每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化量(d熒光強(qiáng)度增加量/t)，橫軸為溫度(°C )。圖2示出了 實(shí)施例2的人基因組1和人基因組2 (全血)的Tm分析中，每單位時(shí)間的TAMRA(VK0RC1探針1)的熒光強(qiáng)度變化量(d熒光強(qiáng)度增加量/t)的變化。縱軸為每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化量(d熒光強(qiáng)度增加量/t)，橫軸為溫度(°C )。圖3示出了 比較例的人基因組1和人基因組2(純化基因組)的Tm分析中，每單位時(shí)間的TAMRA(VK0RC1探針幻的熒光強(qiáng)度變化量(d熒光強(qiáng)度增加量/t)的變化?？v軸為每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化量(d熒光強(qiáng)度增加量/t)，橫軸為溫度(°C )。圖4示出了 實(shí)施例3的人基因組1和人基因組2 (純化基因組)的Tm分析中，每單位時(shí)間的TAMRA(VK0RC1探針1)的熒光強(qiáng)度變化量(d熒光強(qiáng)度增加量/t)的變化?？v軸為每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化量(d熒光強(qiáng)度增加量/t)，橫軸為溫度(°C )。圖5示出了 實(shí)施例3的人基因組1和人基因組2 (純化基因組)的Tm分析中，每單位時(shí)間的BODIPY FL(CYP2C9*3探針1)的熒光強(qiáng)度變化量(d熒光強(qiáng)度增加量/t)的變化?？v軸為每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化量(d熒光強(qiáng)度增加量/t)，橫軸為溫度(V)。圖6示出了 實(shí)施例4的人基因組1和人基因組2 (全血)的Tm分析中，每單位時(shí)間的TAMRA(VK0RC1探針1)的熒光強(qiáng)度變化量(d熒光強(qiáng)度增加量/t)的變化?？v軸為每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化量(d熒光強(qiáng)度增加量/t)，橫軸為溫度(°C )。圖7示出了 實(shí)施例4的人基因組1和人基因組2(全血)的Tm分析中，每單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化量(d熒光強(qiáng)度增加量/t)的變化?？v軸為每單位時(shí)間的BODIPY FL(CYP2C9*3探針1)的熒光強(qiáng)度變化量(d熒光強(qiáng)度增加量/t)，橫軸為溫度(°C )。
具體實(shí)施例方式<1>本發(fā)明探針和本發(fā)明檢測方法本發(fā)明探針的特征在于，其為用于檢測VKORCl基因的第-1639位堿基的多態(tài)性的探針，所述探針由寡核苷酸構(gòu)成，該寡核苷酸為序列號1或序列號2所示的堿基序列中包含堿基序號80 89的10 50個(gè)堿基長度的堿基序列，該寡核苷酸除了對應(yīng)于序列號1或序列號2中第80號堿基的堿基為胞嘧啶以外與序列號1或序列號2具有同源性，且對應(yīng)于堿基序號80的堿基被熒光染料標(biāo)記。此處，VKORCl基因的第-1639位堿基是序列號1和2 中的第88位堿基。本發(fā)明的探針，除了具有序列號1所示的堿基序列(VK0RC1基因的、第-1639位堿基具有野生型堿基的序列)或序列號2所示的堿基序列(VK0RC1基因的、第-1639位堿基具有突變型(多態(tài)性)堿基的序列)中上述特定的序列之外，與專利文獻(xiàn)1、2中記載的淬滅探針同樣地制造。另外，本發(fā)明的序列號1所示的序列是基因銀行(GeneBank)的登錄號NG_011564的第3501號到3680號。本發(fā)明探針的長度為10 50個(gè)堿基長度，優(yōu)選為 10 40個(gè)堿基長度，更優(yōu)選為15 30個(gè)堿基長度，最優(yōu)選15 25個(gè)堿基長度。