專利名稱：胸腺上皮前體細胞的制備方法及其專用培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種胸腺上皮前體細胞的制備方法及其專用
培養(yǎng)基。
背景技術：
胸腺是誘導T細胞分化成熟的免疫器官，對于人體免疫系統(tǒng)正常機能的維持具有重要作用。許多與免疫系統(tǒng)相關的疾病都與胸腺能否誘導正常T細胞的形成密切相關。例如，DiGeorge綜合癥即是由于先天性胸腺發(fā)育不全導致的免疫缺陷病。通過異體胸腺移植能夠有效地治療這一疾病，在美國已有臨床應用。另一方面，胸腺還有誘導免疫耐受的重要功能，這對于異體器官移植以及基于細胞替換的治療具有極其重要的意義。目前異體器官移植大多需要在術后長期服用免疫抑制劑，由此也帶來一系列問題包括(一)長期抑制機體免疫功能會極大地增加致死性感染和腫瘤產(chǎn)生的風險；(二)大多數(shù)免疫抑制劑本身具有強烈的毒副作用；(三)多數(shù)免疫抑制劑價格十分昂貴，長期使用對病人而言成本過高。通過胸腺移植來誘導受體對異體或異種移植物產(chǎn)生免疫耐受，能夠有效擺脫長期使用免疫抑制劑帶來的一系列問題，具有極高的臨床應用價值。此外，人類青春期后隨著年齡的增長胸腺開始衰老，逐漸被脂肪組織所取代，未來年長且免疫能力低下的人也能受益于胸腺移植?？傊叵僖浦簿哂袕V闊的臨床應用前景。但是，胸腺本身作為一種器官，其來源受到極大的限制，如何獲得大量的胸腺組織用于臨床治療，是目前開展胸腺相關的臨床治療的主要問題。人胚胎干細胞由于具有可向人體三個胚層所有細胞類型的分化潛能以及在體外長期大量擴增的特點，為解決胸腺器官的來源問題提供了一種可能的解決方案。因此，通過人胚胎干細胞誘導分化獲得胸腺上皮細胞，具有十分重要的臨床應用價值。但是，目前仍然沒有人胚胎干細胞向胸腺誘導分化的報道。在胸腺移植臨床方案已相對成熟的情況下，有效的誘導人胚胎干細胞向胸腺分化的分化體系的建立是將胸腺移植應用于眾多臨床應用的主要瓶頸。通過模擬體內特定細胞或器官的發(fā)育途徑來實現(xiàn)全能干細胞的誘導分化，已經(jīng)在不同類型的細胞分化中都得以證明是一種極為成功的策略。胸腺的體內發(fā)育過程已經(jīng)在小鼠胚胎發(fā)育的研究中積累了一些線索。在小鼠胚胎發(fā)育Ell. 5天左右時，胸腺原基自內胚層的第三咽囊部位產(chǎn)生。在大約E12天左右，胸腺原基特化成一群上皮前體細胞，這群前體細胞未來會進一步分化形成構成胸腺的兩種細胞類型(皮質上皮細胞和髓質上皮細胞)，研究發(fā)現(xiàn)，僅單個胸腺上皮前體細胞就具有能夠重建整個胸腺的能力。在E13. 5天左右，胸腺的結構已經(jīng)基本形成。在這一系列發(fā)育過程中的關鍵基因和信號通路也已有一定程度的研究。例如，F(xiàn)oxnl是胸腺發(fā)育的關鍵基因。在小鼠中敲除了 Foxnl基因會導致胸腺的完 全缺失。但是，更為細節(jié)的胸腺發(fā)育過程，特別是人胸腺的發(fā)育過程的相關研究仍然匱乏。因此，建立人胚胎干細胞向胸腺細胞分化的誘導體系，對于體外研究人胸腺發(fā)育過程也具有極為重要的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種胸腺上皮前體細胞。本發(fā)明提供的胸腺上皮前體細胞，是由人胚胎干細胞或誘導的多潛能干細胞分化獲得的表達、上皮細胞粘附分子、細胞角蛋白5和細胞角蛋白8的胸腺上皮前體細胞，其具有增殖能力且向胸腺髓質上皮細胞和胸腺皮質上皮細胞分化和/或促進T細胞成熟的潛倉泛。
所述人胚胎干細胞為可從商業(yè)途徑獲得的人胚胎干細胞系。所述可從商業(yè)途徑獲得的人胚胎干細胞系為下述任一種細胞系BG01，BG02,BG03, BG04, SAOI, SA02, SA03, ES01, ES02, ES03, ES04, ES05, ES06, TE03, TE32, TE33, TE04,TE06, TE62, TE07, TE72, UCOI, UC06, WAOl，WA07, WA09, WA13 和 WA14 ;所述編號為 NIH 的編號。本發(fā)明的另一個目的是提供一種由人胚胎干細胞或誘導的多潛能干細胞分化制備所述胸腺上皮前體細胞的培養(yǎng)基，由細胞培養(yǎng)液I、細胞培養(yǎng)液II和細胞培養(yǎng)液III組成，所述細胞培養(yǎng)液I按照如下方法制備將谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巰基乙醇、活化素A和培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎培養(yǎng)基混合，得到培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎培養(yǎng)基、谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巰基乙醇和活化素A的配比為Iml (O. 005-0. 