專利名稱：一種結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變的檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及耐藥突變的檢測(cè)技術(shù)，特別涉及一種基于雙標(biāo)記自淬滅探針的探針熔解曲線分析技術(shù)用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病。結(jié)核菌可能侵入人體全身各種器官，但主要侵犯肺臟，稱為肺結(jié)核病。到20世紀(jì)80年代后期，由于貧困、艾滋病、人口流動(dòng)和耐藥等因素，結(jié)核病發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)出現(xiàn)快速回升，成為與艾滋病并列的全球性危害最嚴(yán)重的傳染病。結(jié)核分枝桿菌耐藥情況嚴(yán)重，耐藥率高達(dá)46%，給結(jié)核病的預(yù)防和治療構(gòu)成嚴(yán)峻挑戰(zhàn)?？菇Y(jié)核藥物是結(jié)核病化學(xué)治療的基礎(chǔ)，而結(jié)核病的化學(xué)治療是人類控制結(jié)核病的主要手段。鏈霉素發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)40年代，是最早出現(xiàn)的有效抗結(jié)核藥物，也是治療結(jié)核病的一線藥物之一(1、李志忠，高全金.鏈霉素在當(dāng)今抗結(jié)核中的地位[J]中國(guó)誤診學(xué)雜志， 2002.2(1) :62-63)。鏈霉素是一種氨基環(huán)醇糖苷類抗生素，主要作用于結(jié)核分枝桿菌的核糖體，與結(jié)核分枝桿菌的核糖體30S亞單位結(jié)合，誘導(dǎo)遺傳密碼的錯(cuò)配，抑制mRNA翻譯的開(kāi)始，干擾翻譯過(guò)程中的校對(duì)，從而抑制蛋白質(zhì)的合成。鏈霉素經(jīng)常單獨(dú)給藥，因此其耐藥性發(fā)展較快。結(jié)核分枝桿菌耐鏈霉素的主要分子機(jī)制是編碼小亞基的S12蛋白的rpsL基因和編碼16S核糖體RNA的rrs基因突變，從而抑制藥物結(jié)合核糖體的能力，造成對(duì)鏈霉素耐藥 (2、張晨鈺，梁建琴.結(jié)核分枝桿菌耐藥分子機(jī)制的研究進(jìn)展[J]中國(guó)誤診學(xué)雜志.2006， 6(17) =3303-3305)。結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥性的檢測(cè)對(duì)于控制耐藥性結(jié)核分枝桿菌的傳播以及控制結(jié)核病有極其重要的意義。目前臨床上采用的耐藥檢測(cè)方法可分為表型檢測(cè)和基因型檢測(cè)兩類，并以前者為主(3、Heifets L. Rapid automated methods(BACTEC System)in clinical mycobacteriology[J]Semin Respir Infect, 1986. 1(4) :242-249)。然而表型檢測(cè)因?yàn)楦鞣N原因，如耗時(shí)、設(shè)備昂貴、有放射性危害或干擾因素多等，難以形成快速高效的篩查手段。相對(duì)而言，基因檢測(cè)更為直接，目前已經(jīng)使用的基因分析方法有單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法(SSCP)，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法(RFLP)，DNA測(cè)序法，線性探針雜交法(4、 Mokrousov I. Multicenter evaluation of reverse line blot assay for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates[J].J Microbiol Methods，2004. 57(3) :323-335)，RNA/RNA 錯(cuò)配分析法，以及 DNA 陣列(芯片)檢測(cè)等(5.Wu X.Detection of streptomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates using four molecular methods in China[J]. Yi Chuan Xue Bao,2006. 33(7) 655-663)。這些方法雖然檢出率和通量高低不同，但共同缺點(diǎn)是需要進(jìn)行PCR后處理，不僅影響了檢測(cè)效率，易引起擴(kuò)增產(chǎn)物污染，而且增加了操作難度，提高了對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)將擴(kuò)增和檢測(cè)兩步驟合一，具有快速、特異、靈敏、定量等優(yōu)點(diǎn)，已在病原微生物檢測(cè)和突變檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，近年來(lái)在結(jié)核菌耐藥檢測(cè)上的應(yīng)用也引起人們極大興趣(6>El-Hajj H. Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis in a single tube with molecular beacons[J]. J Clin Microbiol,2001.39(11) 4131-4137)。