專(zhuān)利名稱(chēng)：：為真核表達(dá)的目的構(gòu)建原核基因表達(dá)島的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及改造原核生物的基因調(diào)控元件，組建適于真核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)島。更具體地，所述原核生物的基因是固氮基因。還更具體地，所述原核生物是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae,也稱(chēng)肺炎克氏桿菌)。
背景技術(shù)：
：通氫所有的生物都需要氮元素。在活細(xì)胞內(nèi)，氮是所有氨基酸、核酸(DNA和RNA)及其他許多重要分子的主要成分。大部分生物不能直接利用大氣中的氮，僅能利用氮的某種形式的化合物。形成這些化合物的過(guò)程統(tǒng)稱(chēng)為“固氮”，這時(shí)氮與其他元素結(jié)合，被“固定”在含氮的化合物中。由于全球大面積種植農(nóng)作物，土壤每年因此要失去大量的氮素。如果得不到及時(shí)補(bǔ)充，土壌的含氮量就會(huì)下降，從而影響農(nóng)作物產(chǎn)量。土壤可以通過(guò)兩條途徑獲得氮素ー是施用含氮肥料，包括氮素化肥和各種農(nóng)家肥料；另ー是生物固氮。20世紀(jì)80年代曾有人推算過(guò)，全世界毎年施用的氮素化肥中的氮素大約有8XIO7噸，而自然界毎年通過(guò)生物固氮所提供的氮素則高達(dá)4XIO8噸。因此，如果能利用生物固氮的原理，讓小麥、水稻等糧食作物自行固氮，則有可能大大減少對(duì)氮素化肥的需求，提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量，這對(duì)解決全球性糧食問(wèn)題、以及對(duì)保護(hù)全球性生態(tài)環(huán)境，都具有十分重要的意義。固氮微牛物生物固氮主要由固氮微生物完成。固氮微生物分為共生和自生兩大類(lèi)。共生固氮微生物典型的有與豆科植物共生才能固氮的根瘤菌。自生固氮微生物則是土壌中能夠獨(dú)立進(jìn)行固氮的微生物，主要有細(xì)菌、藍(lán)藻(Cyanobacterium,也稱(chēng)藍(lán)細(xì)菌)等。固氮細(xì)菌中，常見(jiàn)的有,好氧的巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、兼性厭氧的克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、以及能進(jìn)行光合作用的紅螺菌屬(Rhodospirillum)和紅硫菌屬(Chromatmm,也稱(chēng)著色菌屬)等。目前最常用于氮肥的自生固氮菌是好氧的圓褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)。固氮,某因在固氮菌中，研究得最多最廣泛的是肺炎克雷伯氏菌，它的固氮基因由1720個(gè)nif基因組成，依次主要有J，H，D，K，T，Y，E，N,X，U，S，V，W，Z，M，F(xiàn)，L，A，B,Q，它們組成以Γ7個(gè)呆縱子(QiCheng,PerspectivesinBiologicalNitrogenFixationResearch.JournalofIntegrativePlantBiology,2008)NifJ操縱子包含nifJ基因NifHDKY操縱子包含nifH、nifD、nifK、nifY基因NifENX操縱子包含nifE、nifN、nifX基因NifUSVM:操縱子包含nifU、nifS、nifV、nifM基因NifF操縱子包含nifF基因NifLA操縱子包含nifL、nifA基因NifBQ操縱子包含nifB、nifQ基因。在所有固氮微生物中中，整個(gè)固氮系統(tǒng)非常保守，固氮基因也有很高的同源性。例如，根瘤菌固氮基因系統(tǒng)中的nif基因就與肺炎克氏桿菌的nif基因同源。肺炎克雷伯氏菌固氮基因的異源表達(dá)已有人將肺炎克雷伯氏菌24kb的nif固氮基因(NCBI登錄號(hào)X13303)整個(gè)從染色體上切下來(lái)，不經(jīng)分割直接連接到載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli),使本來(lái)不能固氣白勺大腸桿菌獲得固氣倉(cāng)泛力(RayDixon,FrankCannon,ConstructionofaPplasmidcarryingnitrogennxationgenesfromKlebsiellapneumoniae.Nature,197。