專利名稱：大鼠GSK-3β目的基因過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建與鑒定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及大鼠GSK-3 β目的基因過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建方法，以及大鼠GSK-3 β目的基因過表達(dá)慢病毒載體鑒定方法。。
背景技術(shù)：
GSK-3 β 的全稱為 glycogen synthase kinase-3 β，GSK-3 β，即糖原合成酶激酶-3 β，是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛存在于各種細(xì)胞，是一個(gè)構(gòu)成多功能表達(dá)的酶。 GSK-3 β開始被僅被發(fā)現(xiàn)參與肌肉能量的儲(chǔ)存和新陳代謝，但隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)該酶不但作用于Wnt、Notch和hedgehog、胰島素信號傳導(dǎo)等多條細(xì)胞信號通路，而且在細(xì)胞凋亡、基因表達(dá)、細(xì)胞增殖與分化、腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移、糖尿病的發(fā)生與發(fā)展等方面都起著重要的調(diào)節(jié)作用。鑒于GSK_3i3在許多疾病如糖尿病，腫瘤，雙相情感障礙及老年癡呆癥和一些其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生、進(jìn)展的影響，對其研究也越來越成為焦點(diǎn)。隨著對疾病分子機(jī)制認(rèn)識的加深及生物技術(shù)的發(fā)展，基因治療已成為治療感染性疾病、遺傳疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及腫瘤的新焦點(diǎn)。用于基因治療的載體系統(tǒng)可分為病毒性載體和非病毒性載體兩類。目前常用的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、皰疹病毒載體、痘苗病毒載體等，但是這些載體均存在不足之處，嚴(yán)重影響了基因治療的有效性及安全性。在基因治療中廣泛應(yīng)用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體存在的主要問題， 是無法高效轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂期細(xì)胞，而腺病毒載體雖然能轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂期細(xì)胞，但在體內(nèi)不能實(shí)現(xiàn)目的基因穩(wěn)定的長期表達(dá)，且反復(fù)應(yīng)用容易引起免疫反應(yīng)。慢病毒載體不但可以感染非分裂期細(xì)胞，還具有容納外源性目的基因片段大、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，在基因治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述的存在的技術(shù)缺陷，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種大鼠GSK-3 β 目的基因過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建方法以及根據(jù)這種構(gòu)建方法獲得的大鼠GSK-3 β目的基因過表達(dá)慢病毒載體，本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供大鼠GSK-3 β目的基因過表達(dá)慢病毒載體的鑒定方法，使人們更加深入了解GSK-3 β的作用機(jī)理，為相關(guān)疾病的細(xì)胞治療和基因治療打下基礎(chǔ)。為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
一種大鼠GSK_3i3目的基因過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建，該構(gòu)建方法包括以下步驟， ①慢病毒載體的酶切線性化慢病毒載體采用PGC-FU載體，用限制性內(nèi)切酶Age I酶切消化慢病毒載體PGC-FU，回收pGC-FU片段。慢病毒載體的酶切反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建大鼠GSK-3i3目的基因過表達(dá)慢病毒載體改造用DNA序列，其特征在于 所述的DNA序列包括GSK-3 β目的基因的DNA序列，GSK-3 β目的基因序列如序列1所示。
2.用于構(gòu)建大鼠GSK-3i3目的基因過表達(dá)慢病毒載體的載體，其特征在于所述的質(zhì)粒載體采用PGC-FU載體，所述的pGC-FU載體含有EGFP基因。
3.用于大鼠GSK-3i3目的基因過表達(dá)慢病毒載體的目的質(zhì)粒包裝用慢病毒載體，其特征在于該慢病毒載體系統(tǒng)由PGC-LV載體、pHelper 1. 0載體和pHelper 2. 0載體三質(zhì)粒構(gòu)成，所述的PGC-LV載體帶有GFP標(biāo)記。
4.一種大鼠GSK-3i3目的基因過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建，其特征在于該構(gòu)建方法包括使用Age I酶消化權(quán)利要求2所述的載體pGC-FU的DNA，設(shè)計(jì)含Age I酶切位點(diǎn)的基因引物，采用PCR方法從權(quán)利要求1所述的改造用DNA序列中釣取GSK-3 β目的基因，將GSK-3 β 目的基因PCR產(chǎn)物與酶切線性化的載體進(jìn)行定向交換連接，并將其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞、 抽提和純化，再進(jìn)行PCR鑒定，獲得構(gòu)建的目的質(zhì)粒，最后將構(gòu)建好的目的質(zhì)粒利用如權(quán)利要求3所述的慢病毒載體進(jìn)行慢病毒質(zhì)粒包裝，最后進(jìn)行超純?nèi)?nèi)毒素抽取，構(gòu)建圖見圖 4。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的大鼠GSK-3i3目的基因過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建，其特征在于該構(gòu)建方法包括以下步驟①慢病毒質(zhì)粒載體的酶切線性化慢病毒載體采用PGC-FU載體，用限制性內(nèi)切酶AgeI 酶切消化慢病毒載體PGC-FU，回收pGC-FU片段；②引物合成合成2條引物，序列如下引物名稱引物序列Gsk3b-AgeI-FGAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGTCGGGGCGACCGAGAACCGsk3b-Agel-RTCACCATGGTGGCGACCGGGGTAGAGTTGGAGGCTGATG引物Gsk3b-Age I-F中含有交換配對堿基，ACCGGT為Age I酶切位點(diǎn)，CGCCACC為表達(dá)增強(qiáng)序列，引物Gsk3b- Age I-R中含有交換配對堿基，ACCGG為Age I酶切位點(diǎn)，③目的基因片段的獲取采用含有GSK-3β目的基因的DNA序列的基因片段，用 Gsk3b-Age I-F和Gsk3b_ Age I-R釣取GSK-3 β目的基因，對釣取的GSK-3 β目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR產(chǎn)物；④GSK-3i3目的基因過表達(dá)慢病毒載體的目的質(zhì)粒的構(gòu)建將含有GSK-3β目的基因的 