專利名稱：從石蠟包埋組織中提取總rna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及RNA提取方法，尤其是長時間福爾馬林固定石蠟包埋組織中總RNA的提取方法。
背景技術(shù)：
福爾馬林固定石蠟包埋組織(FFPE)是醫(yī)療機(jī)構(gòu)最常用的保存病理組織的方法， 由于新鮮標(biāo)本難以得到，為進(jìn)行實體腫瘤分子生物學(xué)研究，對已有病例進(jìn)行回顧性研究時只能從石蠟包埋組織中進(jìn)行基因提取，因此石蠟包埋組織就成為來源最豐富的珍貴資源。 從石蠟包埋組織中提取DNA的方法已經(jīng)成熟，但針對DNA的研究有時在某種程度上不能準(zhǔn)確反映疾病相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)生的改變，因此從病理學(xué)檔案標(biāo)本中提取足量且能有效擴(kuò)增的RNA對基因組功能及多態(tài)性研究具有重要意義。但長期以來從石蠟包埋組織中提取RNA —直存在一些困難一方面，與DNA相比較，RNA很不穩(wěn)定，容易受到環(huán)境溫度、酸堿度等因素的影響，尤其是無處不在的RNA酶，在固定和包埋處理過程中很容易使得RNA分子被化學(xué)修飾或降解，不適宜進(jìn)一步用于分子生物學(xué)研究；另一方面，固定劑所引起的組織蛋白質(zhì)一 RNA的高度交聯(lián)，使得RNA更難以提取。最近幾年，國內(nèi)外這方面出現(xiàn)諸多進(jìn)展，但提取方法各異，所得RNA的產(chǎn)量及擴(kuò)增效率也存在很大差別。文獻(xiàn)中報道的提取方法，多為 Trizol裂解法，蛋白酶消化法或試劑盒提取法，但提取的RNA的濃度和純度不理想，降解嚴(yán)重，只能進(jìn)行小片段RNA擴(kuò)增，更不能進(jìn)一步很好的進(jìn)行實時定量PCR(q RT-PCR)和基因芯片(microarray)的研究。并且現(xiàn)有技術(shù)所應(yīng)用針對的對象，即FFPE樣本多為1年內(nèi)的樣本，這也為臨床研究的應(yīng)用帶來很大的限制。因此，需要研發(fā)更有效的能適用于更長時間保存的FFPE樣本的RNA提取的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可用于長時間保存的FFPE樣本的RNA提取的方法，本發(fā)明是在試劑盒(RecoverAl 1 Total Nucleic Acid Isolation Kit，Ambion公司產(chǎn)品，貨號AM1975)的基礎(chǔ)上所提出的改進(jìn)方法，該方法包括如下步驟①脫蠟將待處理的石蠟包埋組織切成厚度為20 μ m的組織片，取4片組織片置于無菌的1. 5ml離心管內(nèi)，加入Iml 二甲苯，漩渦震蕩混勻，50°C水浴3分鐘，室溫條件下， HOOOrpm離心4分鐘，棄上清，重復(fù)操作1 3次；加Iml無水乙醇，混勻，室溫條件下， HOOOrpm離心2 4分鐘，棄上清，重復(fù)操作2次，所得樣品室溫空氣干燥15 30分鐘；②消化向步驟①所得樣品中加入400ul消化緩沖液和4ul蛋白酶，55°C水浴 30 150分鐘；③提取在480ul提取劑中加入IlOOul無水乙醇，加入離心管中，用吸頭反復(fù)吹打直到組織沒有成團(tuán)，90%的組織碎裂，呈白色云霧狀為止；準(zhǔn)備一個帶濾柱的收集管，加 700ul混合液，9000rpm離心30秒，再加剩余液體，再9000rpm離心30秒，棄濾液；加700ul 洗液l,9000rpm離心30秒，加500ul洗液2/3，9000rpm離心30秒，棄濾液，再9000rpm離心30秒，棄濾液；④純化提前95°C水浴預(yù)熱無核酸酶水，準(zhǔn)備DNase混合液6ul IOxDNA酶緩沖液，4ul DNA酶，50ul無核酸酶水；加60ul DNA酶混合液到濾柱中央，室溫靜置30分鐘，加 700ul洗液1室溫靜置30 60秒，9000rpm離心30秒，棄濾液，加500ul洗液2/3 9000rpm 離心30秒，棄濾液，再加500ul洗液2/3，9000rpm離心60秒，棄濾液；用新的收集管，加 60ul的預(yù)熱的無核酸酶水，室溫靜置2 3分鐘，12000rpm離心1分鐘，反復(fù)收集一次。