ノ。厄來(lái)，又有人嘗試將同樣的固氮基因轉(zhuǎn)移到酵母中，但所得酵母只能合成出構(gòu)成固氮酶的部分蛋白質(zhì)，個(gè)具有固風(fēng)!!泛カ(AdaZamir,StablechromosomalintegrationoftheentirenitrogenfixationgeneclusterfromKlebsiellapneumoniaeinyeastProc.NatLAcad.Sci.USA,1981)。可見(jiàn)，將固氮基因從原核生物轉(zhuǎn)移到真核生物中進(jìn)行表達(dá)，使小麥、水稻等真核生物實(shí)現(xiàn)生物固氮，還存在很大困難。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明嘗試改進(jìn)原核基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，使之適應(yīng)于真核表達(dá)。所述原核基因例如固氮基因。為了更好地理解本發(fā)明，作出以下解釋表達(dá)島(expressionisland)也可以稱(chēng)“調(diào)控島”，是指多個(gè)調(diào)控元件與多個(gè)基因組成的結(jié)構(gòu)，其中每個(gè)調(diào)控元件可以調(diào)控一或多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)。在原核基因的情形下，所述表達(dá)島可以是指，一或多個(gè)帶有調(diào)控元件的操縱子。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，一方面，所述調(diào)控元件進(jìn)行的調(diào)控獨(dú)立于宿主固有的表達(dá)系統(tǒng)，既不受其影響，也不對(duì)其造成干擾；另ー方面，島內(nèi)每一調(diào)控元件進(jìn)行的調(diào)控獨(dú)立于島上的其它調(diào)控元件(如果有的話(huà))，從而允許調(diào)控島上不同基因的不同表達(dá)水平，以實(shí)現(xiàn)各個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物的功能最優(yōu)化。在本發(fā)明的表達(dá)島中，所述調(diào)控元件優(yōu)選并非所述基因或所述操縱子的天然調(diào)控元件，更優(yōu)選所述調(diào)控元件是T7啟動(dòng)子，所述T7啟動(dòng)子選自T7wt，T7M4，T7M5，T7M6，T7M7，和T7M8，以及任何其它的T7變體，所述變體具有T7啟動(dòng)子的活性，但強(qiáng)度相對(duì)于野生型而言可以有不同。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)島由BioBrick組件組成。更優(yōu)選地，所述BioBrick組件是帶有T7啟動(dòng)子的目標(biāo)基因或目標(biāo)操縱子，例如是帶有不同的T7啟動(dòng)子的多個(gè)原核生物固氮基因。在ー個(gè)具體實(shí)施方案中，表達(dá)島中的多個(gè)基因選自固氮基因nifj，nifH,nifD,nifK,nifT,nifY,nifE,nifN,nifX,nifU,nifS,nifV,nifff,nifZ,nifM,nifF,nifL,nifA,nifB,和/或nifQ。在另一具體實(shí)施方案中，所述表達(dá)島不含固氮基因nifT,nifY,nifX,nifU,nifS,nifV,nifff,nifZ,nifL,nifA,和/或nifQ。在又一具體實(shí)施方案中，所述固氮基因是以天然操縱子的形式存在，但該天然操縱子的啟動(dòng)子已替換為T(mén)7啟動(dòng)子。在還ー個(gè)具體實(shí)施方案中，所述操縱子是T7wt+nifJ，T7wt+nifHDKY,T7M5+nifENX,T7M5+nifUSVM,T7M6+nifF，和/或T7M6+nifBQ。BioBrick該術(shù)語(yǔ)是BioBricks基金會(huì)(BioBricksFoundation)所擁有的商標(biāo)。