專利名稱：原核來源的泛素樣分子的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程領域，特別涉及重組蛋白的異源表達。
背景技術：
通過異源基因在宿主細胞，包括細菌、酵母菌、哺乳動物細胞以及昆蟲細胞等中進行表達，是目前生產(chǎn)蛋白和/或多肽產(chǎn)品最為常用的方法。使用異源表達系統(tǒng)獲得具有生物學活性的均一蛋白，在功能基因組學的研究中也廣泛應用。大腸桿菌等原核系統(tǒng)由于菌體細胞簡單，表達蛋白成本低廉，得到了更廣泛的應用。然而，不同的異源基因，在同樣的宿主細胞，盡管使用相同的表達載體，獲得同樣的轉錄和翻譯信號，但重組蛋白表達水平可以有很大差別。某些重組蛋白在宿主細胞中不能高效表達有很多原因，包括宿主細胞的密碼子偏好引起異源基因轉錄和翻譯水平低下；重組蛋白由于自身不穩(wěn)定性，易于被宿主蛋白酶切降解；錯誤折疊的重組蛋白對宿主細胞 酶切降解的易感性提高等等。為提高重組蛋白的表達水平，可以采取一些策略。例如，在蛋白酶缺失的大腸桿菌菌株中進行表達，以增加重組蛋白的穩(wěn)定性(Gottesman et al. J Bacteriol 1978. 133 844-51);將宿主蛋白片段與目標重組多肽/蛋白融合，也可以增加外源蛋白在宿主細胞中的穩(wěn)定性(Itakura et al.，Science, 1977. 198 1056-63 ；Shen, Proc Natl Acad SciUSA, 1984. 81 :4627-31);在原核宿主細胞，將分泌前導序列融合至重組蛋白，可以促使基因產(chǎn)物在細胞周質的累積或外排分泌，提高正確折疊的可溶性蛋白的復性，可能提高蛋白產(chǎn)量(Nilsson et al. ,EMBO J, 1985. 4 :1075-80 ；Abrahmsen et al. ,Nucleic Acids Res,1986. 14 :7487-500)。這些策略對某些蛋白來說有效，但對許多其它蛋白卻不一定成功。因此，存在多種基因融合系統(tǒng)，使用不同的融合伴侶與異源蛋白連接。常見的原核來源的融合伴侶包括谷胱甘肽硫轉移酶GST(Smith，Methods Enzymol, 2000. 326 :254-70)，硫氧還原蛋白 TRX (Hammarstrom et al.，Protein Science, 2002. 11 :313-321),以及麥芽糖結合蛋白 MBP (Sachdev et al. , Methods Enzymol, 2000. 326 :312-21)等。真核來源的泛素Ubquitin和小泛素樣分子Sumo也是常見的融合伴侶。泛素是一種在所有真核細胞中廣泛存在，序列結構高度保守的低分子量蛋白質，能夠與靶蛋白形成共價結合，是蛋白翻譯后修飾的一個重要方式。同時，真核細胞中還存在一些與泛素結構類似的蛋白質，稱為泛素樣蛋白(UBLs) (Dye et al. Annu Rev BiophysBiomol Struct. 2007 ;36 :131-50.)。該家族成員具有兩個共同的結構特征，P -手握樣折疊(0-grasp fold)結構域,和含有雙甘氨酸殘基的羧基末端柔性結構。他們對祀蛋白的化學修飾方式與泛素相同，既羧基末端的甘氨酸殘基與靶蛋白賴氨酸殘基側鏈氨基形成異肽鍵連接，但可以產(chǎn)生與泛素化修飾不同的生物效應。已知的UBLs包括SUM01/2/3，ISG15，F(xiàn)AT10, ATG8/12, NEDD8, UFMl, URMl 等。泛素化一個最主要的作用就是將革巴蛋白傳遞給26S蛋白酶體進行降解(Welchmanet al. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005 ;6 :599-609)。