熒光PCR技術(shù)則是在普通PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，在擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入一對(duì)特異性引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針，使用實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的熒光PCR檢測(cè)儀來(lái)檢測(cè)靶核苷酸序列的技術(shù)。除了具有普通PCR的優(yōu)點(diǎn)外，它還具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)特異性更強(qiáng)，靈敏度更高。由于多使用了一條可與模板互補(bǔ)配對(duì)的熒光探針，提高了特異性，并且由自動(dòng)化儀器收集熒光信號(hào)，避免了人工判斷的主觀性，又可進(jìn)一步提高靈敏度。(2)全封閉反應(yīng)，在線式實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光，無(wú)需PCR產(chǎn)物的后處理，避免污染，保證了結(jié)果的可靠性。(3)可實(shí)現(xiàn)單管雙重檢測(cè)，降低成本。(4)不接觸有毒試劑，操作安全。( 根據(jù)探針與靶序列雜交的特異性以及與不完全匹配靶序列雜交的Tm值差異，可以利用熔解曲線區(qū)分野生與突變，結(jié)果容易判讀。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種有效提高靈敏度及特異性、操作簡(jiǎn)便、周期短的結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變的檢測(cè)方法，即一種基于雙標(biāo)記自淬滅探針的探針熔解曲線分析技術(shù)。本發(fā)明的另一目的在于提供一種結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變的檢測(cè)方法的試劑盒。所述結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變的檢測(cè)方法包括以下步驟1)根據(jù)結(jié)核分枝桿菌全序列和結(jié)核分枝桿菌基因組rpsL和rrs基因序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件I^rimer Premier 5設(shè)計(jì)引物和探針；2)提取結(jié)核分枝桿菌樣本的DNA ；3)構(gòu)建PCR反應(yīng)體系；4)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及熔解曲線分析將步驟2)提取的DNA加入步驟3)的PCR反應(yīng)體系中，設(shè)陰性對(duì)照、空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及熔解曲線分析，將待測(cè)樣本反應(yīng)管所得熔解曲線與陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)管所得熔解曲線的Tm值進(jìn)行比較，判斷出待測(cè)樣本中 rpsL及rrs基因上耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)是否發(fā)生突變，從而判斷樣本耐藥情況。在步驟1)中，所述設(shè)計(jì)引物和探針的具體方法為a，引物設(shè)計(jì)在所檢測(cè)的突變兩端，探針覆蓋突變位點(diǎn)；b，探針的熒光基團(tuán)可選擇FAM、R0X、HEX、CY5、TET、CAL-Fluor等任意一種，淬滅基團(tuán)可選擇BHQ、Dabcyl等，并且探針可以進(jìn)行各種類型的修飾(如LNA標(biāo)記)等。所述引物和探針的具體序列可為
引物 rpsL43F5'-CAGCCCGCAGCGTCGTGGTGT-3‘
引物 rpsL43R5'-GTGGCCCTCGCCGGGAA-3‘
引物 rpsL88F5'-GCACTCGATGGTGCTGGTGC-3 ‘
引物 rpsL88R5'-CGTGCCTGTTTGCGGTTCTT-3‘
引物 rrs512F5'-ACCTCTTTCACCATCGACGAAGGTCC-3
引物 rrs512R5'-GTTAAGCCGTGAGATTTCACGAACAA-3
引物 rrs904F5'-GGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTG-3‘
引物 rrs904R5'-GCATGTCAAACCCAGGTAAGGTTC-3‘
探針 rpsL43P5'-FAM-CCGCGCCACTCCGAAGAAGCCGAACTCCGCGG-Dabcyl-3'
探針 rpsL88P5'-TET-CCGTCCGGGTGAAGGACCTGCCTGACGG-Dabcyl-3'
探針 rrs512P5'-FAM-CGCACCCAGCAGCCGCGGTAATACGTGCG-Dabcyl-3'
探針 rrs904P5'-TET-CCGCGGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGCGCGG-Dabcyl-3'
在步驟幻中，所述PCR反應(yīng)體系可為一種是rpsL體系，用來(lái)檢測(cè)rpsL基因相關(guān)