BioBrick組件(BioBrickpart)指ー種DNA序列性質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)組件,其中，姆ー個(gè)標(biāo)準(zhǔn)組件都具有相同的“前綴”和“后綴”，如下所示5”i.Γ:A(SΤΤΓ;C—f;,.T~'τV;AC--ItA序H”…~AΓ:丁AてA■CC；,.—ΤつCAた-:.----CsSt^TXAnOしCJ4ACATi'TC一一一一一—J1了:jiVmT:ごG::CGG、C0*--Ccriri;；>nlXbalパIitl由于具有共同的界面，BioBrick組件常常被引入諸如大腸桿菌之類(lèi)的活細(xì)胞，來(lái)構(gòu)建新的生物系統(tǒng)。因此，它們常用于合成生物學(xué)和納米技術(shù)等領(lǐng)域。詳情可參見(jiàn)例如Knight,T.(2003),IdempotentVectorDesignforStandardAssemblyofBiobricks.MITSyntheticBiologyWorkingGroupFromthecellsup,TheGuardian,10March2005；BioBrickstohelpreverse-engineerlife,EETimes,11June2004。構(gòu)律BioBrick纟目件的可行件以前的文獻(xiàn)僅報(bào)道過(guò)將肺炎克雷伯氏菌所有nif基因作為ー個(gè)整體，直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌(詳見(jiàn)
背景技術(shù)：
部分)，尚無(wú)人嘗試將這些基因拆分成以操縱子為單位的多個(gè)部分，再重新組合后，在大腸桿菌中表達(dá)固氮酶活性。本發(fā)明人將文獻(xiàn)記載的固氮基因，例如攜帯在質(zhì)粒pRDl上的肺炎克雷伯氏菌24kbnif基因(NCBIX13303)，以單個(gè)的包含天然啟動(dòng)子的操縱子形式克隆出來(lái)。將每ー個(gè)操縱子分別引入帶有BioBrick前綴和后綴結(jié)構(gòu)的常規(guī)質(zhì)粒，例如pBS中。再依次將BioBrick組件形式的這些操縱子引入多拷貝載體，例如pACYC184中。然后進(jìn)行大腸桿菌的表達(dá)。測(cè)試表明，將這些操縱子單獨(dú)酶切后再連接，能在大腸桿菌中表達(dá)出固氮酶活性。本發(fā)明的ー個(gè)特征是，單個(gè)的原核基因操縱子能夠單獨(dú)地操作，而不必需與天然情形下與之相連為ー個(gè)整體的其它操縱子共同操作。例如，上述BioBrick組件形式的單個(gè)操縱子，除了包含BioBrick組件的通用前綴和后綴以外，還分別包含各自特有的一個(gè)限制酶酶切位點(diǎn)(例如見(jiàn)后文表4)，這樣就能對(duì)每ー個(gè)操縱子進(jìn)行選擇性地単獨(dú)操作，例如酶切。所述的特有的限制酶酶切位點(diǎn)可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行選擇，不限于本發(fā)明實(shí)施例的舉例。由于將操縱子單個(gè)地進(jìn)行操作，因此，在將它們以BioBrick組件形式依次引入多拷貝載體中時(shí)，先后順序并不是很重要。例如，nifJ的特有酶切位點(diǎn)在后文的實(shí)施例I中被設(shè)計(jì)為ScaI位點(diǎn)，當(dāng)需要將該操縱子引入多拷貝質(zhì)粒，例如pACYC184時(shí)，用相應(yīng)的ScaI酶就可以特異性地將該操縱子，而不是其它操縱子切割下來(lái)。這一切割無(wú)論是在第一順位，還是，任選地，在第二、三、四、五、六、七順位，對(duì)于本發(fā)明而言，無(wú)關(guān)緊要。但是，一旦確定具體的順位，最終將得出與該具體順位相一致的組合結(jié)構(gòu)。T7轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)T7轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)由啟動(dòng)子區(qū)和RNA聚合酶區(qū)構(gòu)成，是目前在大腸桿菌進(jìn)行基因表達(dá)最常用也是最有效的系統(tǒng)。