另一方面，靶蛋白被 Sumo 化后并不會引起蛋白的降解，而是直接或問接改變蛋白在細胞內的定位。盡管他們在真核細胞對靶蛋白的作用不同，但在原核細胞作為融合伴侶表達系統(tǒng)，他們都可以提高目的重組蛋白的穩(wěn)定性。(Baker et al. J Biol Chem. 1994 ;269 :25381-6, Butt et al. Protein ExprPurif. 2005 ；43 :1_9.)泛素及Sumo與不表達或低表達蛋白的N-末端進行融合，可以顯著提高在真核細胞以及原核細胞內的表達水平。美國專利7820384也把其它真核來源的泛素樣分子包括RUB、HUB、APG8、APG12、URMl和ISG15作為融合伴侶，作為提高宿主細胞中目的蛋白表達水平的方法。盡管通常認為原核細胞不存在泛素化修飾系統(tǒng)，但從蛋白高級結構、生化反應等分析發(fā)現(xiàn)，原核細胞中廣泛存在的硫轉運系統(tǒng)，與真核泛素化修飾系統(tǒng)有進化意義上的關聯(lián)(Rudolph et al. Nat Struct Biol. 2001；8 42-6,Wang et al. Nat Struct Biol. 2001 ；8 :47-51, Xu et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 ;103 :11625-30.)。細菌在鑰蝶呤molybdopterin和硫胺素thiamine的合成途徑中，需要硫原子的摻入,硫原子分別由硫轉運分子MoaD和ThiS提供。硫轉運分子ThiS和MoaD也含有P手握樣折疊結構域及羧基 末端雙甘氨酸殘基，與泛素，特別是URMl有一定的序列同源性。2008 年，Science 雜志首次報道(Pearce et al. Science. 2008 ；322 :1104-7. ) 了結核菌屬發(fā)現(xiàn)類泛素化修飾分子Pup，該小蛋白分子與靶蛋白賴氨酸殘基側鏈氨基形成異肽鍵連接。Pup修飾可誘導靶蛋白分子被蛋白酶體降解。2010 年，在 Nature 雜志又報道(Humbard et al. Nature. 2010 ；463 54~60) 了古細菌類泛素化修飾分子SAMP1/2。通常認為古細菌是獨立于真核系統(tǒng)和原核系統(tǒng)的第三類生命形式。SAMPl and SAMP2含有3手握樣折疊結構域及羧基末端雙甘氨酸殘基，其末端甘氨酸殘基可與靶蛋白賴氨酸殘基側鏈氨基形成異肽鍵連接，并影響靶蛋白的穩(wěn)定性。值得注意的是，SAMP1/2在古細菌中分別屬于MoaD和ThiS的類似物。然而，目前尚不知道原核細胞中具有泛素樣結構的硫轉運分子MoaD和ThiS，是否具有泛素化修飾功能，以及他們作為原核來源的泛素樣分子，成為融合伴侶表達系統(tǒng)的可行性。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及原核來源的泛素樣分子。這些分子完全或部分具有泛素樣結構。他們可以具有泛素樣修飾功能。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，原核細胞廣泛存在保守的類泛素化修飾系統(tǒng)。硫轉運分子ThiS和MoaD是原始的功能性類泛素分子，他們可對菌體蛋白產(chǎn)生共價修飾(圖I)。他們對靶蛋白的化學修飾方式不同=ThiS的靶蛋白共價結合物對還原劑敏感，DTT處理可使其失去大部分共價連接，而MoaD的靶蛋白共價結合物對還原劑不敏感(圖2)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，具有泛素樣結構域的原核硫轉運分子MoaD，可作為融合伴侶，顯著提高宿主菌中重組蛋白的穩(wěn)定性和/或表達水平。本發(fā)明也發(fā)現(xiàn)，具有泛素樣結構域的原核硫轉運分子ThiS，盡管會促進不穩(wěn)定蛋白在細菌體內的降解，但可作為融合伴侶，顯著提高宿主菌中某些重組蛋白的表達水平。本發(fā)明提供了一個用于表達融合多肽的方法，該融合多肽含有原核硫轉運分子MoaD或其結構上的類似物、片段或衍生物，同時還含有一個目的蛋白/多肽。
