專利名稱：D-氨甲酰水解酶的突變體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體內(nèi)容涉及D-氨甲酰水解酶的突變體及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
^ -內(nèi)酰胺類抗生素具有抗菌活力強，廣譜低毒等優(yōu)點，是臨床控制細(xì)菌感染的首選藥物之一。D-對羥基苯甘氨酸(DHPG)是合成該類藥物的一種重要中間體，用于制備羥氨芐青霉素和羥氨芐頭孢菌素的側(cè)鏈。D-對羥基苯甘氨酸的制備在工業(yè)上有化學(xué)合成法和酶法兩種方法，其中化學(xué)合成法成本高，污染大；而酶法具有成本較低、無污染的特點，因此日益受到重視。酶法的技術(shù)原理是D-乙內(nèi)酰脲酶(也稱為D-海因酶)將DL-對羥基苯海因不對稱水解為N-氨甲酰基-D-對羥基苯甘氨酸，然后在N-氨甲酰-D-氨基酸水解酶(也稱為D-氨甲酰水解酶，簡稱DCase)的作用下，將N-氨甲酰基-D-對羥基苯甘氨酸 不可逆水解轉(zhuǎn)變成DHPG。工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)在兩步酶法生產(chǎn)D-對羥基苯甘氨酸的過程中，由于DCase催化效率低、穩(wěn)定性差的缺點，導(dǎo)致中間物N-氨甲?；?D-對羥基苯甘氨酸大量積累，終產(chǎn)物D-對羥基苯甘氨酸產(chǎn)率低。因此DCase成為兩步酶法反應(yīng)系統(tǒng)中的一個關(guān)鍵酶、限速酶。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的日臻成熟，將DCase基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行過量表達(dá)，從而獲得高表達(dá)、高活力的基因工程菌株成為可能。例如，許禎等從一株能將DL-對羥基苯海因轉(zhuǎn)化為D-對羥基苯甘氨酸的菌株中，成功克隆出DCase基因，Genbank索取號為AF320814 (許禎等，生物工程學(xué)報，2002，18 (2) 149-54)。本發(fā)明人的實驗室在將DCase基因構(gòu)建入pET表達(dá)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化E. coli過量表達(dá)后，對目的蛋白的活性和表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示E. coli可以大量表達(dá)出重組蛋白，但是70-80%左右的重組蛋白是以包涵體的形式存在，嚴(yán)重影響了該酶的功能發(fā)揮。如何使更多的目的蛋白表達(dá)后能夠正確折疊成為有活力的蛋白成為研究和努力的方向。前期對DCase的研究表明，其18位和30位殘基的疏水性對目的蛋白的可溶性有較大影響，分別將這兩個位點突變?yōu)槭杷圆煌陌被?A18Y、A18N、A18D、A18E ;Y30E、Y30D)，可溶性有進(jìn)一步提高。雖然天然酶分子在自然條件下已經(jīng)進(jìn)化了千百萬年，但是因為天然酶分子存在的環(huán)境與實際應(yīng)用的環(huán)境不同，酶分子仍然蘊藏著巨大的進(jìn)化潛力。運用定點突變技術(shù)等對微生物來源的酶進(jìn)行分子改造和人工進(jìn)化在近些年中取得了令人矚目的進(jìn)展(參見王正祥等，生物工程學(xué)報，16 (3)，2000)，已經(jīng)成為酶的人工工程改造的常用手段。這種分子水平上的改造技術(shù)是通過體外定點突變來改造靶基因，從而創(chuàng)造具有新功能的改性的酶，大大加速了蛋白質(zhì)的進(jìn)化進(jìn)程。因此，本領(lǐng)域有必要進(jìn)一步改進(jìn)天然的酶分子，以期更大限度地提高酶的表達(dá)以及酶活力
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種D-氨甲酰水解酶的突變體及其制備方法和應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種突變型D-氨甲酰水解酶，其對應(yīng)于SEQ ID NO 2氨基酸序列的第18位由丙氨酸(A)突變?yōu)楣劝彼?E)，第30位酪氨酸(Y)突變?yōu)樘於彼?D)，第34位賴氨酸(K)突變?yōu)楣劝彼?E)。在另一優(yōu)選例中，所述的突變型D-氨甲酰水解酶是(a)具有SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列的蛋白；或(b)由(a)所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個(如1-20個 ’較 佳地1-10個；更佳地1-5個；更佳地1-3個)氨基酸且保留(a)蛋白活性的由(a)衍生的蛋白；且該蛋白的氨基酸序列中對應(yīng)于SEQ ID NO 3第18位上的氨基酸為谷氨酸，對應(yīng)于SEQ ID NO 3第30位上的氨基酸為天冬氨酸，對應(yīng)于SEQ ID NO 3第34位上的氨基酸為
谷氨酸。在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，該多核苷酸選自下組⑴編碼所述的突變型D-氨甲酰水解酶的多核苷酸；或(ii)與(i)中的多核苷酸互補的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO :3所示氨基酸序列的突變型D-氨甲酰水解酶。在本發(fā)明的另一方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。在本發(fā)明的另一方面，提供一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，它含有所述的載體，或基因組中整合有所述的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞；在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在本發(fā)明的另一方面，提供一種生產(chǎn)突變型D-氨甲酰水解酶的方法，包括步驟(I)培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞，獲得培養(yǎng)物；和(2)從培養(yǎng)物中分離突變型D-氨甲酰水解酶。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的突變型D-氨甲酰水解酶的用途，用于生產(chǎn)D-對
輕基苯甘氨酸。在本發(fā)明的另一方面，提供一種生產(chǎn)D-對羥基苯甘氨酸的方法，所述的方法包括利用所述的突變型D-氨甲酰水解酶水解N-氨甲酰-D-對羥基苯甘氨酸，獲得D-對羥基苯甘氨酸。在另一優(yōu)選例中，所述的方法包括培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞產(chǎn)生突變型D-氨甲酰水解酶，該突變型D-氨甲酰水解酶水解N-氨甲酰-D-對羥基苯甘氨酸，獲得D-對羥基苯甘氨酸。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過長期的研究，獲得了一種突變型D-氨甲酰水解酶，所述的突變型D-氨甲酰水解酶在保持催化產(chǎn)物不變的情況下，單位發(fā)酵菌體酶活性大幅度提高，可溶性表達(dá)能力也顯著提高。