而且，T7轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)在真核生物中也能有效表達(dá)基因。例如，T7轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)可以在酵母的線(xiàn)粒體中進(jìn)行基因表達(dá)。T7RNA聚合酶為單個(gè)單體蛋白，能獨(dú)立地通過(guò)僅有17bp的啟動(dòng)子發(fā)揮作用，因而調(diào)控簡(jiǎn)単。T7啟動(dòng)子比較保守，如下所示，分為兩個(gè)結(jié)構(gòu)功能區(qū)_17-5為結(jié)合區(qū)，負(fù)責(zé)與T7RNA聚合酶結(jié)合；_4+6為起始區(qū)，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄起始4:5AV!-5+1,5TT(17)TAA'M-AOGACIGWWTAGGGAGA對(duì)啟動(dòng)子區(qū)的堿基進(jìn)行突變，得到ー些變體，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)測(cè)定，它們的強(qiáng)度各不相同，也不同于野生型T7wt(DianeImburgio,StudiesofPromoterRecognitionandbtartbiteSelectionbyT7RNAPolymeraseUsingaしomprehensiveしollectionοιPromoterVariantsBiochemistry,2000,39(34),10419-10430,2000),概述如下變體名稱(chēng)縮寫(xiě)具體突變相對(duì)強(qiáng)度T7M4T-4A第-4位由T變?yōu)锳0.08T7M5T-2G第-2位由T變?yōu)镚0.49T7M6T-4G第-4位由T變?yōu)镚0.23T7M7A-15T第-15位由A變?yōu)門(mén)0.71T7M8A-15G第-15位由A變?yōu)镚0.11相對(duì)強(qiáng)度是指，以野生型T7(“T7wt”)為I.O所確定的強(qiáng)度。正是由于T7系統(tǒng)既可以在原核系統(tǒng)、又可以在真核系統(tǒng)表達(dá)的雙重特性，使我們可以充分利用大腸桿菌這ー最成熟的遺傳操作系統(tǒng)，來(lái)構(gòu)建完全依賴(lài)于T7RNA聚合酶的固氮基因表達(dá)系統(tǒng)，并在通過(guò)固氮測(cè)活驗(yàn)證等實(shí)驗(yàn)，證明確實(shí)可行之后，再轉(zhuǎn)入真核系統(tǒng)。這樣ー個(gè)可在原核與真核之間穿梭的體系，將對(duì)在真核系統(tǒng)中最終建立“固氮島”，使真核生物可以自主固氮起到關(guān)鍵作用(如可以先在原核體系中構(gòu)建及驗(yàn)證其功能，然后再向真核系統(tǒng)轉(zhuǎn)移，從而大大筒化研究的復(fù)雜程度)更換啟動(dòng)子對(duì)于文獻(xiàn)報(bào)道的肺炎克雷伯氏菌整個(gè)固氮基因在酵母中表達(dá)，不能使該酵母獲得固氮能力的情形，發(fā)明人猜測(cè)ー個(gè)可能的原因是，肺炎克雷伯氏菌的原核表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)不適用于真核細(xì)胞。在確認(rèn)了肺炎克雷伯氏菌固氮系統(tǒng)并不是必需整個(gè)地被遺傳操作，而是能夠以操縱子為單位單獨(dú)地進(jìn)行操作之后，為了解決真核表達(dá)的調(diào)控問(wèn)題，發(fā)明人想到將這樣的原核操縱子所附帯的天然啟動(dòng)子替換為能通用于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的啟動(dòng)子，例如T7啟動(dòng)子。為此，可以將肺炎克雷伯氏菌的各個(gè)nif啟動(dòng)子分別引入攜帶特異性標(biāo)記的質(zhì)粒上，通過(guò)測(cè)定該特異性標(biāo)記的表達(dá)水平或活性，來(lái)確定各個(gè)nif啟動(dòng)子的強(qiáng)度。所述特異性標(biāo)記例如是beta半乳糖苷酶基因，或其它任何常規(guī)的標(biāo)記。