本發(fā)明提供了另一個用于表達融合多肽的方法，該融合多肽含有原核硫轉運分子ThiS或其結構上的類似物、片段或衍生物，同時還含有一個目的蛋白/多肽。本文使用的“多肽”和“蛋白”為同義詞，代表含有兩個或兩個以上氨基酸殘基的序列。本文所述的這些泛素樣結構小分子的類似物或衍生物，代表這些蛋白分子，比較真核來源的泛素樣分子，與原核來源的泛素樣分子具有更高同源性的序列結構。所述的這些泛素樣結構小分子的片段，是含有部分泛素樣結構域的分子序列，如氨基半分子序列或羧基半分子序列。融合蛋白可以含有信號肽。這可使融合多肽定位于細胞內的一個特定區(qū)域或分泌出細胞外。融合多肽還可以含有親和純化標簽。親和純化標簽位于或接近融合蛋白的末端。例如，N-末端的n-His標簽，n為4，5，6，7，8，9，或10。親和標簽可以提供一種固定融合多 肽的方式，例如在純化過程中在親和基質上的固定。宿主細胞可以是細菌(如大腸桿菌)，也可以是其它種屬的宿主細胞，包括真核細胞。融合多肽中的目的蛋白/多肽可以是人源蛋白或其它種屬來源的蛋白。通過融合多肽形式的表達，可以獲得大量的目的蛋白。為實施本發(fā)明提供的上述方法，以提高宿主細胞目的蛋白表達水平，需首先獲得編碼原核來源的泛素樣分子，如硫轉運分子ThiS或MoaD的基因克隆。ThiS和MoaD在各種原核細胞中廣泛存在，且高度保守。由于原核細胞基因組沒有內含子，可以按照已知的全基因序列或相應多肽序列，用PCR直接獲得DNA克隆。DNA克隆也可通過基因組DNA文庫篩選的方法，或人工合成的方法獲得。人工合成的基因序列可以與天然DNA序列相同，也可以按照其氨基酸序列，用公知的設計方法合成不同的簡并編碼。按公知的方法，將編碼原核來源的泛素樣分子，如硫轉運分子ThiS或MoaD的基因或其片段連接到編碼目的蛋白的核苷酸序列上，即構建出編碼一個融合蛋白的核酸序列。ThiS或MoaD的基因通常位于編碼目的蛋白基因的5’端。ThiS或MoaD的基因與編碼目的蛋白基因之間可含有一段基因序列，編碼合適化學切割或蛋白酶切割的氨基酸序列。將編碼融合蛋白的基因序列，連接到表達載體中，是分子生物學領域公知的方法。各種商品化的原核表達載體，可提供選擇。如PQE30和pQE80L(Qiagen), pET系列載體(Novogen),可生成帶His_6(六組氨酸)標簽的多肽融合目的蛋白。將構建的表達載體轉入合適的宿主細胞，經(jīng)過誘導獲得目的蛋白的表達，是生物工程領域公知的方法。表達的宿主菌經(jīng)常規(guī)的破碎方法，如凍融法、超聲破碎法、其它機械或化學破碎方法，收取含有可溶性表達產(chǎn)物的上清液，或沉淀的包含體表達產(chǎn)物。優(yōu)選的方案中，產(chǎn)物可通過標簽多肽的親和層析技術，如His-6特異性的金屬親和層析方法，純化獲得。融合蛋白中，作為融合伴侶的編碼原核來源的泛素樣分子，如硫轉運分子ThiS或MoaD，可以用合適的化學切割或蛋白酶切割去除。本發(fā)明提供的融合表達方法，能夠顯著提高一些目的蛋白的表達水平。例如，對一些自身穩(wěn)定性差的目的蛋白，MoaD融合可以增加其體內穩(wěn)定性，因而促進其表達；ThiS融合對一些小分子多肽的表達，有明顯的穩(wěn)定和促進作用。本發(fā)明的另一個優(yōu)點，是原核來源的泛素樣分子，通常比真核來源的泛素樣分子更小，因此融合蛋白產(chǎn)物中目的蛋白的占比提聞，有利于提聞目的蛋白的廣量。