耐藥突變(rpsL密碼子43和rpsL密碼子88)，另一種是rrs體系，用來(lái)檢測(cè)rrs基因相關(guān)耐藥突變(rrs512環(huán)區(qū)和rrs904環(huán)區(qū))，反應(yīng)液每份為20 μ 1，每份反應(yīng)液中含下列組分rpsL 體系1XPCR Buffer [IOmM Tris-HCl, 50mM KC1,50% (v/v)甘油]，dATP、 dCTP、dGTP 各 200 μ Μ、dUTP 400 μ Μ, MgCl2ImM,引物 rpsL43R 和 rpsL88R 各 0. 6 μ M，引物 rpsL43F 和 rpsL88F 各 0. 06 μ Μ,探針 rpsL43P 和 rpsL88P 各 0. 06 μ Μ, Taq DNA 聚合酶 2U， UNG 酶 0. OlU ；rrs 體系1XPCR Buffer [1 Ommol/L Tris, 50mmol/L KC1,50 % (v/v)甘油]， dATP、dCTP、dGTP 各 200 μ Μ、dUTP 400 μ Μ, MgCl23mM，引物 rrs512R 和 rrs904R 各 0· 6 μ M， 引物 rrs512F 和 rrs904F 各 0. 06 μ Μ、探針 rrs512P 和 rrs904P 各 0. 06 μ Μ, Taq DNA 聚合酶 2U，UNG 酶 0. 01U。有經(jīng)驗(yàn)的人也選擇其它類型的buffer，或者通過(guò)優(yōu)化找到更為合適的buffer類型。在步驟4)中，所述 PCR 擴(kuò)增的條件為50 V 2min，95 V IOmin ；95 V 10s、 70 °C 20s (每個(gè)循環(huán)降低1°C )、75°C 20s構(gòu)成一個(gè)touchdown循環(huán)(共進(jìn)行10個(gè)循環(huán))； 950C 108、601208(熒光數(shù)據(jù)采集)、751208構(gòu)成一個(gè)循環(huán)(共進(jìn)行30個(gè)循環(huán))；之后是熔解分析步驟，95°C 2min、40°C 2min、40°C 80°C每0. 5°C采集熒光。所述結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變的檢測(cè)方法的試劑盒設(shè)有盒體、擴(kuò)增試劑(包括STRPCR Mix A、STR PCR Mix B和TB酶混合液)、TB DNA提取液、TB陰性對(duì)照和STR陽(yáng)性對(duì)照；所述擴(kuò)增試劑(包括STR PCR Mix A、STR PCR Mix B和TB酶混合液)、TB DNA提取液、TB陰性對(duì)照和STR陽(yáng)性對(duì)照放置在盒體內(nèi)。所述STR PCR Mix A 包括 IXPCR Buffer (IOmM Tris-HCl, 50mM KC1,50% (v/v) 甘油)，dATP、dCTP、dGTP 各 200 μ Μ、dUTP 400 μ Μ, MgCl2ImM,引物 rpsL43R 和 rpsL88R 各 0. 6 μ M，引物 rpsL43F 和 rpsL88F 各 0. 06 μ Μ,探針 rpsL43P 和 rpsL88P 各 0. 06 μ Μ。所述STR PCR Mix B 包括 IXPCR Buffer (IOmM Tris,50mM KC1,50% (v/v)甘油)， dATP、dCTP、dGTP 各 200 μ Μ、dUTP 400 μ Μ, MgCl23mM，引物 rrs512R 和 rrs904R 各 0· 6 μ M， 引物 rrs512F 和 rrs904F 各 0. 06 μ Μ,探針 rrs512P 和 rrs904P 各 0. 06 μ Μ。所述TB酶混合液包括2U Taq, 0. OlU UNG。所述STR陽(yáng)性對(duì)照為STR野生型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。所述TB陰性對(duì)照可以為TB DNA提取液，也可以為H20、Tris或生理鹽水等。所述TB DNA提取液的成分為乙二胺四乙酸二鈉、Tris和TritonX_100。所述結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變的檢測(cè)方法的試劑盒檢驗(yàn)標(biāo)本的方法包括以下步驟
1)試劑準(zhǔn)備——配液區(qū)①首先將所有的試劑從冰箱取出并平衡至室溫。PCR反應(yīng)液配液標(biāo)準(zhǔn)為取 nX 19. 6 μ LSTR PCR Mix A和nXO. 4 μ L酶混合液加入到1. 5mL離心管中，振蕩混勻數(shù)秒， 3000rpm離心數(shù)秒；另取ηΧ19. 6μ L STR PCR Mix B和nXO. 4 μ L酶混合液加入到另一 1. 5mL離心管中，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心數(shù)秒。配好的PCR反應(yīng)液必需貯存在_20°C并在4h內(nèi)使用。②PCR反應(yīng)液的分裝。PCR反應(yīng)液A/B分別以每管20 μ L分裝于PCR薄壁反應(yīng)管。③將配制好的PCR反應(yīng)管裝入凹凸袋轉(zhuǎn)移至提取間。貯存在-20°C直至樣品提取處理完畢。2)樣品提取及加樣——提取區(qū)①固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的結(jié)核分枝桿菌，用22SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)收集細(xì)菌1環(huán)，并懸在 250 μ L TB DNA提取液中。液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的結(jié)核分枝桿菌取lmL，IOOOOrpm離心15min， 丟棄上清并在250 μ L TB DNA提取液中重懸細(xì)菌。②封口膜封口，99°C加熱20min。14000rpm離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清到新1. 5mL離心