本發(fā)明的多肽(突變型D-氨甲酰水解酶)可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括突變型D-氨甲酰水解酶的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的突變型D-氨甲酰水解酶相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文 的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。在本發(fā)明中，術(shù)語“突變型D-氨甲酰水解酶”或“突變型D-氨甲酰水解酶蛋白”指具有突變型D-氨甲酰水解酶活性的SEQ ID NO :3序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與突變型D-氨甲酰水解酶相同功能的、SEQ ID NO :3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-20個，最佳地1-10個，還更佳如1-8個、1-5個、1-3個、或1-2個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括突變型D-氨甲酰水解酶的活性片段和活性衍生物。但是，這些變異形式中，對應(yīng)于SEQ IDNO 2氨基酸序列的第18位為谷氨酸(E)，第30位為天冬氨酸(D)，第34位為谷氨酸(E)。多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與所述的突變型D-氨甲酰水解酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗突變型D-氨甲酰水解酶的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含突變型D-氨甲酰水解酶或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了突變型D-氨甲酰水解酶蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有突變型D-氨甲酰水解酶序列的至少約20個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。發(fā)明還提供突變型D-氨甲酰水解酶或多肽的類似物。這些類似物與所述的突變型D-氨甲酰水解酶的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。但是，這些多肽類似物中，對應(yīng)于SEQ IDNO 2氨基酸序列的第18位為谷氨酸(E)，第30位為天冬氨酸(D)，第34位為谷氨酸(E)。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，“突變型D-氨甲酰水解酶的保守性變異多肽”指與SEQ ID NO 3的氨基酸序列相比，有至多20個，較佳地至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個(如I個、2個或3個)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表I進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。這些保守性變異多肽中，對應(yīng)于SEQ ID NO: 2氨基酸序列的第18位為谷氨酸(E)，第30位為天冬氨酸(D)，第34位為谷氨酸(E)。表I
權(quán)利要求
1.一種突變型D-氨甲酰水解酶，其對應(yīng)于SEQ ID NO :2氨基酸序列的第18位由丙氨酸突變?yōu)楣劝彼幔?0位酪氨酸突變?yōu)樘於彼?，?4位賴氨酸突變?yōu)楣劝彼帷?br> 2.如權(quán)利要求I所述的突變型D-氨甲酰水解酶，其特征在于，其是 (a)具有SEQID NO :3所不的氣基酸序列的蛋白；或 (b)由(a)所示的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且保留(a)蛋白活性的由(a)衍生的蛋白；且該蛋白的氨基酸序列中對應(yīng)于SEQ ID NO :3第18位上的氨基酸為谷氨酸，對應(yīng)于SEQ ID NO :3第30位上的氨基酸為天冬氨 酸，對應(yīng)于SEQ ID NO :3第34位上的氨基酸為谷氨酸。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸選自下組 (i)編碼權(quán)利要求I或2所述的突變型D-氨甲酰水解酶的多核苷酸；或 (ii)與(i)中的多核苷酸互補的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQID NO:3所示氨基酸序列的突變型D-氨甲酰水解酶。
5.—種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3或4所述的多核苷酸。
6.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求5所述的載體，或基因組中整合有權(quán)利要求3或4所述的多核苷酸。
7.—種生產(chǎn)突變型D-氨甲酰水解酶的方法，其特征在于，包括步驟 (1)培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，獲得培養(yǎng)物；和 (2)從培養(yǎng)物中分離突變型D-氨甲酰水解酶。
8.權(quán)利要求I所述的突變型D-氨甲酰水解酶的用途，用于生產(chǎn)D-對羥基苯甘氨酸。
9.一種生產(chǎn)D-對羥基苯甘氨酸的方法，其特征在于，所述的方法包括利用權(quán)利要求I所述的突變型D-氨甲酰水解酶水解N-氨甲酰-D-對羥基苯甘氨酸，獲得D-對羥基苯甘氨酸。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞產(chǎn)生突變型D-氨甲酰水解酶，該突變型D-氨甲酰水解酶水解N-氨甲酰-D-對羥基苯甘氨酸，獲得D-對輕基苯甘氨酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及D-氨甲酰水解酶的突變體及其制備方法和應(yīng)用。首次獲得了一種突變型D-氨甲酰水解酶，所述的突變型D-氨甲酰水解酶在保持催化產(chǎn)物不變的情況下，單位菌體酶活性大幅度提高，可溶性表達(dá)能力也顯著提高。
文檔編號C12N15/63GK102747060SQ20111010327
公開日2012年10月24日 申請日期2011年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月22日
發(fā)明者姜世民, 姜衛(wèi)紅, 楊晟, 楊蘊劉, 蔡淵恒, 顧陽 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院