圖I. MoaD、ThiS在大腸桿菌表達時形成蛋白共價結合物。MoaD 和 ThiS 的表達載體 MoaD/pET28a 和 ThiS/pET28a 在大腸桿菌 BL21 (DE3)PLysS中經(jīng)IPTG誘導表達。未誘導(-)和誘導(+)的全菌裂解液，以及經(jīng)Ni+親和層析純化的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳分離(A)，箭頭所指位置為目的蛋白條帶位置。聚組氨酸抗體免疫印跡(B)檢測可見除MoaD和ThiS自身表達外，還在全菌裂解液或純化樣品中形成許多高分子量的蛋白共價結合物。圖2.還原劑DTT對ThiS、MoaD蛋白與菌體蛋白連接的影響

ThiS、MoaD表達的全菌樣品以及蛋白純化樣品經(jīng)50mM還原劑DTT處理后電泳分離，經(jīng)聚組氨酸抗體免疫印跡檢測，MoaD的蛋白共價結合物未受影響，而ThiS的多數(shù)蛋白共價結合物消失。圖3.小鼠核糖核酸酶抑制劑mRI與ThiS或MoaD融合表達改變其體內穩(wěn)定性。泛素及Sumo與小鼠核糖核酸酶抑制劑mRI的融合表達載體Ub_mRI/pVI及Sumo-mRI/pVI，和 MoaD 及 ThiS 與 mRI 的融合表達載體 MoaD-mRI/pVI 及 ThiS-mRI/pVI，在TGl及BL21(DE3)pLysS菌中經(jīng)IPTG誘導表達，未誘導(-)和誘導(+)的全菌裂解液，以及全菌裂解的上清(丨)及沉淀(丨)經(jīng)SDS-PAGE電泳(A1、B1、C1、D1)以及聚組氨酸抗體免疫印跡檢測(A2、B2、C2、D2)。箭頭所指位置為預期目的蛋白條帶位置。Ub-mRI和Sumo-mRI表達產(chǎn)物可見許多低分子量降解條帶；MoaD-mRI基本不含有降解產(chǎn)物，而ThiS_mRI表達后僅含有微量完整產(chǎn)物，而以低分子量降解條帶為主。圖4.融合伴侶ThiS及小鼠核糖核酸酶抑制劑mRI片段化對融合產(chǎn)物穩(wěn)定性的影響。A =ThiS氨基半ThN，羧基半ThC片段，與mRI的融合表達載體ThN_mRI/pET28a和ThC-mRI/pVI在大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中，未誘導(-)和經(jīng)IPTG誘導(+)的全菌裂解液經(jīng)SDS-PAGE電泳(Al)以及聚組氨酸抗體免疫印跡檢測(A2)。ThiS氨基半或羧基半片段融合產(chǎn)物的降解明顯低于ThiS融合產(chǎn)生的降解。B :ThiS或MoaD融合表達的mRI羧基截短變異體AmRI表達載體MoaD-A mRI/pVI及1^5-八!!11 1/^1，在大腸桿菌161和乩21(0￡3) 1^85中，未誘導(-)和經(jīng)IPTG誘導(+)的全菌裂解液經(jīng)SDS-PAGE電泳(BI)以及聚組氨酸抗體免疫印跡檢測(B2)。ThiS-AmRI融合產(chǎn)物的降解明顯低于mRI全蛋白與ThiS融合產(chǎn)生的降解。三角所指位置為預期目的蛋白條帶位置。圖5. ThiS融合促進人胰島素A鏈的表達。ThiS及泛素融合的人胰島素A鏈表達載體ThiS_A/pET28a和Ub_A/pET28a在BL21(DE3)pLysS菌中，未誘導(-)和經(jīng)IPTG誘導(+)的全菌裂解液，以及全菌裂解的上清(t )及沉淀(丨)樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳(A)以及聚組氨酸抗體免疫印跡檢測(B)。ThiS融合產(chǎn)物的產(chǎn)量明顯高于泛素融合產(chǎn)物。箭頭所指位置為預期目的蛋白條帶位置。圖6. ThiS融合促進人胰島素B鏈的表達。