將這樣測(cè)出的啟動(dòng)子強(qiáng)度與文獻(xiàn)記載的T7啟動(dòng)子強(qiáng)度進(jìn)行比較，按照大致相當(dāng)?shù)膹?qiáng)度水平，為每ー種天然啟動(dòng)子選擇多種(例如2-3種)T7啟動(dòng)子進(jìn)行測(cè)試，從而選出在整個(gè)固氮系統(tǒng)表達(dá)中表現(xiàn)良好的T7啟動(dòng)子來(lái)進(jìn)行替換。表汰島中的nif某閔或操縱子nif轉(zhuǎn)錄的調(diào)控包括由nif基因簇以外的基因(例如ntrA,ntrB,ntrC)介導(dǎo)的一般性調(diào)控機(jī)制，以及，由nif基因簇中nifL和nifA基因介導(dǎo)的特異性調(diào)控。一般情況下，由ntrB,ntrC等感應(yīng)外界的氮源來(lái)調(diào)控nifL和nifA,再由nifL和nifA調(diào)控其它固氮基因。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)島包含未替換T7啟動(dòng)子、而是攜帯其天然啟動(dòng)子的nifLA操縱子，例如pKU7181。但在另一實(shí)施方案中，所述表達(dá)島根本不含nifLA操縱子，例如PKU7180。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)表明，在缺失nifLA操縱子的情況下，本發(fā)明的表達(dá)島仍然可以表達(dá)出固氮酶活性。進(jìn)ー步的實(shí)驗(yàn)表明，用本發(fā)明的表達(dá)島表達(dá)出的固氮酶，不受溫度、氮源、NtrC和σ54因子等已知影響天然原核生物固氮酶表達(dá)的因素的影響，僅僅受Τ7本身的調(diào)控因素異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)的影響(例如，參見(jiàn)下表11和12)?？梢?jiàn)，本發(fā)明的表達(dá)島成功越過(guò)了天然狀態(tài)下需要經(jīng)由nifL和nifA來(lái)進(jìn)行調(diào)控的途徑，使得固氮基因的表達(dá)更為簡(jiǎn)潔，易操控。但是，本發(fā)明的表達(dá)島并不是必需包含所有的原核固氮基因或是所有的原核固氮操縱子。例如，已知在缺失nifQ基因的情況下，通過(guò)外源提供鑰，也可以使肺炎克雷伯氏菌表現(xiàn)出固氮活性(JournalofBacteriology,第158卷，第I其月,187-194頁(yè)，1984年4月)。又例如，本文證實(shí)，大腸桿菌缺失nifL和nifA基因，即缺失nifLA操縱子，仍具有固氮活性。又例如，前人已發(fā)現(xiàn)，nifH基因產(chǎn)物與衣藻葉綠體中同源基因chlL的產(chǎn)物在功能上有Jl疊(QiCheng,TheKlebsiellapneumoniaenitroRenaseFeproteinRenemifH)functionallysubstitutesforthechlLReneinChlamydomonasreinhardtii.BBRC，2005)。因此，本發(fā)明的表達(dá)島可以缺失原核固氮系統(tǒng)的一或多個(gè)基因而仍然表達(dá)固氮活性。例如，本發(fā)明的表達(dá)島可以缺失在相應(yīng)宿主中非必需的原核固氮基因，或者可以利用宿主生物(例如真核宿主生物)固有的產(chǎn)物作為功能替代物，來(lái)發(fā)揮某ー個(gè)或幾個(gè)原核固氮基因(例如nif基因)產(chǎn)物的作用。這使得本發(fā)明表達(dá)島的結(jié)構(gòu)能夠更進(jìn)ー步簡(jiǎn)化。更具體地，本發(fā)明涉及以下本發(fā)明的ー個(gè)方面涉及單個(gè)的原核固氮基因操縱子，其不含天然啟動(dòng)子，但含T7啟動(dòng)子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述T7啟動(dòng)子選自T7wt,T7M4，T7M5，T7M6，T7M7，和T7M8，以及任何其它的T7變體，所述變體具有T7啟動(dòng)子的活性，但強(qiáng)度相對(duì)于野生型而言可以有不同。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述原核固氮基因是肺炎克雷伯氏菌的固氮基因，例如NCBIX13303。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的操縱子選自T7wt+nifJ，T7wt+nifHDKY，T7M5+nifENX,T7M5+nifUSVM,T7M6+nifF,和T7M6+nifBQ。