采用本發(fā)明的方法，可以提取出保存時間最長達(dá)6年的石蠟包埋保存的組織樣品中的RNA，并成功的進(jìn)行了后續(xù)的國際公認(rèn)的分子生物學(xué)檢測。而相關(guān)領(lǐng)域的現(xiàn)有研究多是針對保存期少于1年的樣品。國內(nèi)外均無文獻(xiàn)報道在保存2 6年福爾馬林固定石蠟包埋的組織中提取總RNA，進(jìn)行mRNA及miRNA的q RT-PCR及microarray。經(jīng)過核酸微量測試儀和國際公認(rèn)的Agilent 2100bioanalyzer分析，提取的濃度在211_3116ng/ul，提取純度A260/280 1. 75-2. 04，都非常理想，可以進(jìn)一步進(jìn)行mRNA及miRNA水平的qRT-PCR和 miRNA的microarray的高豐度基因的表達(dá)研究，這對于開展大量FFPE的基因研究提供了實驗基礎(chǔ)，具有廣闊的應(yīng)用價值。


本發(fā)明附圖6幅，圖1是本發(fā)明的方法提取的人卵巢癌的福爾馬林固定石蠟包埋組織的RNA瓊脂糖電泳結(jié)果，圖中數(shù)字分別表示樣品標(biāo)號。圖2是本發(fā)明的方法提取的人卵巢癌的福爾馬林固定石蠟包埋組織的RNA質(zhì)量分析圖譜，其中圖2(A)是標(biāo)準(zhǔn)品1的分析結(jié)果圖譜，Ladder :RNA范圍:218 ；RNA濃度:150ng/ul ；圖2(B)和圖2(C)分別是21號、12號樣本的分析結(jié)果圖譜，參照標(biāo)準(zhǔn)品1 ；圖2 (D)是標(biāo)準(zhǔn)品2的分析結(jié)果圖譜，Ladder =RNA范圍223. 7 ；RNA濃度:150ng/ ul ；圖2(E)是14號樣本的分析結(jié)果圖譜，參照標(biāo)準(zhǔn)品2 ；圖2 (F)是標(biāo)準(zhǔn)品3的分析結(jié)果圖譜，Ladder =RNA范圍J81. 3 ；RNA濃度150ng/ ul ； 2 (G),2 (H),2 (I),2 (J)和2 (K)分別是22、24、四、34和40號樣本的分析結(jié)果圖譜，參照標(biāo)準(zhǔn)品3。附圖3是本發(fā)明的方法提取的人卵巢癌的福爾馬林固定石蠟包埋組織的RNA用于 miRNA基因芯片(Microarray)實驗結(jié)果譜圖。附圖4是miRNA的表達(dá)在不同卵巢癌樣本中的microarray結(jié)果的可信度圖譜。附圖5是本發(fā)明的方法提取的1年期以內(nèi)的人卵巢癌的福爾馬林固定石蠟包埋組織的RNA用于mRNA q RT-PCR檢測結(jié)果譜圖，其中圖5(A)是內(nèi)參基因GAPDH的擴(kuò)增曲線，圖5 (B)是目的基因STMNl的擴(kuò)增曲線，圖5 (C)是內(nèi)參基因GAPDH的融解曲線，圖5 (D)是目的基因STMNl的融解曲線。
附圖6是本發(fā)明的方法提取的6年期以內(nèi)的人卵巢癌的福爾馬林固定石蠟包埋組織的RNA用于miRNA q RT-PCR檢測結(jié)果譜圖，其中圖6 (A)是內(nèi)參miRNA U6的擴(kuò)增曲線，圖6 (B)是目的miRNA的擴(kuò)增曲線。
具體實施例方式美國Ambion公司的核酸提取試劑盒，Recoveral 1 Total Nucleic AcidIsolation Kit (貨號AM1975)是本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的工具試劑盒。本申請的發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，該試劑盒在用于石蠟包埋組織樣品RNA提取中存在一定的局限，在應(yīng)用于保存期較長的樣品時，提取的RNA的濃度和純度不夠理想。