ThiS及泛素融合的人胰島素B鏈表達載體ThiS_B/pET28a和Ub_B/pET28a在BL21(DE3)pLysS菌中，誘導表達，未誘導(-)和經(jīng)IPTG誘導(+)的全菌裂解液，以及全菌裂解的上清(丨)及沉淀(丨)樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳(A)以及聚組氨酸抗體免疫印跡檢測(B)。ThiS融合產(chǎn)物的產(chǎn)量明顯高于泛素融合產(chǎn)物。圖7. ThiS片段化融合對人胰島素A鏈表達的影響。ThiS氨基半ThN,羧基半ThC片段,和泛素氨基半UbN與人胰島素A鏈融合表達載體 ThN-A/pET28a、ThC-A/pET28a 和 UbN_A/pET28a 在 BL21 (DE3) pLysS 菌中，經(jīng) IPTG 誘導后的全菌裂解液，以及全菌裂解的上清(t )及沉淀(I )樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳(A)以及聚組氨酸抗體免疫印跡檢測(B)。幾種融合產(chǎn)物的產(chǎn)量基本相當。三角所指位置為預期目的蛋白條帶位置。圖8. ThiS片段化融合對人胰島素B鏈表達的影響。
ThiS氨基半ThN，羧基半ThC片段，和泛素氨基半UbN與人胰島素B鏈融合表達載體 ThN-B/pET28a、ThC-B/pET28a 和 UbN_B/pET28a 在 BL21 (DE3) pLysS 菌中，經(jīng) IPTG 誘導后的全菌裂解液，以及全菌裂解的上清(t )及沉淀(I )樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳(A)以及聚組氨酸抗體免疫印跡檢測(B)。除ThC-B表達較低外，融合產(chǎn)物的產(chǎn)量基本相當。三角所指位置為目的蛋白條帶位置。
具體實施例方式實驗方法I.基因克隆與表達載體構建MoaD和ThiS基因是從大腸桿菌TGl基因組DNA中PCR擴增獲得。人泛素cDNA是依照其蛋白序列，按照大腸桿菌的密碼偏好，通過寡核苷酸片段合成并PCR擴增獲得。人Sumol cDNA是通過人乳腺癌MCF-7反轉錄產(chǎn)物PCR擴增獲得。小鼠核糖核酸酶抑制劑mRI (含456個氨基酸殘基)的cDNA(mRNH)如文獻所述(葛瑩，等.中國生物工程雜志2010，30 17-23);其PCR自然突變產(chǎn)物AmRI在340位密碼子產(chǎn)生突變，編碼蛋白在此處中止翻譯，因此產(chǎn)物為羧基端截短的變異體。人胰島素A鏈和B鏈編碼基因均通過寡核苷酸片段合成并PCR擴增獲得。通過PCR擴增獲得編碼ThiS氨基半(含50%氨基酸殘基)ThN，羧基半(含50%氨基酸殘基)ThC的基因片段，和泛素氨基半(含50%氨基酸殘基)UbN的基因片段?；蛉诤闲蛄挟a(chǎn)物通過酶切后連接直接獲得，或連接后PCR擴增獲得。上述基因及其融合片段，分別插入表達載體pQE80L (Qiagen),pET28a(Invitrogen)和pVI載體(威格拉斯生物技術有限公司)。其表達產(chǎn)物的5'端均融合有編碼包含聚組氨酸的額外載體序列。所有載體的目的基因片段均經(jīng)核酸序列測定驗證其正確性。2.蛋白的誘導表達表達載體的質粒DNA分別轉化TGl和BL21 (DE3) pLysS感受態(tài)細胞。從LB固體培養(yǎng)基上挑取含有目的基因的大腸桿菌菌落，接種至3ml LB (含有相應抗生素)培養(yǎng)液中，37°C振搖活化16h后，轉接于3ml或大體積LB培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)至濃度0D600測量值為0.3-0. 8，使用0. I-ImM IPTG誘導表達目的蛋白，4h_16h后停止培養(yǎng)。7000rpm離心5min收集菌體。經(jīng)誘導表達的宿主菌,離心收取菌體,重懸于含I %Triton-XlOO的PBS中。經(jīng)凍融和超聲破碎，上清為可溶性蛋白，沉淀為不溶性蛋白部分。3.蛋白電泳與定量樣品進行SDS-PAGE，蛋白可被考馬斯亮藍染色。考馬斯亮藍染色的凝膠使用凝膠掃描顯像密度計掃描后，融合蛋白相應的條帶像素密度可以直接獲得。分別用5 yl，10 yl，20ul濃度為0. 2mg/ml牛血清白蛋白(BSA)作為標準品對照，依據(jù)BSA標準曲線計算目的
