專利名稱：野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因PlUGT4的克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因的的克隆方法，特別涉及野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因朽游7￥的克隆方法。
背景技術(shù)：
野葛(A/eraria lobata (ffilld. ) Ohwi )是豆科植物葛屬，其根作為中國傳統(tǒng)中藥已有相當(dāng)長的歷史。葛根味甘，性辛涼，歸脾、胃經(jīng)。具有升陽、活血、通絡(luò)的作用，其有效藥用成分是異黃酮類化合物葛根素、大豆甙、大豆甙元等。其中葛根素含量高、藥性好，可顯著改善冠心病患者心肌供血，治療不穩(wěn)定性心絞痛、室性期前收縮；降低血糖、血脂、抗氧化、增加血液流動性，降低肺動脈高壓，治療糖尿病性周圍神經(jīng)病變以及改善胰島素抵抗等作用(Song et al.，1988 ；Xu et al. , 2005 ；黃筑艷等，2007)。 對野葛生物合成葛根素的途徑，尤其是調(diào)節(jié)酶的研究一直得到關(guān)注，已從野葛克隆了查爾酮合酶基因(Nakajima et al.，1996 ；Yamaguchi et al.，1999)，克隆的查爾酮-異黃酮異構(gòu)酶在大腸桿菌表達 (Terai et al. , 1996)，野葛查爾酮還原酶基因在煙草中表達(Joung et al.，2003)。上述野葛合成代謝相關(guān)基因的表達與葛根素生產(chǎn)間的相關(guān)性研究尚未有報道。目前認(rèn)為，葛根素的生物合成是異甘草素在葡糖基轉(zhuǎn)移酶作用下，C8位通過C-C連接一個葡萄糖基形成 C-葡糖基查爾酮中間體，接著自身脫水形成葛根素，其C-糖基化發(fā)生在查爾酮階段。已知模式植物擬南芥、水稻中有催化幾種連接鍵混合的葡糖基轉(zhuǎn)移酶，但缺乏單獨催化C-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列，無法調(diào)出C-葡糖基轉(zhuǎn)移酶的CDNA和氨基酸序列，因此，從野葛中克隆糖基轉(zhuǎn)移酶并研究其功能，為認(rèn)識調(diào)節(jié)植物體內(nèi)葛根素生物合成途徑和調(diào)控研究提供依據(jù)，為微生物工程大規(guī)模生產(chǎn)葛根素提供基礎(chǔ)，在理論和應(yīng)用方面具有重要意義。 已經(jīng)報道指出，不同種屬的生物、同一生物個體的不同組織、同一組織的不同發(fā)育階段、甚至同一細(xì)胞株的不同時相，其糖基轉(zhuǎn)移酶的表達也有差別(Bettina et al.，2005)，例如苜薯具有一系列糖基轉(zhuǎn)移酶的基因序列以及這些糖基轉(zhuǎn)移酶絕大部分參與了類黃酮代謝，科學(xué)家將參與次級代謝的糖基轉(zhuǎn)移酶的保守序列稱為PSPG框(Hughes and Hughes, 1994)。 PSPG框由靠近蛋白C端大約40個氨基酸組成，保守性很強，達到60%-80%，在進化上也作為一個篩選糖基轉(zhuǎn)移酶的基因的標(biāo)志(Gachon et al.，2005)。現(xiàn)階段，普遍利用同源基因克隆及RACE技術(shù)克隆糖基轉(zhuǎn)移酶基因，但是如果引物設(shè)計不當(dāng)，反應(yīng)條件控制不好，根本無法克隆出完整的目的的。野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因P1UGT4是新發(fā)現(xiàn)的一種糖基轉(zhuǎn)移酶基因，其Genebank登陸號為EU889122，全長1590bp，其序列如SEQ ID NO. 9所示，其蛋白序列如SEQ ID NO. 10 所示。該基因可廣泛應(yīng)用于野葛品質(zhì)的改良，尤其是野葛作為藥用植物的開發(fā)和利用等領(lǐng)域。但是目前缺乏有效的克隆方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因P1UGT4的克隆方法。
本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是
野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因P1UGT4的克隆方法，包括以下步驟
1)提取野葛的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；
2)以cDNA 為模板，以簡并引物 UGTD-F TTYGTNACNCAYTGYGGNTGGAA 3' (SEQ ID NO. 1)和 UGTD-R 5‘ TCCATNAGNCTNCGNCANGCYTTYTCDAT 3' (SEQ ID NO. 2)為引物，進行溫度梯度PCR，得到cDNA，其反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5 min，94°C變性30s，54°C 63°C 30s ，72°C延伸30s, 20 40個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin，得到中間序列；
3)以步驟1)得到的總 RNA 為模板，3' RACE T 5' GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTT TTTTTTT 3' (SEQ ID NO. 3)為引物反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA ；
4)以上一步驟得到的cDNA為模板，巢式PCR得到野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因P1UGT4的3' 末端序歹丨J ；