05)ml (O. 005-0. 05)ml (O. 0005-0. 005)ml (80-120)ng ；所述細胞培養(yǎng)液II按照如下方法制備將谷丙氨酸二肽、NEAA、2_巰基乙醇、視黃酸、IWP2和培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎培養(yǎng)基混合，得到培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎培養(yǎng)基、谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巰基乙醇、視黃酸和IWP2的配比為Iml (O. 005-0. 05)ml (O. 005-0. 05)ml (O. 0005-0. 005)ml (O. 8-1. 2) nmol (2. 3-2. 8) nmol ；IWP2 為一種 Wnt Inhibitor。所述細胞培養(yǎng)液III按照如下方法配制得到將谷丙氨酸二肽、NEAA、2_巰基乙醇、骨形成蛋白4、wnt3a和培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎培養(yǎng)基混合，得到培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎培養(yǎng)基、谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巰基乙醇、骨形成蛋白4和wnt3a的配比為 Iml (O. 005-0. 05) ml (O. 005-0. 05) ml (O. 0005-0. 005) ml (80-120)ng : (80-120)ng。所述細胞培養(yǎng)液I中，所述培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎培養(yǎng)基、谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巰基乙醇和活化素 A 的配比為 Iml O. Olml O. Olml O. OOlml IOOng ；所述細胞培養(yǎng)液II中，所述培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎培養(yǎng)基、谷丙氨酸二肽、NEM、2-巰基乙醇、視黃酸和 IWP2 的配比為 Iml O. Olml O. Olml O. OOlml Inmol 2. 5nmol ；所述細胞培養(yǎng)液III中，所述培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎培養(yǎng)基、谷丙氨酸二肽、NEM、2-巰基乙醇、骨形成蛋白4和wnt3a的配比為Iml O. Olml O. Olml O. OOlml 100ng : IOOng0所述培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎培養(yǎng)基為X-VIVO 10培養(yǎng)基。本發(fā)明的第三個目的是提供一種用所述培養(yǎng)基制備所述胸腺上皮前體細胞的方法，包括如下步驟I)將人胚胎干細胞或誘導的多潛能干細胞在所述培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)液I上培養(yǎng);2)步驟I)獲得的細胞在所述培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)液II上培養(yǎng)；3)步驟2)獲得的細胞在所述培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)液III上培養(yǎng)，得到胸腺上皮前體細胞。步驟I)中，所述培養(yǎng)時間為2. 5-3. 5天，所述培養(yǎng)時間具體為3天；步驟2)中，所述培養(yǎng)時間為2. 5-4天，所述培養(yǎng)時間具體為4天；
