專利名稱：提高膜蛋白檢測率的膜蛋白多肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物檢測技術(shù)領(lǐng)域的制備方法，具體地說，是一種提高膜蛋白檢測率的膜蛋白多肽的制備方法。
背景技術(shù)：
細胞膜是細胞形態(tài)的基礎(chǔ)，細胞與外界環(huán)境的屏障。膜蛋白是細胞內(nèi)外物質(zhì)、能量和信息傳遞的橋梁，承擔(dān)著重要的生物學(xué)功能。因此細胞膜膜蛋白分析是研究健康與疾病、 環(huán)境變化、基因異常等科學(xué)問題的基礎(chǔ)。膜蛋白組學(xué)作為比較新的技術(shù)，在揭示細胞功能， 解釋基本生物學(xué)問題和發(fā)現(xiàn)新藥物靶點等方面的研究中都有廣泛應(yīng)用。特別是質(zhì)譜和液質(zhì)聯(lián)用等分析手段在蛋白組學(xué)研究領(lǐng)域的使用，使得復(fù)雜生物樣品的組學(xué)分析逐漸走向高通量、高精度和高分辨率。由于膜蛋白在水溶液中溶解度差，容易形成膠束，加上豐度低，容易被高豐度的胞質(zhì)蛋白和內(nèi)膜系統(tǒng)蛋白污染，既堵塞質(zhì)譜分析通道能力，又成為膜蛋白分析信號的高背景噪音。質(zhì)譜分析前對膜蛋白樣品進行純化富集和直接從實驗材料中制備膜多肽是比較新穎的思路。Rodriguez-Ortega等人首先提出“Cell Shave”策略，用酶切下暴露在細胞膜材料表面的蛋白片段用于MS/MS分析，可提供細胞表面蛋白信息，避免溶解疏水蛋白的復(fù)雜操作(Nature Biotechnology，2006，24，191-197)。但在實際操作中很難保持細胞在酶解過程和后續(xù)離心操作中的完整性，不能避免胞質(zhì)蛋白的污染。改良的方法之一是先提取細胞膜，再進行蛋白 Shaving (Analytical Chemistry 2007，79，4613-4620)。雖然該實驗效果有所提高，但是操作步驟也更加復(fù)雜。可見，目前基于質(zhì)譜檢測的膜蛋白組學(xué)樣品預(yù)處理方法或不能有效避免細胞質(zhì)蛋白污染，或操作復(fù)雜、重復(fù)性低。因此，有必要開發(fā)一種操作簡便快捷，有效降低細胞質(zhì)蛋白多肽的影響，提高復(fù)雜樣品中膜蛋白的質(zhì)譜檢測率和膜蛋白鑒定結(jié)果可靠性的樣品預(yù)處理方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服復(fù)雜細胞膜蛋白質(zhì)譜分析預(yù)處理中的技術(shù)難題，提供一種提高膜蛋白檢測率的膜蛋白多肽的制備方法。本發(fā)明是細胞膜蛋白在LC-MS/MS檢測前的預(yù)處理方法，將胞質(zhì)蛋白整體凝固，再進行細胞膜蛋白酶切處理制備肽段，降低了胞質(zhì)蛋白肽段的產(chǎn)率和MS/MS信號水平，從而提高膜蛋白的檢測率。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明包括步驟如下第一步，交聯(lián)固化細胞質(zhì)蛋白首先用戊二醛溶液處理完整細胞，使細胞質(zhì)蛋白相互交聯(lián)形成致密固體，離心收集戊二醛交聯(lián)固化細胞；所述的戊二醛溶液，是指體積比0. 1% -1%的戊二醛溶液；所述的戊二醛溶液，配制方法為戊二醛溶液配制25%戊二醛4ml，生理鹽水57. 6ml，去離子水 32ml，0· 15M Na2HP046. 5ml，用 0· 15M KH2PO4 調(diào) pH 到 8. 2 ；所述的處理完整紅細胞，其處理方法為紅細胞泥在冰浴中加入預(yù)冷的戊二醛溶液，紅細胞終濃度為2%;反應(yīng)溫度從4°C -37°c，反應(yīng)時間為30min以上。反應(yīng)結(jié)束后IOOOg 離心5min，棄上清，用生理鹽水洗滌5次，得到棕紅色細胞泥，即為戊二醛交聯(lián)固化蛋白的細胞；所述的交聯(lián)，其反應(yīng)溫度為4°C _37°C，反應(yīng)時間為30min以上。第二步，用蛋白酶解反應(yīng)溶液懸浮戊二醛交聯(lián)固化細胞，加入蛋白酶進行酶解反應(yīng)；所述的酶解反應(yīng)所使用的酶包括胰蛋白酶和蛋白內(nèi)切酶GluC。