本發(fā)明的另一方面涉及表達(dá)島，其包含一或多個(gè)調(diào)控元件、以及ー或多個(gè)基因。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述調(diào)控元件是T7啟動(dòng)子，在有多個(gè)啟動(dòng)子的情況下，所述啟動(dòng)子可以相同或不同。在另ー優(yōu)選實(shí)施方案中，所述基因是不含天然啟動(dòng)子的原核固氮基因操縱子，它們由T7啟動(dòng)子進(jìn)行調(diào)控。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明表達(dá)島中含T7啟動(dòng)子的操縱子以BioBrick組件的形式組合。在另一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明表達(dá)島中的操縱子還帶有與其它操縱子不同的限制酶位點(diǎn)，從而能夠單個(gè)地操作每ー操縱子。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)島包含選自下列的一或多個(gè)操縱子T7wt+nifJ,T7wt+nifHDKY,T7M5+nifENX,T7M5+nifUSVM,T7M6+nifF,和T7M6+nifBQ。本發(fā)明的原核固氮基因操縱子，或者表達(dá)島可以攜帶在質(zhì)粒上。優(yōu)選所述質(zhì)粒為多拷貝質(zhì)粒，以便能高水平表達(dá)相應(yīng)的固氮基因。本發(fā)明的另一方面還涉及含T7RNA聚合酶基因的多拷貝質(zhì)粒。在ー個(gè)具體實(shí)例中，所述質(zhì)粒是PBR322。本發(fā)明的這種多拷貝質(zhì)粒能高水平表達(dá)T7RNA聚合酶，以適應(yīng)被調(diào)控的原核基因(例如原核固氮基因)表達(dá)的需要。本發(fā)明的另一方面涉及ー種表達(dá)系統(tǒng)，其包含含有本發(fā)明的原核固氮基因操縱子或表達(dá)島的質(zhì)粒，以及本發(fā)明的含有T7RNA聚合酶基因的質(zhì)粒。所述表達(dá)系統(tǒng)能在原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)生固氮酶活性。相應(yīng)地，本發(fā)明還涉及宿主細(xì)胞，其包含本發(fā)明的操縱子，表達(dá)島，質(zhì)粒，或表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明又一方面涉及構(gòu)建用于真核表達(dá)的表達(dá)島的方法，所述方法包括測(cè)定一組基因中每ー個(gè)的啟動(dòng)子的強(qiáng)度，依據(jù)所測(cè)定的強(qiáng)度，將所述啟動(dòng)子替換為相同或不同的T7啟動(dòng)子,將帶有T7啟動(dòng)子的所述基因組合成表達(dá)島。優(yōu)選地,所述方法還包括,將所組合的多個(gè)基因轉(zhuǎn)移到相應(yīng)宿主中進(jìn)行表達(dá)。還優(yōu)選地，所述帶有T7啟動(dòng)子的基因以BioBrick組件的形式組合在表達(dá)島中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述T7啟動(dòng)子選自T7wt，T7M4，T7M5，T7M6，T7M7，和T7M8，以及任何其它的T7變體，所述變體具有T7啟動(dòng)子的活性，但強(qiáng)度相對(duì)于野生型而言可以有不同。本發(fā)明還有一方面涉及T7啟動(dòng)子用于協(xié)調(diào)多基因表達(dá)的用途。具體地，所述表達(dá)是指，在原核細(xì)胞或原核生物中表達(dá)，或在真核細(xì)胞或者真核生物中表達(dá)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述T7啟動(dòng)子選自T7wt,T7M4，T7M5，T7M6，T7M7，和T7M8，以及任何其它的T7變體，所述變體具有T7啟動(dòng)子的活性，但強(qiáng)度相對(duì)于野生型而言可以有不同。