管。上清即為PCR擴(kuò)增模板。(模板可保存于-20°C，并于1個(gè)月內(nèi)完成試驗(yàn)。注意不要反復(fù)凍融樣品。)③用微量加液器向每支PCR薄壁反應(yīng)管中加入相應(yīng)的提取樣品或陰/陽(yáng)性對(duì)照品 5uL0立即蓋嚴(yán)管蓋。④將已加入模板的PCR薄壁反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至PCR擴(kuò)增區(qū)。
3) PCR擴(kuò)增-擴(kuò)增區(qū)①儀器的程序設(shè)定如下第一步50°C2min，95°C IOmin ；第二步95°C10s，70°C 20s (每個(gè)循環(huán)降低 1°C )，75°C 20s, 10 個(gè)循環(huán)；第三步95°C10s,60°C 20s, 75°C 20s, 30 個(gè)循環(huán)，60°C 20s 處收集熒光信號(hào)；第四步95°C2min，40°C 2min ；第五步40 80°C，每0. 5°C收集熒光信號(hào)，熒光通道選用FAM和ΤΕΤ。②程序運(yùn)行完畢，將PCR薄壁反應(yīng)管(閉管)取出放入凹凸袋，將封口封嚴(yán)，按污染源處理。(3)試劑盒的參考值(參考范圍)陽(yáng)性對(duì)照，即野生型在各體系及各通道中的Tm值范圍如下 反應(yīng)體系A(chǔ)中FAM通道野生型對(duì)照峰的Tm值為57. 0°C 士 1 °C ；TET通道野生型對(duì)照峰的Tm值為65.0°C 士 1°C。反應(yīng)體系B中FAM通道野生型對(duì)照峰的Tm值為63. 5°C 士 1 °C ；TET通道野生型對(duì)照峰的Tm值為60. 0°C 士 1°C。其中各Tm值是在特定Bio-Rad CFX96儀器上所得的常見(jiàn)值，作為參考。當(dāng)使用其它儀器時(shí)，Tffl值可能略有變動(dòng)，以當(dāng)次試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照(野生型)所得的Tm值為準(zhǔn)。Tm值以儀器自動(dòng)判讀所得為準(zhǔn)，當(dāng)儀器給出一個(gè)以上Tm值時(shí)，請(qǐng)參考陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的峰型選擇有效Tm值。當(dāng)出現(xiàn)儀器無(wú)法自動(dòng)給出Tm值的情況時(shí)，可通過(guò)調(diào)整基線或直接人工判讀的方法獲得Tm值。
(4)結(jié)果判讀通過(guò)比較所檢測(cè)樣品與陽(yáng)性對(duì)照之間熔解曲線的熔點(diǎn)(Tm值)的差異判斷樣品是否發(fā)生突變。當(dāng)四個(gè)通道中樣品的熔點(diǎn)與陽(yáng)性對(duì)照的熔點(diǎn)均一致(誤差不超過(guò)rc )時(shí)判定為野生型，試驗(yàn)菌株對(duì)鏈霉素敏感；樣品的熔點(diǎn)低于陽(yáng)性對(duì)照2°c及以上時(shí)(ΔΤω>2 ) 判定為突變型，試驗(yàn)菌株對(duì)鏈霉素耐藥。關(guān)于雜合樣品結(jié)果的判讀當(dāng)四個(gè)通道中任一通道熔解曲線出現(xiàn)雙峰或融合峰時(shí)即為雜合樣品，分3種情況①當(dāng)樣品出現(xiàn)雙峰時(shí)，即為雜合樣品；②樣品為一個(gè)融合峰，與陽(yáng)性對(duì)照的熔點(diǎn)一致，但峰型與陽(yáng)性對(duì)照的峰型有較大差異，在有可能出現(xiàn)突變峰的位置出現(xiàn)小峰或突起，即為雜合樣品；③樣品為一個(gè)融合峰，為突變?nèi)埸c(diǎn)，但在野生峰的位置出現(xiàn)小峰或突起，即為雜合樣品。雜合樣品對(duì)鏈霉素耐藥，建議出現(xiàn)雜合樣品時(shí)將樣品重復(fù)檢測(cè)，以確定樣品耐藥性。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染、試劑污染、樣品交叉污染會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；試劑運(yùn)輸、保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確會(huì)引起試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果。本發(fā)明的具體原理是利用4對(duì)靶核苷酸序列的特異性引物和4條特異性熒光探針，分別于兩管中實(shí)驗(yàn)，采用耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、四種核苷酸單體(dNTP)等成分，并應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)靶核苷酸序列的核算片段擴(kuò)增以及之后的熔解曲線分析。所使用的探針為兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸鏈。在探針為自由狀態(tài)時(shí)， 報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)所吸收，而在體系中存在大量可與探針結(jié)合的單鏈擴(kuò)增子時(shí)，探針與擴(kuò)增子結(jié)合使得熒光報(bào)告基團(tuán)與熒光淬滅基團(tuán)分離，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光。