5)以步驟1)得到的總RNA為模板，采用TaKaRa公司5'-Full RACE Kit獲得野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因P1UGT4的5'末端序列；
6)將中間序列、3'末端序列、5' 末端序列用SeqMan拼接得到P1UGT4的cDNA序列，根據(jù)拼接得到 P1UGT4 的 cDNA 序列設(shè)計引物 P1UGT4F :ATGGCTGACCAGCTCACCGACGACCAG (SEQ ID NO. 4)和 P1UGT4R :TCAGTTTCCGTGAATCCGTTCAAGTC (SEQ ID NO. 5)，以步驟 1)得到的cDNA為模板，PCR得到野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因P1UGT4的開放閱讀框(ORF)蛋白cDNA序列。優(yōu)選的，步驟4)中，PCR 的引物為 P1UGT4-F1 :ACCATCATGGAAAGTGTGAACGC (SEQ ID Ν0· 6)、P1UGT4-F2 :AGAATGGAGACCGTGGAACGACTTTGG (SEQ ID NO. 7)和 3 ' RACE R: GACTCGAGTCGACATCGA (SEQ ID NO. 8)。本發(fā)明的方法，可以有效地克隆出野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因P1UGT4。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例，進一步說明本發(fā)明。以下實施例中，使用的簡并引物為
UGTD-F 5' TTYGTNACNCAYTGYGGNTGGAA 3' (SEQ ID NO. 1) UGTD-R 5' TCCATNAGNCTNCGNCANGCYTTYTCDAT 3' (SEQ ID N0. 2)。實施例1
1)提取野葛的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；
2)以上一步驟得到的cDNA為模板，使用簡并引物UGTD-F和UGTD-R進行PCR擴增，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，54°C 30s，72°C延伸30s，20個循環(huán)，然后72°C 延伸lOmin，擴增得到150 bp泳帶；
3)取總RNA2 Pg為模板，以walking法設(shè)計的引物為引物，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA;
4)以反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，通過walking方法設(shè)計的為引物反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，PCR 擴增，無法得到野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因的末端。實施例2
1)提取野葛的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；
2)以上一步驟得到的cDNA為模板，使用簡并引物UGTD-F和UGTD-R進行PCR擴增，反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，60°C 30s，72°C延伸30s，40個循環(huán)，然后72°C 延伸lOmin，無法擴增出RNA泳帶。實施例3
1)提取野葛的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；
2)以上一步驟得到的cDNA為模板，使用簡并引物UGTD-F和UGTD-R進行PCR擴增，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s, 57°C 30s，72°C延伸30s，30個循環(huán)，然后72°C 延伸lOmin，擴增得到250 bp泳帶，稱為中間序列；
3)取總RNA2 Pg為模板，以RACE-T法設(shè)計的反轉(zhuǎn)錄引物5' GACTCGAGTCGACATCGAT TTTTTTTTTTTTTTTT 3, (SEQ ID NO. 3)為引物，superscript III 反轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen) 反轉(zhuǎn)錄得到cDNA ；
4)以上一步驟中反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，引物P1UGT4-F1:ACCATCATGGAAAGTGTGAACGC (SEQ ID NO. 6)和 3 ‘ RACE R: GACTCGAGTCGACATCGA (SEQ ID NO. 8)進行第一輪PCR擴增得到cDNA產(chǎn)物；以第一輪PCR的cDNA產(chǎn)物為模板，P1UGT4-F2 AGAATGGAGACCGTGGAACGACTTTGGCSEQ ID N0. 7)和 3' RACE R: GACTCGAGTCGACATCGACSEQ ID NO. 8)為引物進行第二輪PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物，PCR程序為94°C預(yù)變性5min,94°C 變性 30s，55°C 30s，72°C延伸 lmin，30 個循環(huán)，然后 72°C延伸 IOmin ；
5)對PCR產(chǎn)物進行測序，證明得到的PCR產(chǎn)物為野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因P1UGT4的3' 末端序歹丨J ；