PCR產(chǎn)物純化，再將純化后的PCR產(chǎn)物與酶切線性化的慢病毒載體進(jìn)行定向交換，將交換產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，抽取和提純，挑選轉(zhuǎn)化子繼續(xù)培養(yǎng)；⑤GSK-3β目的基因表達(dá)慢性病毒載體目的質(zhì)粒的檢測對長出的克隆體進(jìn)行后續(xù)的 PCR鑒定需合成3條檢測用引物引物名稱引物序列Gsk3b-SEQFCGCACTGTGTAGCCGTCTCCEGFP-N-RCGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGUbi-FGGGTCAATATGTAATTTTCAGTGPCR檢測呈陽性即可初步判斷為轉(zhuǎn)化克隆，對PCR呈陽性的克隆進(jìn)行DNA測序； ⑥GSK-3 β目的基因表達(dá)慢性病毒載體目的質(zhì)粒的包裝制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質(zhì)粒PGC-LV載體及其兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒pHelper 1. 0載體和pHelper 2. 0 載體，三種質(zhì)粒載體分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提，并進(jìn)行共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)，收獲和濃縮，對其濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液，在293T細(xì)胞中測定并標(biāo)定病毒滴度。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的大鼠GSK-3β目的基因過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建，其特征在于所述的GSK-3i3目的基因過表達(dá)慢病毒載體的目的質(zhì)粒的構(gòu)建中，GSK-3 β目的基因 PCR產(chǎn)物與酶切線性化的載體進(jìn)行定向交換連接于25的溫度下進(jìn)行，交換酶為In-Fusion 交換酶，交換反應(yīng)時(shí)間為30分鐘，完成后再于42°C的溫度下反應(yīng)15分鐘，制備得到交換液。
7.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的大鼠GSK-3β目的基因過表達(dá)慢病毒載體構(gòu)建，其特征在于所述的GSK-3i3目的基因過表達(dá)慢病毒載體的目的質(zhì)粒的構(gòu)建中，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞由CaCl2制備得到，交換產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞包括將含有交換產(chǎn)物的交換液加入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，均勻混合內(nèi)容物，在冰中放置30分鐘，再將混合物進(jìn)行42°C的水浴，取出靜置90秒后將混合物快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻1 2分鐘，加入SOOul的LB培養(yǎng)基，在37°C搖床上復(fù)蘇45分鐘；將150 μ 1轉(zhuǎn)移到AMP抗性的LB瓊脂培養(yǎng)基上，置于溫室至液體被吸收，再于37°C培養(yǎng)培養(yǎng)16小時(shí)，挑選轉(zhuǎn)化子，重新培養(yǎng)。
8.一種大鼠GSK-3i3目的基因過表達(dá)慢病毒載體，其特征在于該載體由權(quán)利要求4 或5所述的方法構(gòu)建獲得。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求4或5構(gòu)建方法得到的大鼠GSK-3i3目的基因過表達(dá)慢病毒載體的鑒定，其特征在于該鑒定方法將大鼠GSK-3 β目的基因過表達(dá)慢病毒載體、空病毒載體和生理鹽水分別轉(zhuǎn)染大鼠WB-F344細(xì)胞，達(dá)到最佳感染復(fù)數(shù)后，在熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白的表達(dá)，采用Western Blot的方法檢測目的基因的表達(dá)情況，提取蛋白，利用BCA法蛋白定量蛋白濃度，對不同組濃度的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，分析結(jié)果。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的大鼠GSK-3i3目的基因過表達(dá)慢病毒載體的鑒定，其特征在于該鑒定方法包括以下步驟①轉(zhuǎn)染大鼠WB-F344細(xì)胞轉(zhuǎn)染前，用胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，待待細(xì)胞密度達(dá)70% 80%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染時(shí)，分別用生理鹽水、空病毒載體和大鼠GSK-3i3目的基因過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染大鼠WB-F344細(xì)胞，分別編號為1#、2#和3# ； 轉(zhuǎn)染后在熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白的表達(dá)；②WesternBlot檢測目的基因的表達(dá)達(dá)到最佳感染復(fù)數(shù)后，首先提取細(xì)胞總蛋白，測蛋白濃度，將每個(gè)樣品的蛋白最終濃度調(diào)整為2 μ g/ μ 1 ；對每個(gè)樣品取相同總蛋白量，加入上樣緩沖液，制成上樣樣品，再進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)束后進(jìn)行免疫印跡和免疫顯色。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大鼠GSK-3β目的基因過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建，利用PCR方法釣取GSK-3β目的基因，將GSK-3β目的基因與酶切線性化的載體進(jìn)行定向交換，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，對長出的克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，再對PCR鑒定陽性的克隆測序；本發(fā)明還公開了一種大鼠GSK-3β目的基因過表達(dá)慢病毒載體的鑒定，將目的基因過表達(dá)慢病毒載體、空病毒載體和生理鹽水轉(zhuǎn)染大鼠WB-F344細(xì)胞，達(dá)到最佳感染復(fù)數(shù)后，在觀察熒光蛋白的表達(dá)，采用WesternBlot檢測表達(dá)情況。本發(fā)明將使我們深入了解GSK-3β在機(jī)體及其相關(guān)疾病中的作用機(jī)制，更好了解這些疾病的發(fā)病機(jī)理，為其在未來的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/68GK102212535SQ201110088018
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月8日
發(fā)明者單云峰, 謝元康 申請人:單云峰