這樣在熔解分析的過(guò)程中，隨著溫度的變化探針與擴(kuò)增子的結(jié)合狀態(tài)反應(yīng)在熒光信號(hào)的改變上，而通過(guò)比較與探針完全匹配以及不完全匹配的靶序列在熒光信號(hào)改變上的差異即可判斷出待測(cè)樣本在耐藥突變位點(diǎn)是否發(fā)生突變，從而判斷樣本耐藥情況。本發(fā)明在PCR 程序結(jié)束之后，直接增加一個(gè)熔解分析步驟即可對(duì)耐藥相關(guān)位點(diǎn)是否突變進(jìn)行判斷。此方法不用進(jìn)行PCR后處理，降低了污染以及假陽(yáng)性出現(xiàn)的概率。熒光PCR熔解曲線法特異性好，可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥常見(jiàn)突變，有望直接用于臨床樣本鏈霉素耐藥性檢測(cè)。本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)如下(1)由于本發(fā)明采用熒光PCR熔解曲線法作為檢測(cè)方法，整個(gè)反應(yīng)均在封閉的反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行，避免了其它核酸檢測(cè)方法如PCR-電泳等易于形成氣溶膠污染而造成假陽(yáng)性結(jié)果。(2)操作簡(jiǎn)便，且對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間。(3)由于各試劑用量均較少，大大降低了成本。


圖1為rpsL43位點(diǎn)典型熔解曲線結(jié)果圖。在圖1中，橫坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度與溫度的負(fù)導(dǎo)數(shù)(-dF/dT)，曲線1和2為rpsL43位點(diǎn)突變峰，曲線3為rpsL43位點(diǎn)野生峰，曲線4為空白對(duì)照。圖2為rpsL88位點(diǎn)典型熔解曲線結(jié)果圖。在圖2中，橫坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度與溫度的負(fù)導(dǎo)數(shù)(-dF/dT)，曲線1、2和3為rpsL88位點(diǎn)突變峰，曲線4為rpsL88位點(diǎn)野生峰，曲線5為空白對(duì)照。圖3為rrs513位點(diǎn)典型熔解曲線結(jié)果圖。在圖3中，橫坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度與溫度的負(fù)導(dǎo)數(shù)(-dF/dT)，曲線1和2為rrs513位點(diǎn)突變峰，曲線3為rrs513位點(diǎn)野生峰，曲線4為空白對(duì)照。圖4為1TS905位點(diǎn)典型熔解曲線結(jié)果圖。在圖4中，橫坐標(biāo)為溫度，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度與溫度的負(fù)導(dǎo)數(shù)(-dF/dT)，曲線1為rrs905位點(diǎn)突變峰，曲線2為rrs905位點(diǎn)野生峰，曲線3為空白對(duì)照。圖5為本發(fā)明所述結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變的檢測(cè)方法的試劑盒實(shí)施例結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1引物和探針設(shè)計(jì)根據(jù)結(jié)核分枝桿菌野生型基因組序列在四個(gè)位點(diǎn)各設(shè)計(jì)多對(duì)引物和探針，引物 3'端無(wú)互補(bǔ)序列。引物、探針序列組合可為弓丨物 rpsL43F:5 ‘ -CAGCCCGCAGCGTCGTGGTGT-3‘弓丨物 rpsL43R:5 ‘ -GTGGCCCTCGCCGGGAA-3‘弓丨物 rpsL88F:5 ‘ -GCACTCGATGGTGCTGGTGC-3‘弓丨物 rpsL88R:5 ‘ -CGTGCCTGTTTGCGGTTCTT-3‘引物 rrs512F:5 ‘ -ACCTCTTTCACCATCGACGAAGGTCC-3‘引物 rrs512R:5 ‘ -GTTAAGCCGTGAGATTTCACGAACAA-3‘弓丨物 rrs904F:5 ‘ -GGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTG-3‘弓丨物 rrs904R:5 ‘ -GCATGTCAAACCCAGGTAAGGTTC-3‘探針rpsL43P 5' -FAM-CCGCGCCACTCCGAAGAAGCCGAACTCCGCGG-Dabcyl-3'探針 rpsL88P 5 ‘ -TET-CCGTCCGGGTGAAGGACCTGCCTGACGg-Dabcyl-3‘探針rrs512P:5 ‘ -FAM-CGCACCCAGCAGCCGCGGTAATACGTGCG-Dabcyl-3‘探針 rrs904P:5 ‘ -TET-CCGCGGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGCGCGG-Dabcyl-3‘弓丨物及探針均由上海生工生物有限公司合成。