作為本發(fā)明中使用的探針的堿基序列的實(shí)例，可以舉出5' -cattggccrggtgcggt-3'(序列號5)。序列中，“r”表示a或g。更優(yōu)選為5' -cattggccaggtgcggt-3 ‘(序列號 6)。作為熒光染料，可以使用專利文獻(xiàn)1、2中記載的熒光染料，作為具體實(shí)例，可以舉出Pacific Blue (商標(biāo))、FAM(商標(biāo))、TAMRA(商標(biāo))、B0DIPY(商標(biāo))FL等。熒光染料向寡核苷酸結(jié)合的方法可以是通常的方法，例如可以按照專利文獻(xiàn)1、2中記載的方法來進(jìn)行。本申請中的“同源性”是指在特定的堿基序列中具有與堿基序列有80%以上、更優(yōu)選90%以上、最優(yōu)選95%以上同源性的序列的堿基序列。即，本發(fā)明的探針，是與序列號 1或序列號2所示堿基序列中包含堿基序號80 89的10 50個(gè)堿基長度的堿基序列相同的序列，還可以是并不完全相同，而僅有5個(gè)堿基、4個(gè)堿基、3個(gè)堿基、2個(gè)堿基或1個(gè)堿基不同。本發(fā)明的探針優(yōu)選當(dāng)其與目標(biāo)序列雜交時(shí)，熒光染料的熒光減少或增加。本發(fā)明的探針優(yōu)選為當(dāng)其與目標(biāo)序列雜交時(shí)，熒光染料的熒光淬滅的淬滅探針。另外，本發(fā)明的探針優(yōu)選5’末端或3’末端被熒光染料標(biāo)記。另外，本說明書中，“從5’末端數(shù)起第1 3號”的情況下，是將5’末端數(shù)為第一位；“從3’末端數(shù)起第1 3號”的情況下，是將3’末端數(shù)為第一位。如本實(shí)施例的表2所示，通過使用序列號6的寡核苷酸，能夠檢測VKORC 1基因的第-1639位堿基的多態(tài)性。本發(fā)明的檢測方法的特征在于，其為對于VKORCl基因的具有第-1639位堿基的多態(tài)性位點(diǎn)的核酸，通過使用被熒光染料標(biāo)記的核酸探針測定熒光染料的熒光來進(jìn)行融解曲線分析，并基于融解曲線分析結(jié)果來檢測多態(tài)性的方法，所述核酸探針是本發(fā)明的探針。本發(fā)明的檢測方法除了對VKORC 1基因的包含第-1639位堿基的多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增、以及使用本發(fā)明探針以外，其他可以按照通常的核酸擴(kuò)增和融解曲線分析(Tm 分析)方法來進(jìn)行。本發(fā)明的檢測方法的特征在于，優(yōu)選使用本發(fā)明的探針，并包含以下步驟(I)向包含DNA的試樣中添加本發(fā)明的探針，使所述探針雜交到所述DNA上的步驟；(II)通過改變溫度而使所述DNA與所述探針的雜交產(chǎn)物解離，并測定基于雜交產(chǎn)物的解離的、熒光信號的變動(dòng)的步驟；(III)對所述信號的變動(dòng)進(jìn)行解析，從而確定Tm值的步驟；以及(IV)由所述Tm值，確定目標(biāo)多態(tài)性的有無或者具有多態(tài)性的堿基序列的存在比的步驟。本發(fā)明的檢測方法，除了使用本發(fā)明探針以外，其他可以按照通常的核酸擴(kuò)增和融解曲線分析(Tm分析)方法來進(jìn)行。另外，本發(fā)明的檢測方法還可以包括在所述步驟 (I)之前或與所述步驟(I)同時(shí)進(jìn)行核酸的擴(kuò)增的步驟。作為核酸擴(kuò)增的方法，優(yōu)選為使用聚合酶的方法，作為其實(shí)例，可以列舉PCR、 ICAN(等溫的和嵌合引物起始的核酸擴(kuò)增)、LAMP(環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增)等。在通過使用聚合酶的方法來進(jìn)行擴(kuò)增的情況下，優(yōu)選在本發(fā)明探針的存在下進(jìn)行擴(kuò)增。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，相應(yīng)于所使用的探針而調(diào)節(jié)擴(kuò)增反應(yīng)條件等是容易實(shí)現(xiàn)的。