能抵抗與氧化相關的活性損失的里氏木霉葡糖淀粉酶變體及其用圖
【專利說明】能抵抗與氧化相關的活性損失的里氏木霉葡糖淀粉酶變體 及其用途
[0001] 相關專利申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年8月14日提交的美國臨時專利申請61/683, 007的權益，該臨 時專利申請的內容以引用方式整體并入本文。
[0003] 序列表
[0004] 附件是包括SEQ ID NO: 1-19的序列表，以引用方式將其整體并入本文。
技術領域
[0005] 里氏木霉（Trichoderma reesei)葡糖淀粉酶（TrGA)變體可用于淀粉加工，例如 用于通過同時糖化和發(fā)酵（SSF)工藝生產醇作為終產物。本發(fā)明提供了包含TrGA變體的 組合物和將TrGA變體用于淀粉加工的方法。
【背景技術】
[0006] 工業(yè)發(fā)酵主要利用葡萄糖作為原料來生產多種蛋白質、酶、醇和其他化工終產物。 通常，葡萄糖是淀粉加工的產品，淀粉加工在常規(guī)上是催化淀粉降解的、涉及液化和糖化的 兩步酶促過程。在液化過程中，不溶性顆粒態(tài)淀粉在水中調成漿液，經加熱糊化，并被熱穩(wěn) 定性α-淀粉酶水解。在糖化期間，進一步通過葡糖淀粉酶水解液化過程中產生的可溶性 糊精。
[0007] 葡糖淀粉酶（葡聚糖1，4- α -葡糖水解酶，EC 3. 2. 1. 3)是水解淀粉的外切碳水化 合物分解酶，其催化從淀粉或者相關寡糖和多糖分子的非還原端連續(xù)去除葡萄糖單位。葡 糖淀粉酶既能水解淀粉的直鏈糖苷鍵也能水解淀粉的分支糖苷鍵（例如直鏈淀粉和支鏈 淀粉）。葡糖淀粉酶是商業(yè)上重要的酶類，已被用于各種各樣的需要水解淀粉的應用中。例 如，葡糖淀粉酶通常用來從經過酶液化的淀粉底物生產可發(fā)酵糖類。可發(fā)酵糖類例如低分 子量糖類如葡萄糖然后可1)通過其他酶類（例如葡萄糖異構酶）轉化為果糖；2)進行結 晶；或者3)用于發(fā)酵以生產各種各樣的終產物（例如醇類、谷氨酸一鈉、琥珀酸、維生素、氨 基酸、1，3-丙二醇和乳酸）?？赏瑫r進行發(fā)酵和糖化（即SSF工藝）來實現更大的經濟性 和效率。
[0008] 葡糖淀粉酶已被成功用于商業(yè)應用多年。例如，已在真菌葡糖淀粉酶例如里 氏木霉葡糖淀粉酶（TrGA)中引入各種突變，以增強熱穩(wěn)定性和比活性。參見例如WO 2008/045489 ;W0 2009/048487 ;W0 2009/048488 ;和美國專利第 8, 058, 033 號。對于提供 具有更合宜的性質的新型葡糖淀粉酶變體仍存在著需求。

【發(fā)明內容】

[0009] 具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的里氏木霉葡糖淀粉酶（TrGA)變體CS4,已在 美國專利第8,058,033號中公開。〇54是通過將五個置換仏417￥、了43(^、0511擬5391?和 N563I)引入到具有SEQ ID N0:2的氨基酸序列的TrGA中獲得的。相比于親本TrGA，CS4表 現出改進的性質，例如熱穩(wěn)定性提高且比活性提高。不過，發(fā)現TrGA和CS4在較長時間的 儲存后活性降低。在一些情況下，這個活性損失已被歸因于所述酶的M50殘基的氧化等因 素。CS4的位置50處的甲硫氨酸（M50)被甘氨酸（G)、苯丙氨酸（F)、賴氨酸⑷或酪氨酸 (Y)置換導致產生能抵抗與氧化相關的活性損失的變體。在這些變體當中，攜帶M50Y置換 的那個變體在SSF最終產物產率和DP4+水解效率兩方面都表現出與CS4相當的性能。因 此，這個包涵 SEQ ID NO:2 的]?50￥、1^417￥、了43(^、0511!1、45391?和陽631置換的1'冗4變體 將有利地可用于各種淀粉加工應用。
[0010] 本發(fā)明涉及一種葡糖淀粉酶變體（1)，其與SEQ ID NO:2具有至少90%、95%、 97%或 99%序列同一性，且（2)包含與 SEQ ID NO:2 的位置 50、417、430、511、539 和563 或者親本葡糖淀粉酶中的相應位置對應的氨基酸置換。在一個方面，該葡糖淀粉酶變體在 SEQ ID NO: 2的位置50或者親本葡糖淀粉酶中的相應位置處具有氨基酸置換M50Y、G、F或 K。在另一個方面，該葡糖淀粉酶變體在SEQ ID NO: 2的位置50或者親本葡糖淀粉酶中的相 應位置處具有氨基酸置換M50Y。在又另一個方面，該葡糖淀粉酶變體的位置417、430、511、 539和563處的氨基酸置換分別為L417V、T430A、Q511H、A539R和N563I。
[0011] 在一個實施例中，該葡糖淀粉酶變體包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在另一個 實施例中，該葡糖淀粉酶變體由SEQ ID N0:6的氨基酸序列組成。
[0012] 在一個實施例中，該葡糖淀粉酶變體還可包含一個或多個額外的與SEQ ID NO: 2 的位置43、44、61、73、294、431、503或535或者親本葡糖淀粉酶中的相應位置對應的氨基酸 置換。在另一個實施例中，該葡糖淀粉酶變體可包含以下氨基酸置換中的一個或多個：SEQ ID N0:2或者親本葡糖淀粉酶中的對等位置的I43Q/R、D44C/R、N61I、G73F、G294C、A431L/ Q、E503A/V 和 / 或 A535R。