步驟3)中，所述培養(yǎng)時間為4. 5-5. 5天，所述培養(yǎng)時間具體為5天。所述人胚胎干細胞為可從商業(yè)途徑獲得的人胚胎干細胞系。所述可從商業(yè)途徑獲得的人胚胎干細胞系為下述任一種細胞系BG01，BG02,BG03, BG04, SAOI, SA02, SA03, ES01, ES02, ES03, ES04, ES05, ES06, TE03, TE32, TE33, TE04,TE06, TE62, TE07, TE72, UCOl，UC06, WAOl，WA07, WA09, WA13 和 WA14 ;所述編號為 NIH 的編號;所述的細胞、所述的方法或所述的培養(yǎng)基在制備胸腺髓質上皮細胞和胸腺皮質上皮細胞和/或促進T細胞成熟中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。所述T細胞為⑶4+T細胞。其中，所述人胚胎干細胞來源見表I。表I.可從商業(yè)途徑獲得的人胚胎干細胞系
提供者_提交編號NIH編號
BresaGen, Inc. hESBGN-01,BGOI,
hESBGN-02, BG02,_hESBGN-03,_BG03,
權利要求
1.胸腺上皮前體細胞，是由人胚胎干細胞或誘導的多潛能干細胞分化獲得的表達上皮細胞粘附分子、細胞角蛋白5和細胞角蛋白8的胸腺上皮前體細胞，其具有增殖能力且向胸腺髓質上皮細胞和胸腺皮質上皮細胞分化和/或促進T細胞成熟的潛能。
2.根據(jù)權利要求I所述的胸腺上皮前體細胞，其特征在于 所述人胚胎干細胞為可從商業(yè)途徑獲得的人胚胎干細胞系。
3.根據(jù)權利要求I或2所述的胸腺上皮前體細胞，其特征在于所述可從商業(yè)途徑獲得的人胚胎干細胞系為下述任一種細胞系BG01，BG02，BG03，BG04，SAOl，SA02，SA03，ESOl，ES02, ES03, ES04, ES05, ES06, TE03, TE32, TE33, TE04, TE06, TE62, TE07, TE72, UCOI, UC06,WAOl，WA07, WA09, WA13 和 WA14 ;所述編號為 NIH 的編號。
4.由人胚胎干細胞或誘導的多潛能干細胞分化制備權利要求I至3中任一所述胸腺上皮前體細胞的培養(yǎng)基，由細胞培養(yǎng)液I、細胞培養(yǎng)液II和細胞培養(yǎng)液III組成， 所述細胞培養(yǎng)液I按照如下方法制備將谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巰基乙醇、活化素A和培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎培養(yǎng)基混合，得到培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎培養(yǎng)基、谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巰基乙醇和活化素A的配比為Iml (O. 005-0. 05)ml (O. 005-0. 05)ml (O. 0005-0. 005)ml (80-120)ng ； 所述細胞培養(yǎng)液II按照如下方法制備將谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巰基乙醇、視黃酸、IWP2和培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎培養(yǎng)基混合，得到培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎培養(yǎng)基、谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巰基乙醇、視黃酸和IWP2的配比為Iml (O. 005-0. 05)ml (O. 005-0. 05)ml (O. 0005-0. 005)ml (O. 8-1. 2) nmol (2. 3-2. 8) nmol ； 所述細胞培養(yǎng)液III按照如下方法配制得到將谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巰基乙醇、骨形成蛋白4、wnt3a和培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎培養(yǎng)基混合，得到培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎培養(yǎng)基、谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巰基乙醇、骨形成蛋白4和wnt3a的配比為 Iml (O. 005-0. 05) ml (O. 005-0. 05) ml (O. 0005-0. 005) ml (80-120)ng : (80-120)ng。