實(shí)施例2提取結(jié)核分枝桿菌基因組DNA用熱裂解法提取結(jié)核分枝桿菌基因組DNA，具體過(guò)程是A、固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的結(jié)核分枝桿菌，用22SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)收集細(xì)菌1環(huán)，并懸在 250 μ L TB DNA提取液中。液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的結(jié)核分枝桿菌取lmL，IOOOOrpm離心15min， 丟棄上清并在250 μ L TB DNA提取液中重懸細(xì)菌。B、封口膜封口，99°C加熱20min。14000rpm離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清到新1. 5mL離心
管。上清即為PCR擴(kuò)增模板。C.樣本保存于-20°c，并于1個(gè)月內(nèi)完成試驗(yàn)。注意不要反復(fù)凍融樣本。實(shí)施例3反應(yīng)體系的建立和優(yōu)化利用野生型結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA作為待檢樣本，分裝后儲(chǔ)存于-20°C備用。2. 1引物比例的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，調(diào)整上下游引物的比例，將引物比例分別調(diào)至1 5、1 IOU 15和1 20，經(jīng)過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)選定1 10為上下游引物的比例。2. 2MgCl2濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將MgCl2的濃度以 lmmol/L至5mmol/L以lmmol/L遞增，經(jīng)過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)選定lmmol/L(rpsL體系)和3mmol/ L(rrs體系)為試劑盒反應(yīng)體系中的鎂離子濃度。2. 3Taq酶用量的優(yōu)化通過(guò)比較Taq酶用量(以單位Unit計(jì))的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 選定2U作為試劑盒反應(yīng)體系中Taq酶的用量。利用上述引物和探針進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最后確定采用的熒光PCR熔解曲線法快速篩查結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變的反應(yīng)體系為25 μ 1體系，所需各組分及相應(yīng)濃度見(jiàn)表1和表2。表1熒光PCR熔解曲線法快速篩查結(jié)核分枝桿菌鏈霉素rpsL基因耐藥突變反應(yīng)中的各組分情況，表2熒光PCR熔解曲線法快速篩查結(jié)核分枝桿菌鏈霉素rrs基因耐藥突變反應(yīng)中的各組分情況表權(quán)利要求
1.一種結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟1)根據(jù)結(jié)核分枝桿菌全序列和結(jié)核分枝桿菌基因組rpsL和rrs基因序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物和探針；2)提取結(jié)核分枝桿菌樣本的DNA；3)構(gòu)建PCR反應(yīng)體系；4)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及熔解曲線分析將步驟2、提取的DNA加入步驟幻的PCR反應(yīng)體系中，設(shè)陰性對(duì)照、空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及熔解曲線分析，將待測(cè)樣本反應(yīng)管所得熔解曲線與陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)管所得熔解曲線的Tm值進(jìn)行比較，判斷出待測(cè)樣本中rpsL 及rrs基因上耐藥相關(guān)突變位點(diǎn)是否發(fā)生突變，從而判斷樣本耐藥情況。
2.如權(quán)利要求1所述的一種結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變的檢測(cè)方法，其特征在于在步驟1)中，所述設(shè)計(jì)引物和探針的具體方法為a，引物設(shè)計(jì)在所檢測(cè)的突變兩端，探針覆蓋突變位點(diǎn)；b，探針的熒光基團(tuán)可選擇FAM、R0X、HEX、CY5、TET、CAL-Fluor中的任意一種，淬滅基團(tuán)選擇 BHQ、Dabcyl。
3.如權(quán)利要求1所述的一種結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變的檢測(cè)方法，其特征在于在步驟1)中，所述引物和探針的具體序列為引物 rpsL43F5'-CAGCCCGCAGCGTCGTGGTGT-3'引物 rpsL43R5'-GTGGCCCTCGCCGGGAA-3'引物 rpsL88F5'-GCACTCGATGGTGCTGGTGC-3'引物 rpsL88R5'-CGTGCCTGTTTGCGGTTCTT-3'引物 rrs512F5'-ACCTCTTTCACCATCGACGAAGGTCC-3'引物 rrs512R5'-GTTAAGCCGTGAGATTTCACGAACAA-3'引物 rrs904F5'-GGGTTTCCTTCCTTGGGATCCGTG-3'引物 rrs904R5'-GCATGTCAAACCCAGGTAAGGTTC-3'探針 rpsL43P5'-FAM-CCGCGCCACTCCGAAGAAGCCGAACTCCGCGG-Dabcyl-3'探針 rpsL88P5'-TET-CCGTCCGGGTGAAGGACCTGCCTGACGG-Dabcyl-3'探針 rrs512P5'-FAM-CGCACCCAGCAGCCGCGGTAATACGTGCG-Dabcyl-3'探針 rrs904P5'-TET-CCGCGGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGCGCGG-Dabcyl-3'。