由此，在核酸擴(kuò)增后僅進(jìn)行探針的Tm值解析，因此無需在反應(yīng)結(jié)束后對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行處理。因此，無需擔(dān)心擴(kuò)增產(chǎn)物導(dǎo)致的污染。另外，由于能用與擴(kuò)增所需的機(jī)器同一機(jī)器來進(jìn)行檢測，因此甚至無需移動(dòng)容器。因此，自動(dòng)化也容易實(shí)現(xiàn)。在本發(fā)明中，試樣中的DNA可以是單鏈DNA，也可以是雙鏈DNA。在所述DNA為雙鏈DNA的情況下，優(yōu)選例如在進(jìn)行前述雜交步驟之前，包含通過加熱而將所述試樣中的雙鏈DNA解離的步驟。通過將雙鏈DNA解離成單鏈DNA，在接下來的雜交步驟中能夠與檢測用探針雜交。在本發(fā)明中，本發(fā)明的探針相對于所述試樣中的DNA的添加比例(摩爾比)不受限制，但從充分確保檢測信號的角度考慮，優(yōu)選相對于試樣中的DNA為1倍以下，更優(yōu)選為 0. 3倍以下。此時(shí)，所謂試樣中的DNA是指例如，可以是發(fā)生了檢測目標(biāo)多態(tài)性的檢測對象DNA和未發(fā)生所述多態(tài)性的非檢測對象DNA的總計(jì)量，也可以是包含發(fā)生了檢測目標(biāo)多態(tài)性的檢測對象序列的擴(kuò)增產(chǎn)物和包含未發(fā)生所述多態(tài)性的非檢測對象序列的擴(kuò)增產(chǎn)物的總計(jì)量。另外，試樣中的DNA中的前述檢測對象DNA的含量通常是不清楚的，但從結(jié)果來看，優(yōu)選前述探針的添加比例(摩爾比)相對于檢測對象DNA (包含檢測對象序列的擴(kuò)增產(chǎn)物)為100倍以下，更有選為50倍以下，進(jìn)一步優(yōu)選為30倍以下。另外，其下限沒有特別限制，例如為0. 001倍以上，優(yōu)選為0. 01倍以上，更優(yōu)選為0. 2倍以上。本發(fā)明的探針相對于前述DNA的添加比例，例如可以是相對于雙鏈DNA的摩爾比， 也可以是相對于單鏈DNA的摩爾比。接下來，對于Tm值進(jìn)行說明。當(dāng)持續(xù)加熱包含雙鏈DNA的溶液，^Onm下的吸光度上升。其原因在于，雙鏈DNA中的雙鏈間的氫鍵通過加熱而解開，解離成單鏈DNA(DNA的融解)的緣故。另外，如果全部雙鏈DNA解離而成為單鏈DNA的話，其吸光度顯示為開始加熱時(shí)的吸光度(僅有雙鏈DNA時(shí)的吸光度)的約1.5倍左右，由此可以判斷解離完成?；谠摤F(xiàn)象，所謂融解溫度Tm被定義為通常是吸光度達(dá)到吸光度總上升量的50%時(shí)的溫度。本發(fā)明中，為了確定Tm值而進(jìn)行的、伴隨溫度變化的信號變動(dòng)的測定，也可以根據(jù)前述的原理來通過測定260nm的吸光度來進(jìn)行。但，優(yōu)選測定基于附加在本發(fā)明探針上的標(biāo)記的信號的、相應(yīng)于DNA與探針的雜交形成狀態(tài)而變動(dòng)的信號。因此，作為本發(fā)明的探針，優(yōu)選使用前述標(biāo)記探針。作為前述標(biāo)記探針，例如可以列舉當(dāng)未與目標(biāo)序列雜交時(shí)發(fā)出熒光、且當(dāng)與目標(biāo)序列雜交時(shí)熒光強(qiáng)度減少(淬滅)的熒光標(biāo)記寡核苷酸探針；或者，當(dāng)未與目標(biāo)序列雜交時(shí)發(fā)出熒光、且當(dāng)與目標(biāo)序列雜交時(shí)熒光強(qiáng)度增加的熒光標(biāo)記寡核苷酸探針。如果是前一種探針，則在與檢測對象序列形成雜交體(雙鏈DNA)時(shí)，不顯示信號或信號弱；通過加熱而探針游離的話，顯示信號或信號增加。另外，如果是后一種探針，則通過與檢測對象序列形成雜交體(雙鏈DNA)而顯示信號；通過加熱而探針游離的話，信號減少 (消失)。因此，通過用信號特有的條件(吸光度等)來檢測基于該標(biāo)記的信號變化，能夠與前述測定260nm的吸光度相同地，確定融解的進(jìn)行狀況和確定Tm值。標(biāo)記探針中的標(biāo)記物例如如前所述，優(yōu)選為熒光染料標(biāo)記探針。作為進(jìn)行核酸擴(kuò)增時(shí)成為模板的核酸，只要包含核酸即可，并沒有特殊限定，是來源于或能夠來源于血液、口腔粘膜懸浮液、指甲或毛發(fā)等的體細(xì)胞、生殖細(xì)胞、乳、腹水、石蠟包埋組織、胃液、胃洗滌液、腹膜液、羊水、細(xì)胞培養(yǎng)等任意生物學(xué)起源的核酸。成為模板的核酸，可以從該起源獲得后原樣直接使用，或?yàn)榱烁淖冊摌悠返奶匦远M(jìn)行前處理后使用。