第三步，收集酶解多肽，進行除鹽和富集，制備脫鹽酶解多肽；所述的收集酶解多肽，其方法為先在4°C、IOOOg離心lOmin，去除殘留細胞，再在 4°C、1745g離心IOmin去除細胞殘渣，收集含有多肽片段的上清液。第四步，用酶解多肽直接做LC-MS/MS檢測，分析所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)，獲得所需要的膜蛋白多肽。本發(fā)明將膜蛋白實驗材料的準備步驟充分簡化，省略了細胞膜的提取、膜蛋白的提取等復(fù)雜的提取步驟，直接獲得可溶性的酶切肽段用于質(zhì)譜分析，同時也省去了一般混合蛋白做質(zhì)譜分析前的預(yù)處理步驟。本實驗成本低，耗時短。膜蛋白組學(xué)分析結(jié)果比對照組得到更多膜蛋白信息，并且以功能蛋白為主，達到預(yù)期目的。本發(fā)明中以紅細胞為模型，使用戊二醛為交聯(lián)劑處理完整紅細胞，使胞質(zhì)蛋白交聯(lián)固化，用蛋白酶直接酶切細胞表面的蛋白，富集酶解肽段后直接進行LC-MS/MS分析。本發(fā)明能夠快速獲得更多、更可靠膜蛋白多肽的信息。
具體實施例方式以下對本發(fā)明的實施例作詳細說明以下實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例，如使用不同試劑作為交聯(lián)劑，或者使用不同濃度的戊二醛溶液，或者使用不同的蛋白酶，或者處理不同來源的細胞等，這些等價形式同樣屬于本發(fā)明的范圍。下面實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1昆明鼠(雄性，體重250-300克，購自上海斯萊克實驗動物中心)眼眶取血，接收入事先裝有2%草酸鉀溶液的試管中，迅速混勻。4°C IOOOg離心5min，用吸管吸去上清液和紅細胞上層的白細胞薄膜。用兩倍體積的生理鹽水將沉淀的紅細胞慢慢混合均勻， 再次4°C IOOOg離心5min，棄上清，加生理鹽水混勻，如此反復(fù)離心4 5次。最后一次離心后的紅細胞，棄上清，即為洗滌過的紅細胞體。吸取紅細胞50 μ 1在冰浴中加入預(yù)冷的戊二醛溶液2450 μ 1 (紅細胞終濃度為2% )，于4°C環(huán)境下緩慢旋轉(zhuǎn)反應(yīng)0. 5小時。 反應(yīng)結(jié)束后，4°C IOOOg離心5min。沉淀細胞用生理鹽水同法洗滌3次。得到戊二醛交聯(lián)的紅細胞體。取未經(jīng)處理的紅細胞、戊二醛交聯(lián)的紅細胞各10μ 1(約8.7X107 個)，加 490μ1 IOmmol PBS (ρΗ7. 4)，加 10 μ 1 0. 1 μ g/μ 1 測序級胰蛋白酶。37°C 烘箱中酶解2小時。收集酶解多肽，用C18Zip-tips槍頭(Millipore Corp.)除鹽和富集多肽。樣品凍干后用于LC-LTQ(Michrom LC ；Thermofisher LTQ XL)分析。所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用 SEQUEST(v28, Bioworks 3. 3 software package, Thermo Electron)進行數(shù)據(jù)庫搜索；FilterI 設(shè)置為 Δ Cn > = 0. 100 ；Xcorr (士 1，2，3) = 1. 90，2. 20，3. 75 ；#matches = 1 ； peptide probability <= le-003 ;#different peptide > = 2 ；Filter II 設(shè)置為 ACn > =0. 100 ；Xcorr (士 1，2，3) = 1. 90,2. 20,3. 75 ；#matches = 1 ；peptide probability < = le-003。結(jié)果戊二醛交聯(lián)處理的樣品中檢測到更多膜多肽、膜蛋白。表1顯示了戊二醛交聯(lián)前后檢測到的膜多肽和膜蛋白的數(shù)量與比例表 權(quán)利要求