實(shí)施例材料菌株大腸桿菌JM109，DH5a和BL21(DE3)都購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，其中，大腸桿菌JM109和BL21(DE3)主要用于測(cè)試固氮酶活性，大腸桿菌DH5a主要用于確認(rèn)克隆產(chǎn)物的序列。另外，大腸桿菌THl是基因型為F-，σ54的大腸桿菌，大腸桿菌WJ9是基因型為F-，ntrC的大腸桿菌，大腸桿菌TP2006菌是基因型為F-，xyl，cya，crp-39，IacΔx74,argHl,glp的大腸桿菌,它們均為本實(shí)驗(yàn)室所有,但本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以用常規(guī)技術(shù)構(gòu)建得到具有相應(yīng)基因型的大腸桿菌菌株。質(zhì)粒本發(fā)明用到的多個(gè)常規(guī)質(zhì)粒可以商購(gòu)。例如，pet28a可以從Novagen購(gòu)買(mǎi)，PACYC184可以以ATCC37033獲得。本發(fā)明還用到一些已有文獻(xiàn)記載的質(zhì)粒，例如，P⑶926ロ丁多見(jiàn)GaryPitta,PlasmidsrelatedtotheDroadhostranRevector,pRK290,usefulforRenecloningandformonitoringReneexpression.Plasmid，1985；pST1021可麥見(jiàn)Zhu.TB，EffectofnifAproductonsuppressionofNifphenotypeofRlnmutationandconstitutivesynthesisofnitroRenaseinKlebsiellapneumoniae.Sci.Sin.1983；pRDlロ」參見(jiàn)RayDixon,FrankCannon，ConstructionofaPplasmidcarryingnitrogenfixationRenesfromKlebsiellapneumoniae.Nature,1976，等等下、表I舉例說(shuō)明本發(fā)明的質(zhì)粒。表I權(quán)利要求1.表達(dá)島，包含多個(gè)原核固氮基因和多個(gè)T7啟動(dòng)子，不含所述原核固氮基因的天然啟動(dòng)子，其中每個(gè)Τ7啟動(dòng)子調(diào)控ー或多個(gè)所述基因，優(yōu)選所述多個(gè)基因以天然操縱子的形式存在，還更優(yōu)選所述基因選自nifJ,nifH,nifD,nifK,nifE,nifN,nifU、nifS、nifV,nifM,nifF,和/或nifBo2.權(quán)利要求I的表達(dá)島，所述多個(gè)T7啟動(dòng)子選自T7wt，T7M4，T7M5，T7M6，T7M7，和T7M8，以及任何其它具有啟動(dòng)子活性的T7變體。3.權(quán)利要求I或2的表達(dá)島，其中所述操縱子以BioBrick組件的形式組合。4.權(quán)利要求1-3任ー項(xiàng)的表達(dá)島，其中的操縱子還帶有與其它操縱子不同的限制酶位點(diǎn)。5.質(zhì)粒，者含權(quán)利要求1-4之一的表達(dá)島，優(yōu)選所述質(zhì)粒為多拷貝質(zhì)粒。6.多拷貝質(zhì)粒，含T7RNA聚合酶基因。7.表達(dá)系統(tǒng)，含權(quán)利要求5和6的質(zhì)粒。8.細(xì)胞，含權(quán)利要求1-4之一的表達(dá)島，權(quán)利要求5或6的質(zhì)粒，或權(quán)利要求7的表達(dá)系統(tǒng)。9.構(gòu)建用于真核表達(dá)的表達(dá)島的方法，包括測(cè)定ー組基因中每ー個(gè)的啟動(dòng)子的強(qiáng)度，依據(jù)所測(cè)定的強(qiáng)度，將所述啟動(dòng)子替換為相同或不同的T7啟動(dòng)子，將帶有T7啟動(dòng)子的所述基因組合。10.T7啟動(dòng)子用于協(xié)調(diào)多基因表達(dá)的用途。全文摘要本發(fā)明涉及用T7啟動(dòng)子改造原核固氮基因，使之適應(yīng)于真核表達(dá)。文檔編號(hào)C12N1/15GK102690808SQ20111007075公開(kāi)日2012年9月26日申請(qǐng)日期2011年3月23日優(yōu)先權(quán)日2011年3月23日發(fā)明者楊云,楊建國(guó),王憶平,王霞,陳麗申請(qǐng)人:北京大學(xué)