4.如權(quán)利要求1所述的一種結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變的檢測(cè)方法，其特征在于在步驟2)中，所述PCT反應(yīng)體系為一種是rpsL體系，用來(lái)檢測(cè)rpsL基因相關(guān)耐藥突變，另一種是rrs體系，用來(lái)檢測(cè)rrs基因相關(guān)耐藥突變，反應(yīng)液每份為20 μ 1，每份反應(yīng)液中含下列組分rpsL 體系1XPCR Buffer [1 Ommol/L Tris, 50mmol/L KC1，50 % (v/v)甘油]， 200ymol/L dATP、200 μ mol/L dCTP、200 μ mol/L dGTP、400 μ mol/L dUTP, Immo 1/L MgCl2, 引物 rpsL43R 和引物 rpsL88R 各 0. 6 μ mol/L，引物 rpsL43F、引物 rpsL88F、探針 rpsL43P 和探針 rpsL88P 各 0. 06 μ mol/L, Taq DNA 聚合酶 2U，UNG 酶 0. OlU ；rrs 體系1XPCR Buffer [ IOmmo 1/L Tris, 50mmol/L KC1，50 % (v/v)甘油]， 200 μ mol/L dATP、200ymol/L dCTP、200 μ mol/L dGTP、400 μ mol/L dUTP, 3mmol/LMgCl2, 引物 rrs512R 和引物 rrs904R 各 0. 6 μ mol/L，引物 rrs512F、引物 rrs904F、探針 rrs512P 和探針 rrs904P 各 0. 06 μ mol/L, Taq DNA 聚合酶 2U, UNG 酶 0. 01U。
5.如權(quán)利要求1所述的一種結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變的檢測(cè)方法，其特征在于在在步驟4)中，所述PCR擴(kuò)增的條件為50°C 2min，95°C IOmin ；95°C 10s、70°C 20s，每個(gè)循環(huán)降低1°C、75°C 20s構(gòu)成一個(gè)touchdown循環(huán)，共進(jìn)行10個(gè)循環(huán)；95°C 10s,60°C 20s、 75°C 20s構(gòu)成一個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；之后是熔解分析步驟，95°C 2min、4(TC 2min、 40 80°C每0. 5°C采集熒光。
6.如權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變的檢測(cè)方法的試劑盒，其特征在于設(shè)有盒體、擴(kuò)增試劑、TB DNA提取液、TB陰性對(duì)照和STR陽(yáng)性對(duì)照；所述擴(kuò)增試劑包括STR PCR Mix A、STR PCR Mix B 和 TB 酶混合液，STR PCR Mix A、STR PCR Mix B、TB 酶混合液、 TB DNA提取液、TB陰性對(duì)照和STR陽(yáng)性對(duì)照放置在盒體內(nèi)；所述 STR PCR Mix A 包括 1 XPCR Buffer, dATP、dCTP、dGTP 各 200 μ Μ、dUTP 400 μ Μ, MgCl2ImM,弓 I 物 rpsL43R 和 rpsL88R 各 0. 6 μ M，引物 rpsL43F 和 rpsL88F 各 0. 06 μ Μ,探針卬81^43 和卬81^88 各0.06“]\1;所述81^€61~為101111 Tris-HCl, 50mM KC1,50% (v/v)甘油；所述 STR PCR Mix B 包括 IXPCR Buffer, dATP、dCTP、dGTP 各 200 μ Μ、dUTP 400 μ Μ, MgCl23mM,弓 I 物 rrs512R 和 rrs904R 各 0. 6 μ M，引物 rrs512F 和 rrs904F 各 0. 06 μ Μ,探針 rrs512P 和 rrs904P 各 0. 06μΜ，所述 Buffer 為 IOmM Tris,50mM KCl，50% (ν/ν)甘油；所述TB酶混合液包括2U Taq, 0. OlU UNG ；所述STR陽(yáng)性對(duì)照為STR野生型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；所述TB陰性對(duì)照為TB DNA提取液、H2O, Tris或生理鹽水；所述TB DNA提取液的成分為乙二胺四乙酸二鈉、Tris和TritonX-100。