6)以總RNA為模板，采用TaKaRa公司5'-Full RACE Kit獲得野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因P1UGT4的5'末端序列；
7)用S印Man將中間序列、3‘ 末端序列和5 ‘ 末端序列拼接，得到P1UGT4的cDNA 序列，并根據(jù)得到 P1UGT4 的 cDNA 序列設(shè)計引物 P1UGT4F :ATGGCTGACCAGCTCACCGACGACCAG (SEQ ID Ν0· 4)和 P1UGT4R: TCAGTTTCCGTGAATCCGTTCAAGTC (SEQ ID NO. 5)，以步驟 1)得到的cDNA為模板，PCR得到野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因P1UGT4的開放閱讀框(ORF)蛋白cDNA 序列。對PCR產(chǎn)物測序，證明得到的序列為P1UGT4的ORF蛋白cDNA序列。實施例4
1)提取野葛的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；
2)以上一步驟得到的cDNA為模板，使用簡并引物UGTD-F和UGTD-R進行PCR擴增，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s, 63°C 30s，72°C延伸30s，30個循環(huán)，然后72°C 延伸lOmin，擴增得到200 bp泳帶；
3)以總RNA2 Pg為模板，以walking法設(shè)計的引物為引物，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA;
4)以反轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，PCR擴增不能獲得野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因的末端。
權(quán)利要求
1.野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因P1UGT4的克隆方法，包括以下步驟1)提取野葛的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到CDNA；2)以cDNA 為模板，以簡并引物 UGTD-F TTYGTNACNCAYTGYGGNTGGAA 3' (SEQ ID NO. 1)和 UGTD-R 5‘ TCCATNAGNCTNCGNCANGCYTTYTCDAT 3' (SEQ ID NO. 2)為引物，進行溫度梯度PCR，得到cDNA，其反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5 min，94°C變性30s，54°C 63°C 30s ，72°C延伸30s, 20 40個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin，得到中間序列；3)以步驟1)得到的總 RNA 為模板，3' RACE T 5' GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTT TTTTTTTTT 3' (SEQ ID NO. 3)為引物反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA ；4)以上一步驟得到的cDNA為模板，巢式PCR得到野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因P1UGT4的 3'末端序列；5)以步驟1)得到的總RNA為模板，采用TaKaRa公司5' -Full RACE Kit獲得野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因P1UGT4的5'末端序列；6)將中間序列、3'末端序列、5'末端序列用SeqMan拼接得到P1UGT4的cDNA序列，根據(jù)拼接得到 P1UGT4 的 cDNA 序列設(shè)計引物 P1UGT4F :ATGGCTGACCAGCTCACCGACGACCAG (SEQ ID NO. 4)和 P1UGT4R :TCAGTTTCCGTGAATCCGTTCAAGTC (SEQ ID NO. 5)，以步驟 1)得到的cDNA為模板，PCR得到野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因P1UGT4的開放閱讀框(ORF)蛋白cDNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因P1UGT4的克隆方法，其特征在于步驟 4)中，PCR 的引物為 P1UGT4-F1 :ACCATCATGGAAAGTGTGAACGC (SEQ ID NO. 6)、P1UGT4_F2 AGAATGGAGACCGTGGAACGACTTTGG (SEQ ID NO. 7)和 3' RACE R: GACTCGAGTCGACATCGACSEQ ID NO. 8)。
全文摘要
本發(fā)明采用同源基因克隆法結(jié)合RACE方法設(shè)計逆轉(zhuǎn)錄引物，從野葛根中克隆得到了野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因PlUGT4。本發(fā)明的野葛葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列及其編碼的蛋白序列以及基因克隆方法，可廣泛應(yīng)用于野葛品質(zhì)的改良，尤其是野葛作為藥用植物的開發(fā)和利用等領(lǐng)域。
文檔編號C12N15/10GK102181432SQ20111006629
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者周文靈, 李玲 申請人:華南師范大學(xué)