蛋白含量。4.免疫印跡檢測SDS-PAGE電泳結束后，將蛋白經(jīng)電轉(100mA，Ih,冰浴)至NC膜上，麗春紅染色觀察轉膜情況。電轉后的NC膜用含5%脫脂奶粉的PBST室溫封閉非特異性結合位點2h。然后用PBST洗膜3次。將膜與稀釋的小鼠抗His-標簽單克隆抗體(I 2000)于4°C孵育過夜。 然后PBST洗膜3次，15min/次，將膜轉入稀釋的辣根酶標記的山羊抗小鼠IgG (I 5000)，室溫孵育I. 5h。然后PBST洗膜3次。最后ECL顯影，拍照。5.質譜分析蛋白樣品經(jīng)過S印hadex G_10離心柱脫鹽，或直接稀釋得到的樣品，與質譜基質FA I I混合點樣。經(jīng)基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS) (MALDI-T0F/TOF Analyzer 4800 plus, Applied Biosystem)對樣品蛋白進行定性分析。實施例I.融合伴侶ThiS或MoaD對小鼠核糖核酸酶抑制劑mRI表達的影響。為觀察ThiS和MoaD的融合伴侶作用，并與泛素及Sumo進行比較，構建了泛素及Sumo與小鼠核糖核酸酶抑制劑mRI的融合表達載體Ub_mRI/pVI及Sumo-mRI/pVI,和MoaD及ThiS與mRI的融合表達載體MoaD-mRI/pVI及ThiS-mRI/pVI。其融合表達產(chǎn)物均含有氨基端聚組氨酸標簽。mRI是一個易于發(fā)生體內降解的蛋白質(葛瑩，等.中國生物工程雜志2010，30 :17-23)，便于觀察融合伴侶的效應。在TGl及BL21 (DE3) pLysS菌中經(jīng)IPTG誘導表達，Ub-mRI和Sumo-mRI除主要含有完整的融合表達產(chǎn)物外，均可見許多低分子量降解條帶；在Lon蛋白酶缺失的BL21 (DE3)pLysS菌中，產(chǎn)物降解有所減輕(圖3A-B)。MoaDiRI在兩個菌株的表達未見降解產(chǎn)物。ThiS-mRI表達后僅含有微量完整產(chǎn)物,而以低分子量降解產(chǎn)物為主(圖3C-D)。進一步觀察了 ThiS氨基半ThN，羧基半ThC片段，與mRI的融合表達。構建的載體ThN-mRI/pET28a和ThC-mRI/pVI，在大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS中誘導表達，其融合產(chǎn)物的降解明顯低于ThiS全分子融合產(chǎn)生的降解(圖4A)。而MoaD或ThiS與mRI羧基截短變異體AmRI融合時,表達載體MoaD-A mRI/pVI在大腸桿菌TGl和BL21(DE3)pLysS中的表達產(chǎn)物仍無明顯降解；ThiS_ AmRI/PVI的表達產(chǎn)物的降解，則明顯低于mRI全蛋白與ThiS融合產(chǎn)生的降解(圖4B)。說明目的蛋白的自身特性，決定其ThiS融合產(chǎn)物的體內可降解性。實施例2.融合伴侶ThiS與人胰島素A鏈的融合表達。人胰島素A鏈是含有21個氨基酸殘基的小分子多肽，需要以融合蛋白形式進行異源表達。構建了 ThiS和泛素融合的A鏈蛋白表達載體ThiS-A/pET28a和Ub_A/pET28a，以促進人胰島素A鏈表達并比較ThiS和泛素的融合伴侶作用。ThiS-A和Ub-A融合蛋白的理論計算分子量分別為13438和14561。