7.如權(quán)利要求6所述的結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變的檢測(cè)方法的試劑盒檢驗(yàn)標(biāo)本的方法，其特征在于包括以下步驟1)試劑準(zhǔn)備——配液區(qū)①首先將所有的試劑從冰箱取出并平衡至室溫，PCR反應(yīng)液配液標(biāo)準(zhǔn)為取 nX 19. 6 μ LSTR PCR Mix A和nXO. 4 μ L酶混合液加入到1. 5mL離心管中，振蕩混勻數(shù)秒， 3000rpm離心數(shù)秒；另取ηΧ19. 6μ L STR PCR Mix B和nXO. 4 μ L酶混合液加入到另一 1. 5mL離心管中，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心數(shù)秒，配好的PCR反應(yīng)液必需貯存在_20°C并在4h內(nèi)使用；②PCR反應(yīng)液的分裝，PCR反應(yīng)液A/B分別以每管20μ L分裝于PCR薄壁反應(yīng)管；③將配制好的PCR反應(yīng)管裝入凹凸袋轉(zhuǎn)移至提取間，貯存在-20°C直至樣品提取處理完畢；2)樣品提取及加樣——提取區(qū)①固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的結(jié)核分枝桿菌，用22SWG標(biāo)準(zhǔn)接種環(huán)收集細(xì)菌1環(huán)，并懸在 250 μ L TB DNA提取液中，液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的結(jié)核分枝桿菌取lmL，IOOOOrpm離心15min， 丟棄上清并在250 μ L TB DNA提取液中重懸細(xì)菌；②封口膜封口，99°C加熱20min，14000rpm離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清到新1.5mL離心管，上清即為PCR擴(kuò)增模板；③用微量加液器向每支PCR薄壁反應(yīng)管中加入相應(yīng)的提取樣品或陰/陽(yáng)性對(duì)照品5yL;立即蓋嚴(yán)管蓋；④將已加入模板的PCR薄壁反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至PCR擴(kuò)增區(qū)； 3) PCR擴(kuò)增-擴(kuò)增區(qū)①儀器的程序設(shè)定如下 第一步50°C 2min，95°C IOmin ；第二步95°C 10s，70°C 20s，每個(gè)循環(huán)降低1°C，75°C 20s，10個(gè)循環(huán)； 第三步95°C 10s，60°C 20s, 75°C 20s, 30個(gè)循環(huán)，60°C 20s處收集熒光信號(hào)； 第四步:95°C 2min，40°C 2min ；第五步40 80°C，每0. 5°C收集熒光信號(hào)，熒光通道選用FAM和TET ；②程序運(yùn)行完畢，將PCR薄壁反應(yīng)管取出放入凹凸袋，將封口封嚴(yán)，按污染源處理； (3)試劑盒的參考值陽(yáng)性對(duì)照，即野生型在各體系及各通道中的Tm值范圍如下反應(yīng)體系A(chǔ)中FAM通道野生型對(duì)照峰的Tm值為57. 0°C 士 1°C ；TET通道野生型對(duì)照峰的 Tm 值為 65.0°C 士 1°C ；反應(yīng)體系B中FAM通道野生型對(duì)照峰的Tm值為63. 5°C 士 1°C ；TET通道野生型對(duì)照峰的 Tm 值為 60. 0°C 士 1°C ；其中各Tm值是在特定Bio-Rad CFX96儀器上所得的常見(jiàn)值，作為參考。當(dāng)使用其它儀器時(shí)，Tffl值可能略有變動(dòng)，以當(dāng)次試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照所得的Tm值為準(zhǔn)；Tm值以儀器自動(dòng)判讀所得為準(zhǔn)，當(dāng)儀器給出一個(gè)以上Tm值時(shí)，請(qǐng)參考陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的峰型選擇有效1值；當(dāng)出現(xiàn)儀器無(wú)法自動(dòng)給出Tm值的情況時(shí)，通過(guò)調(diào)整基線或直接人工判讀的方法獲得Tm值。
全文摘要
一種結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變的檢測(cè)方法及試劑盒。涉及耐藥突變的檢測(cè)技術(shù)，提供一種有效提高靈敏度及特異性、操作簡(jiǎn)便、周期短結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥突變的檢測(cè)方法。根據(jù)結(jié)核分枝桿菌全序列和結(jié)核分枝桿菌基因組rpsL和rrs基因序列，設(shè)計(jì)引物和探針；提取結(jié)核分枝桿菌樣本的DNA；構(gòu)建PCR反應(yīng)體系；進(jìn)行PCR擴(kuò)增及熔解曲線分析。利用特異性引物和探針，分別于兩管中實(shí)驗(yàn)，采用耐熱DNA聚合酶、四種核苷酸單體等成分，并應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)靶核苷酸序列的核算片段擴(kuò)增以及之后的熔解曲線分析。熒光PCR熔解曲線法特異性好，可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥常見(jiàn)突變，有望直接用于臨床樣本鏈霉素耐藥性檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102229991SQ20111013824
公開(kāi)日2011年11月2日 申請(qǐng)日期2011年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月25日
發(fā)明者張婷, 李慶閣, 胡思玉 申請(qǐng)人:廈門大學(xué), 廈門致善生物科技有限公司