專利名稱：用實(shí)時(shí)熒光定量pcr法檢測(cè)npm1基因突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因突變檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NPMl基因突變的引物、探針及方法。
背景技術(shù)：
核磷蛋白(nucleophosmin，NPM)基因位于人類染色體5q35，共包含12個(gè)外顯子。 通過RNA不同剪切形成3個(gè)mRNA和相應(yīng)蛋白產(chǎn)物，其中最長的mRNA (NM_002520)產(chǎn)生294 個(gè)氨基酸的蛋白產(chǎn)物，是NPMl最主要的類型。在NPMl基因突變?cè)谌考毙运栊园籽?(AML)病例中的檢出比例為25%至35%，在正常核型急性髓性白血病(AML-NK)中的檢出比例為45%至64%，在骨髓增生性疾病和髓系發(fā)育不良性疾病中也有發(fā)現(xiàn)。NPMl基因突變絕大多數(shù)發(fā)生在第12號(hào)外顯子，其中最常見的NPMl-mutationA，占NPMl基因突變的75%_80%， 其次是NPMl-mutationB，占NPMl基因突變的10%，NPMl-mutationD占5%，其它突變類型較少見。(突變類型DNA序列見表1)
大量研究表明，NPMl突變是AML預(yù)后相對(duì)較好的判斷指標(biāo)。NPMl突變AML患者的完全緩解(completeremission，CR)率明顯高于無NPMl突變的AML患者。N P M 1突變A M L患者無事件生存(e旻vent旻freesurViVal，EFS)、無復(fù)發(fā)生存(relapse旻 freesurvival, RFS)、無病生存(disease旻freesurvival, DFS)時(shí)間明顯延長和總生存率 (overallsurvival,0S)明顯增加，并且這些預(yù)后指標(biāo)與化療方案的選擇無關(guān)。NPMl突變是除細(xì)胞遺傳學(xué)、年齡和FLT3旻ITD突變之外獨(dú)立的影響預(yù)后的因素。目前檢測(cè)NPMl基因突變的方法主要有PCR后測(cè)序、PCR后dHPLC、FISH探針雜交法等。這些檢測(cè)方法的檢測(cè)能力一般在5%-20%。PCR后測(cè)序和PCR后dHPLC需要PCR后處理，步驟繁瑣，耗時(shí)長，容易污染。FISH雜交法操作步驟多，耗時(shí)長，檢測(cè)成本高。對(duì)白血病細(xì)胞的基因突變檢測(cè)由于外周血中癌細(xì)胞的突變DNA與大量正常細(xì)胞的野生型DNA共同存在，在需要極高的靈敏度同時(shí)要求很高的特異性，一般測(cè)序等檢測(cè)方法的檢測(cè)能力難以滿足要求。因此需要一種檢測(cè)能力強(qiáng)，檢測(cè)快速，成本低，操作簡便的檢測(cè)方法。本發(fā)明基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)速度快，全部檢測(cè)過程僅需2小時(shí)左右， 全部反應(yīng)在封閉的反應(yīng)管中完成，有效避免污染。每個(gè)樣品僅需進(jìn)行突變型和野生型兩個(gè)反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，操作簡便，與主流的實(shí)時(shí)熒光定量PCR平臺(tái)兼容，使用時(shí)無需添加新設(shè)備。提供1%突變質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，直接判斷有無NPMl基因突變，結(jié)果判讀直觀快速，無需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，減少了技術(shù)人員的工作強(qiáng)度和使用難度，尤其適合在臨床上廣泛使用。本發(fā)明可以對(duì)NPMl基因突變進(jìn)行高通量檢測(cè)，重復(fù)性好，靈敏度高，線性范圍寬，可以同時(shí)檢測(cè) NPMl-mutationA、NPMl-mutationB、NPMl-mutationD基因突變，能夠滿足臨床上快速檢測(cè)的要求。表1 NPMl-mutationA, NPMl-mutationB, NPMl-mutationdD 和野生型 NPMl 堿基序列特征。
權(quán)利要求
1.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NPMl基因突變的方法，其特征在于對(duì)每一個(gè)待測(cè)樣品分別用野生型PCR體系和突變型PCR體系進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，通過突變型PCR反應(yīng)和野生型PCR反應(yīng)的Ct值差異大小判斷樣品是否存在NPMl基因突變；所述的NPMl基因突變包含以下任意一種或任意組合的多種基因NPMl-mutationA，NPMl-mutationB, NPMl-mutationD ；其特征還在于采用針對(duì)NPMl基因突變的特異性寡核苷酸引物和/或針對(duì) NPMl基因的特異性寡核苷酸探針。