下面，以使用PCR的情況為例進(jìn)一步說明。作為用于PCR的引物對，除了設(shè)計(jì)成能夠擴(kuò)增出本發(fā)明探針能雜交的區(qū)域以外，其他可與通常的PCR中的引物對的設(shè)定方法同樣地設(shè)定。引物的長度和Tm值通常為12mer 40mer、40 70°C，優(yōu)選為16mer 30mer、 55 60°C。引物對的各引物的長度也可不同，但優(yōu)選兩個(gè)引物的Tm大致相同(通常，相差 2°C以內(nèi))。另外，Tm值是通過最近鄰堿基對(Nearest Neighbor)法算出的值。作為引物對的實(shí)例，可以列舉由具有序列號3、4所示堿基序列的引物構(gòu)成的引物對。PCR優(yōu)選在本發(fā)明中使用的本發(fā)明探針的存在下進(jìn)行。由此，在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后無需進(jìn)行處理擴(kuò)增產(chǎn)物的操作就可進(jìn)行Tm分析。相應(yīng)于所使用的探針而調(diào)節(jié)引物的Tm值、 PCR的反應(yīng)條件，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是容易實(shí)現(xiàn)的。如列舉代表性的PCR反應(yīng)液的組成的話，如下所述。表 權(quán)利要求
1.一種多態(tài)性檢測用探針，其特征在于，其為用于檢測VKORCl基因的第-1639位堿基的多態(tài)性的探針，所述探針由寡核苷酸構(gòu)成，該寡核苷酸為序列號1或序列號2所示的堿基序列中包含堿基序號80 89的10 50個(gè)堿基長度的堿基序列，該寡核苷酸除了對應(yīng)于序列號1或序列號2中第80號堿基的堿基為胞嘧啶以外與序列號1或序列號2具有同源性，且對應(yīng)于堿基序號80的堿基被熒光染料標(biāo)記。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，所述寡核苷酸中，在從5’末端數(shù)起第 1 3號位置具有被熒光染料標(biāo)記的對應(yīng)于堿基序號80的堿基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，所述寡核苷酸在5’末端具有被熒光染料標(biāo)記的對應(yīng)于堿基序號80的堿基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針，所述寡核苷酸當(dāng)未與目標(biāo)序列雜交時(shí)發(fā)出熒光，且當(dāng)與目標(biāo)序列雜交時(shí)熒光強(qiáng)度減少或增加。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的多態(tài)性檢測用探針，所述寡核苷酸當(dāng)未與目標(biāo)序列雜交時(shí)發(fā)出熒光，且當(dāng)與目標(biāo)序列雜交時(shí)熒光強(qiáng)度減少。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針，所述寡核苷酸的堿基長度為 10 40。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針，所述寡核苷酸的堿基長度為 15 30。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針，所述寡核苷酸的堿基長度為 15 邪。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 8任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針，所述探針是融解曲線分析用的探針。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 9任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針，所述寡核苷酸以序列號6表7J\ ο