[0013] 在一個方面，該葡糖淀粉酶變體與親本葡糖淀粉酶相比可表現出熱穩(wěn)定性提高或 者比活性提高。在另一個方面，該葡糖淀粉酶當與包含SEQ ID N0:5的氨基酸序列的第二 葡糖淀粉酶變體相比時，在相同的條件下氧化時失去的活性較少。
[0014] 本發(fā)明提供了包含該葡糖淀粉酶變體的酶組合物。該酶組合物還可包含己糖激 酶、木聚糖酶、葡萄糖異構酶、木糖異構酶、磷酸酶、植酸酶、普魯蘭酶、β-淀粉酶、α-淀 粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、脂肪酶、角質酶、海藻糖酶、異淀粉酶、氧化還原酶、酯 酶、轉移酶、果膠酶、裂解酶、α -葡糖苷酶、β -葡糖苷酶、其他水解酶或者它們的組合。
[0015] 本發(fā)明還提供加工淀粉的方法，其包括使淀粉底物與該葡糖淀粉酶變體接觸以產 生包含葡萄糖的組合物。該方法還可包括將己糖激酶、木聚糖酶、葡萄糖異構酶、木糖異 構酶、磷酸酶、植酸酶、普魯蘭酶、β-淀粉酶、α-淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、 脂肪酶、角質酶、海藻糖酶、異淀粉酶、氧化還原酶、酯酶、轉移酶、果膠酶、α -葡糖苷酶、 β -葡糖苷酶、其他水解酶或者它們的組合添加到淀粉底物。
[0016] 在一個方面，淀粉底物來自小麥、大麥、玉米、黑麥、稻、高粱、麩皮、木薯 (cassava)、買羅高梁、小米、馬鈴薯、甘薯、木薯淀粉（tapioca)和它們的任何組合。在另一 個方面，淀粉底物是液化淀粉、糊化淀粉或顆粒態(tài)淀粉。在又一個方面，淀粉底物為約15% 至50%、約15%至30%或者約15%至25%。
[0017] 在一個實施例中，將淀粉底物糖化得到高葡萄糖糖漿。在另一個實施例中，該方法 還包括將可發(fā)酵糖類發(fā)酵成終產物。終產物可為醇，或者任選為乙醇。終產物還可以是有 機酸、氨基酸、生物燃料和其他生物化工品，包括但不限于乙醇、檸檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨 酸一鈉、葡糖酸、葡糖酸鈉、葡糖酸鈣、葡糖酸鉀、衣康酸和其他羧酸、葡糖酸-S -內酯、異 抗壞血酸鈉、賴氨酸、ω 3脂肪酸、丁醇、異戊二烯、1，3_丙二醇和生物柴油）。在另一個實 施例中，糖化和發(fā)酵作為同時糖化和發(fā)酵（SSF)工藝來執(zhí)行。
[0018] 在一個實施例中，所設想的葡糖淀粉酶變體以范圍在約0. 1至約2. 0GAU、約0. 2至 約I. OGAU或者約0. 2至約0. 5GAU或者約0. 325GAU每克干固形物的量投與。在另一個實 施例中，糖化還包括添加己糖激酶、木聚糖酶、葡萄糖異構酶、木糖異構酶、磷酸酶、植酸酶、 普魯蘭酶、β-淀粉酶、α-淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、脂肪酶、角質酶、海藻糖 酶、異淀粉酶、氧化還原酶、酯酶、轉移酶、果膠酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶或者它們的 組合。
【附圖說明】
[0019] 將附圖并入本說明書中，提供多個實施例的非限制性例證。在附圖中：
[0020] 圖1A-1F示出成熟的TrGA(SEQ ID ΝΟ:2)與來自木霉屬（Trichoderma)/肉座菌 屬（Hypocrea)家族簇（family cluster)的幾個成員的全長葡糖淀粉酶的ClustalW比 對。所述全長葡糖淀粉酶來自梓檬肉座菌美國變種（Hypocrea citrine var.americana) (SEQIDN0:7;另參見美國專利第 7,413,879 號的SEQIDN0:6);酒紅肉座菌（Hypocrea vinosa) (SEQ ID N0:8 ;另參見美國專利第7, 413, 879號的SEQ ID N0:8);木霉屬 (Trichodermasp·)(SEQIDN0:9;另參見美國專利第 7,413,879 號的SEQIDN0:10);膠 質肉座菌（Hypocreagelatinosa)(SEQIDN0:10 ;另參見美國專利第 7,413,879 號的SEQ ID N0:12);東方肉座菌（Hypocrea orientalis) (SEQ ID N0:11;另參見 U.S.7, 413,879 的SEQIDN0:14);康長木霉（Trichodermakonilangbra)(SEQIDN0:12;另參見美國專 利第 7,413,879 號的SEQIDN0:16);木霉屬（Trichodermasp·)(SEQIDN0:13;另參 見美國專利第 7,413,879 號的SEQIDN0:29);哈茨木霉（Trichodermaharzianum)(SEQ IDN0:14 ;另參見美國專利第 7,413,879 號的SEQIDN0:31);長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum) (SEQ ID N0:15;美國專利第 7,413,879 號的 SEQ ID N0:33);棘孢木 霉（