1.一種提高膜蛋白檢測率的膜蛋白多肽的制備方法，其特征在于，包括如下步驟第一步，交聯(lián)固化細胞質(zhì)蛋白首先用戊二醛溶液處理完整細胞，使細胞質(zhì)蛋白相互交聯(lián)形成致密固體，離心收集戊二醛交聯(lián)固化細胞；第二步，用蛋白酶解反應(yīng)溶液懸浮戊二醛交聯(lián)固化細胞，加入蛋白酶進行酶解反應(yīng)；第三步，收集酶解多肽，進行除鹽和富集，制備脫鹽酶解多肽；第四步，用酶解多肽直接做LC-MS/MS檢測，分析所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)，獲得所需要的膜蛋白多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高膜蛋白檢測率的膜蛋白多肽的制備方法，其特征是，第一步，交聯(lián)固化細胞質(zhì)蛋白首先用戊二醛溶液處理完整細胞，使細胞質(zhì)蛋白相互交聯(lián)形成致密固體，離心收集戊二醛交聯(lián)固化細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高膜蛋白檢測率的膜蛋白多肽的制備方法，其特征是，第一步中所述的戊二醛溶液，是指體積比0. 1% -1%的戊二醛溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或者3所述的提高膜蛋白檢測率的膜蛋白多肽的制備方法，其特征是，所述的戊二醛溶液，配制方法為戊二醛溶液配制25%戊二醛4ml，生理鹽水 57. 6ml，去離子水 32ml, 0. 15M Na2HP046. 5ml，用 0. 15M KH2PO4 調(diào) pH 到 8. 2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高膜蛋白檢測率的膜蛋白多肽的制備方法，其特征是，第一步中所述的處理完整紅細胞，其處理方法為紅細胞泥在冰浴中加入預(yù)冷的戊二醛溶液， 紅細胞終濃度為2%;反應(yīng)溫度從4°C _37°C，反應(yīng)時間為30min以上；反應(yīng)結(jié)束后IOOOg離心5min，棄上清，用生理鹽水洗滌5次，得到棕紅色細胞泥，即為戊二醛交聯(lián)固化蛋白的細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高膜蛋白檢測率的膜蛋白多肽的制備方法，其特征是，第一步中所述的交聯(lián)，其反應(yīng)溫度為4°C _37°C，反應(yīng)時間為30min以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高膜蛋白檢測率的膜蛋白多肽的制備方法，其特征是，第二步中所述的酶解反應(yīng)所使用的酶包括胰蛋白酶和蛋白內(nèi)切酶GluC。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高膜蛋白檢測率的膜蛋白多肽的制備方法，其特征是，第三步中所述的收集酶解多肽，其方法為先在4°C、1000g離心lOmin，去除殘留細胞，再在 4°C、1745g離心IOmin去除細胞殘渣，收集含有多肽片段的上清液。
全文摘要
一種生物檢測技術(shù)領(lǐng)域的提高膜蛋白檢測率的膜蛋白多肽的制備方法。包括如下步驟交聯(lián)固化細胞質(zhì)蛋白首先用戊二醛溶液處理完整細胞，使細胞質(zhì)蛋白相互交聯(lián)形成致密固體，離心收集戊二醛交聯(lián)固化細胞；用蛋白酶解反應(yīng)溶液懸浮戊二醛交聯(lián)固化細胞，加入蛋白酶進行酶解反應(yīng)；收集酶解多肽，進行除鹽和富集，制備脫鹽酶解多肽；用酶解多肽直接做LC-MS/MS檢測，分析所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)，獲得所需要的膜蛋白信息。本發(fā)明能夠快速獲得更多、更可靠的膜蛋白信息，有效減少LC-MS/MS檢測中胞質(zhì)蛋白的信號干擾。
文檔編號C12P21/06GK102221586SQ20111007368
公開日2011年10月19日 申請日期2011年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月25日
發(fā)明者徐泓, 李榮秀, 程超, 鄒琦, 馬貴軍 申請人:上海交通大學(xué)