11.一種多態(tài)性檢測方法，其為使用權(quán)利要求1 10任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針來檢測VKORCl基因附近區(qū)域的多態(tài)性的方法。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的多態(tài)性檢測方法，該方法包括(I)使權(quán)利要求1 10任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針和試樣中的單鏈核酸接觸，從而使所述熒光標(biāo)記寡核苷酸和所述單鏈核酸進(jìn)行雜交來獲得雜交產(chǎn)物的步驟；(II)通過改變包含所述雜交產(chǎn)物的試樣的溫度，從而使所述雜交產(chǎn)物解離，并測定基于所述雜交產(chǎn)物的解離的、熒光信號的變動(dòng)的步驟；(III)基于所述信號的變動(dòng)來確定雜交產(chǎn)物的解離溫度、即Tm值的步驟；以及(IV)基于所述Tm值，確定VKORCl基因中的多態(tài)性的存在或者具有多態(tài)性的核酸的存在比的步驟。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的多態(tài)性檢測方法，該方法還包括在所述步驟(I)之前或與所述步驟(I)同時(shí)進(jìn)行核酸的擴(kuò)增的步驟。
14.一種判斷華法林的適用量的方法，該方法包括通過權(quán)利要求11 13任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測方法來檢測VKORCl基因附近區(qū)域的多態(tài)性的步驟；以及，基于所檢測出的多態(tài)性的有無來判斷華法林的適用量的步驟。
15.一種多態(tài)性檢測用試劑盒，其包含權(quán)利要求1 10任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的多態(tài)性檢測用試劑盒，還包含能夠以序列號1所示堿基序列中包含所述寡核苷酸所雜交的序列的區(qū)域?yàn)槟０暹M(jìn)行擴(kuò)增的引物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的多態(tài)性檢測用試劑盒，所述引物是序列號3和4所記載的引物。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17所述的多態(tài)性檢測用試劑盒，還包含序列號8、9所記載的引物和序列號10所記載的探針。
全文摘要
[課題]確立一種能有效地檢測VKORC1基因的第-1639位堿基的多態(tài)性的淬滅探針，并提供一種檢測VKORC1基因的第-1639位堿基的多態(tài)性的方法，以及用于該方法的試劑盒。[解決手段]一種多態(tài)性檢測用探針，其特征在于，其為用于檢測VKORC1基因的第-1639位的多態(tài)性的探針，所述探針由寡核苷酸構(gòu)成，該寡核苷酸為序列號1或序列號2所示的堿基序列中包含堿基序號80～89的10～50個(gè)堿基長度的堿基序列，該寡核苷酸除了對應(yīng)于序列號1或序列號2中第80號堿基的堿基為胞嘧啶以外與序列號1或序列號2具有同源性，且對應(yīng)于堿基序號80的堿基被熒光染料標(biāo)記。
文檔編號C12Q1/68GK102268476SQ20111014710
公開日2011年12月7日 申請日期2011年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月1日
發(fā)明者小森真理子 申請人:愛科來株式會(huì)社