在BL21 (DE3)pLysS菌IPTG誘導后，二者均產(chǎn)生預期大小的蛋白條帶，無明顯降解產(chǎn)物。但ThiS融合產(chǎn)物的產(chǎn)量明顯高于泛素融合產(chǎn)物(圖6)。實施例3.融合伴侶ThiS與人胰島素B鏈的融合表達。人胰島素B鏈是含有30個氨基酸殘基的小分子多肽，也需要以融合蛋白形式進行異源表達。構建了 ThiS和泛素融合的B鏈蛋白表達載體ThiS-B/pET28a和Ub_B/pET28a，以促進人胰島素B鏈表達并比較ThiS和泛素的融合伴侶作用。ThiS-B和Ub-B融合蛋白的理論計算分子量分別為14484和15607。在BL21 (DE3) pLysS菌IPTG誘導后，二者均產(chǎn)生預期大小的蛋白條帶，無明顯降解產(chǎn)物。但ThiS融合產(chǎn)物的產(chǎn)量明顯高于泛素融合產(chǎn)物(圖7)。實施例4.融合伴侶ThiS片段與人胰島素A鏈的融合表達。泛素片段有時也作為融合表達伴侶(Lehming. Brief Funct GenomicProteomic. 2002 ； I :230-8)。構建了 ThiS氨基半ThN，羧基半ThC片段，和泛素氨基半UbN 與人胰島素A鏈融合表達載體ThN-A/pET28a、ThC-A/pET28a和UbN_A/pET28a，他們表達產(chǎn)物的理論計算分子量分別為9814,9816和10268。在BL21 (DE3) pLysS菌IPTG誘導后，他們均產(chǎn)生預期大小的蛋白條帶，無明顯降解產(chǎn)物。幾種融合產(chǎn)物的產(chǎn)量基本相當(圖8)。實施例5.融合伴侶ThiS片段與人胰島素B鏈的融合表達。構建了 ThiS氨基半ThN，羧基半ThC片段，和泛素氨基半UbN與人胰島素B鏈融合表達載體ThN-B/pET28a、ThC-B/pET28a和UbN_B/pET28a，他們表達產(chǎn)物的理論計算分子量分別為 10860，10872 和 11313。在 BL21 (DE3)pLysS 菌 IPTG 誘導后，ThN-B/和 ThC-B 產(chǎn)生預期大小的蛋白條帶，UbN-B產(chǎn)物似低于分子量預期(圖9)。表達樣品經(jīng)質譜分子量測定驗證，ThN-B和ThC-B的分子量符合理論計算，而UbN-B的分子量明顯低于理論計算，說明其為降解產(chǎn)物。
權利要求
1.一個在宿主細胞中提高重組目的蛋白表達水平的方法，包括I)將編碼一種原核來源的泛素樣分子，或其結構上的類似物或衍生物、或其部分片段的核苷酸序列，連接到所述目的蛋白的核苷酸序列上，由此構建出編碼一個融合蛋白的核酸序列；2)將該核酸序列連接在合適的表達載體內；3)將含所述核酸序列的表達載體轉入所述的宿主細胞，通過所述的融合蛋白中出現(xiàn)所述的原核來源的泛素樣分子，或其結構上的類似物或衍生物、或其部分片段，來提高所述的目的蛋白在所述宿主細胞中的表達水平。
2.權利要求I所述原核來源的泛素樣分子，是硫轉運分子MoaD。
3.權利要求I所述原核來源的泛素樣分子，是硫轉運分子ThiS。
4.權利要求I所述原核來源的泛素樣分子，是大腸桿菌來源。
5.權利要求I所述的宿主細胞包括原核細胞和真核細胞。
6.權利要求5所述原核宿主細胞是大腸桿菌。
全文摘要
原核來源的泛素樣分子的應用，技術領域生物工程。本發(fā)明公開了一種提高重組目的蛋白表達水平的有效方法。通過將原核來源的泛素樣分子，特別是硫轉運分子MoaD或ThiS與目的蛋白的重組融合表達，可獲得較高水平的目的蛋白產(chǎn)物。
文檔編號C12N15/62GK102796752SQ20111013793
公開日2012年11月28日 申請日期2011年5月26日 優(yōu)先權日2011年5月26日
發(fā)明者王楠, 許建, 葛瑩 申請人:威志蘭斯醫(yī)學科技(北京)有限公司