5.根據(jù)權利要求4所述的培養(yǎng)基，其特征在于 所述細胞培養(yǎng)液I中，所述培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎培養(yǎng)基、谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巰基乙醇和活化素A的配比為Iml O. Olml O. Olml O. OOlml IOOng ； 所述細胞培養(yǎng)液II中，所述培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎培養(yǎng)基、谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巰基乙醇、視黃酸和 IWP2 的配比為 Iml O. Olml O. Olml O. OOlml Inmol 2. 5nmoI; 所述細胞培養(yǎng)液III中，所述培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎培養(yǎng)基、谷丙氨酸二肽、NEAA、2-巰基乙醇、骨形成蛋白4和wnt3a的配比為Iml O. Olml O. Olml O. OOlml IOOng IOOng0
6.根據(jù)權利要求4或5所述的培養(yǎng)基,其特征在于 所述培養(yǎng)哺乳動物細胞的基礎培養(yǎng)基為X-VIVO 10培養(yǎng)基。
7.一種用權利要求4-6中任一所述培養(yǎng)基制備所述胸腺上皮前體細胞的方法，包括如下步驟 I)將人胚胎干細胞或誘導的多潛能干細胞在權利要求4-6中任一所述培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)液I上培養(yǎng)；2)步驟I)獲得的細胞在權利要求4-6中任一所述培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)液II上培養(yǎng)； 3)步驟2)獲得的細胞在權利要求4-6中任一所述培養(yǎng)基中的細胞培養(yǎng)液III上培養(yǎng)，得到胸腺上皮前體細胞。
8.根據(jù)權利要求7所述的制備方法，其特征在于 步驟I)中，所述培養(yǎng)時間為2. 5-3. 5天，所述培養(yǎng)時間具體為3天； 步驟2)中，所述培養(yǎng)時間為2. 5-4天，所述培養(yǎng)時間具體為4天； 步驟3)中，所述培養(yǎng)時間為4. 5-5. 5天，所述培養(yǎng)時間具體為5天。
9.根據(jù)權利要求7或8所述的方法，其特征在于 所述人胚胎干細胞為可從商業(yè)途徑獲得的人胚胎干細胞系。
10.根據(jù)權利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述可從商業(yè)途徑獲得的人胚胎干細胞系為下述任一種細胞系BG01, BG02, BG03, BG04, SAOl，SA02, SA03, ESOl，ES02，ES03, ES04, ES05, ES06, TE03, TE32, TE33, TE04, TE06, TE62, TE07, TE72, UCOl，UC06, WAOl，WA07, WA09, WA13和WA14 ;所述編號為NIH的編號； 權利要求1_3中任一所述的細胞、權利要求6-9中任一所述的方法或權利要求4或5所述的培養(yǎng)基在制備胸腺髓質上皮細胞和胸腺皮質上皮細胞和/或促進T細胞成熟中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種胸腺上皮前體細胞的制備方法及其專用培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的胸腺上皮前體細胞，是由人胚胎干細胞或誘導的多潛能干細胞分化獲得的表達、Epcam、Cytokeratin 5和Cytokeratin 8的胸腺上皮前體細胞，其具有增殖能力且向胸腺髓質上皮細胞和胸腺皮質上皮細胞分化和/或促進T細胞成熟的潛能。本發(fā)明的實驗證明，在本發(fā)明中，通過體外誘導模擬體內胸腺發(fā)育過程的方法，首次建立了人胚胎干細胞向胸腺上皮前體細胞分化的分階段誘導體系。
文檔編號C12N5/078GK102732479SQ20111012124
公開日2012年10月17日 申請日期2011年5月11日 優(yōu)先權日2011年3月31日
發(fā)明者呂紅霞, 孫曉寧, 尹明, 徐君, 時艷, 苗振川, 鄧宏魁 申請人:北京大學, 北京瑞普晨創(chuàng)科技有限公司