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于包含針對(duì)NPMl基因突變的特異性寡核苷酸引物和針對(duì)NPMl野生型基因的寡核苷酸引物，包括如下序列NPMl-mutationA 正向引物:5，-GCTATTCAAGATCTCTGTCTG-3，，如 SEQ ID NO. 1 所示； NPMl-mutationB 正向引物5，-GCTATTCAAGATCTCTGCATG-3，，如 SEQ ID NO. 2 所示； NPMl-mutationD 正向引物:5，-GCTATTCAAGATCTCTGCCTG-3，，如 SEQ ID NO. 3 所示； NPMl-wild 正向引物5，-GCTATTCAAGATCTCTGGCAG-3，，如 SEQ ID NO. 4 所示； NPMl 反向引物5，- TCAAACACGGTAGGGAAAGT-3，，如 SEQ ID NO. 5 所示； 或者包含上述序列或其互補(bǔ)序列的向5’端或/和3’端延長的序列； 或者與上述序列或其互補(bǔ)序列的同源性大于85%的序列； 或者與上述序列的堿基互補(bǔ)序列； 或者使用上述序列中的任意一種或一種以上的組合。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征還在于包含針對(duì)NPMl基因突變的特異性寡核苷酸探針和針對(duì)NPMl野生型基因的寡核苷酸探針，探針5 ’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，優(yōu)選為FAM，探針 3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)，選自TAMRA或MBG)，寡核苷酸探針包括如下序列NPMl 探針5，熒光基團(tuán)-CAGTGGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAGTT -淬滅基團(tuán) 3，，如 SEQ ID NO. 6 所示；或者包含上述序列或其互補(bǔ)序列的向5’端或/和3’端延長的序列； 或者與上述序列或其互補(bǔ)序列的同源性大于85%的序列； 或者與上述序列的堿基互補(bǔ)序列。
4.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于包括以下步驟(1)提供權(quán)利要求2所述的引物和/或權(quán)利要求3所述探針；(2)待測(cè)樣品處理和模板提??；(3)使用權(quán)利要求2所述的引物和/或權(quán)利要求3所述探針擴(kuò)增檢測(cè)樣品中NPMl基因突變；(4)對(duì)每一個(gè)待測(cè)樣品分別用野生型PCR體系和突變型PCR體系進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，通過突變型PCR反應(yīng)和野生型PCR反應(yīng)的Ct值差異大小判斷樣品是否存在NPMl基因突變。
5.如權(quán)利要求4所述的步驟，其特征在于步驟(2)所述的待測(cè)樣品包括骨髓組織、全血、血漿、血清、分離的血細(xì)胞、甲醛固定或石蠟包埋等方法處理的病理組織及切片；樣品處理包括對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行RNA提取后反轉(zhuǎn)錄為cDNA或提取基因組DNA。
6.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)NPMl基因突變的方法，其特征在于權(quán)利要求2和權(quán)利要求 3所述的引物和探針根據(jù)檢測(cè)樣品的需要自由組合。
7.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)NPMl基因突變的方法，其特征在于使用權(quán)利要求2所述弓I物，采用SYBR GreenI等熒光染料產(chǎn)生熒光信號(hào)。
8.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)NPMl基因突變的方法，其特征在于采用突變型和野生型質(zhì)粒作為對(duì)照。
9.在急性髓系白血病和骨髓增生異常綜合癥的早期診斷、分類、治療方案確定以及預(yù)后判斷中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種引物特異熒光定量PCR檢測(cè)NMP1基因突變的方法和檢測(cè)試劑盒，特別涉及腫瘤組織以及腫瘤患者外周血清中NMP1基因突變的診斷。本試劑盒通過對(duì)NPM1基因12外顯子突變NPM1-mutationA、NPM1-mutationB、NPM1-mutationD以及NPM1野生型基因設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸引物序列和探針序列，對(duì)每一個(gè)待測(cè)樣品分別用野生型PCR體系和突變型PCR體系進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，通過突變型突變型PCR反應(yīng)和野生型PCR反應(yīng)的Ct值差異大小判斷樣品是否存在NPM1基因12外顯子突變NPM1-mutationA、NPM1-mutationB或NPM1-mutationD。本發(fā)明可以對(duì)NPM1基因突變進(jìn)行快速定性或者定量檢測(cè)，為急性髓系白血病(AML)和骨髓增生異常綜合癥(MDS)的診斷、治療方案確定以及預(yù)后判斷提供參考依據(jù)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102181564SQ201110121450
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月12日
發(fā)明者戰(zhàn)嬋 申請(qǐng)人:北京英茂盛業(yè)生物科技有限公司