并且，在試劑盒的具體應(yīng)用過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該試劑盒的方法還有諸多可改進(jìn)之處，基于此，提供本發(fā)明的包括脫蠟、消化、提取和純化等步驟的RNA提取方法，具體包括如下步驟①脫蠟將待處理的石蠟包埋組織切成厚度為20 μ m的組織片，取4片組織片置于無菌的1. 5ml離心管內(nèi)，加入Iml 二甲苯，漩渦震蕩混勻，50°C水浴3分鐘，室溫條件下， HOOOrpm離心4分鐘，棄上清，重復(fù)操作1 3次；加Iml無水乙醇，混勻，室溫條件下， HOOOrpm離心2 4分鐘，棄上清，重復(fù)操作2次，所得樣品室溫空氣干燥15 30分鐘；上述步驟①中，所述采用二甲苯對待處理的石蠟包埋組織進(jìn)行脫蠟的操作，即“將待處理的石蠟包埋組織切成厚度為20 μ m的組織片，取4片組織片置于無菌的1. 5ml離心管內(nèi)，加入Iml 二甲苯，漩渦震蕩混勻，50°C水浴3分鐘，室溫條件下，HOOOrpm離心4分鐘， 棄上清”可根據(jù)樣品的石蠟含量調(diào)整次數(shù)石蠟含量高于50%時，重復(fù)操作3次；石蠟含量 30 50%時，重復(fù)操作2次；石蠟含量低于30%時，操作1次。該步驟在試劑盒方法的基礎(chǔ)上對脫蠟次數(shù)進(jìn)行了細(xì)化，是樣品的更高效和有效。上述步驟①中，用無水乙醇處理樣品后，可用吸頭擠壓組織，盡量吸凈組織中的乙醇，在此改進(jìn)條件下處理所得樣品在下一步操作中所需干燥時間15 30分鐘，比試劑盒方法所需的45min更短，并且提高了干燥的效果，進(jìn)而縮短下一步消化的時間。②消化向步驟①所得樣品中加入400ul消化緩沖液和4ul蛋白酶，55°C水浴 30 150分鐘；上述步驟②中，消化緩沖液的用量、消化溫度和消化時間均經(jīng)過發(fā)明人摸索改進(jìn)， 提高消化的效果，尤其針對保存期限較長的樣品，改進(jìn)效果尤其明顯。③提取在480ul提取劑中加入IlOOul無水乙醇，加入離心管中，用吸頭反復(fù)吹打直到組織沒有成團(tuán)，90%的組織碎裂，呈白色云霧狀為止；準(zhǔn)備一個帶濾柱的收集管，加 700ul混合液，9000rpm離心30秒，再加剩余液體，再9000rpm離心30秒，棄濾液；加700ul 洗液l,9000rpm離心30秒，加500ul洗液2/3，9000rpm離心30秒，棄濾液，再9000rpm離心30秒，棄濾液；該步驟中的離心轉(zhuǎn)數(shù)均較試劑盒降低，可以更好的保護(hù)濾柱。④純化95°C水浴預(yù)熱無核酸酶水，準(zhǔn)備DNase混合液6ul IOx DNA酶緩沖液， 4ul DNA酶，50ul無核酸酶水；加60ul DNA酶混合液到濾柱中央，室溫靜置30分鐘，加 700ul洗液1室溫靜置30 60秒，9000rpm離心30秒，棄濾液，加500ul洗液2/39000rpm離心30秒，棄濾液，再加500ul洗液2/3，9000rpm離心60秒，棄濾液；用新的收集管，加60ul的預(yù)熱的無核酸酶水，室溫靜置2 3分鐘，12000rpm離心1分鐘，反復(fù)收集一次。上述步驟④中，95°C水浴預(yù)熱無核酸酶水是試劑盒方法中沒有的步驟，可以增加 RNA的提取濃度。此步驟中離心轉(zhuǎn)數(shù)也有所降低，更好地保護(hù)濾柱，保證濾過效果。上述本方法中所述及的Recoverall Total Nucleic Acid Isolation Kit，購自美國Ambion公司，貨號AM1975。本發(fā)明的上述方法中步驟②所述的消化緩沖液和蛋白酶，步驟③所述及的提取劑、帶濾柱的收集管以及步驟④所述及的IOx DNA酶緩沖液，DNA 酶，洗液1和洗液2/3均為試劑盒中提供，所對應(yīng)的試劑盒中相應(yīng)產(chǎn)品分別是提取齊[J :isolation additive ；IOx DNA 酶緩沖液IOxDNase buffer ；DNA 酶Dnase;洗液1 :washl ；洗液2/3 :wash2/3。上述本發(fā)明的方法所述的無核酸酶水，Thermo kientific產(chǎn)品，購自Hyclone，貨號:SH30538. 01 ；上述本發(fā)明的二甲苯(分析純，AR)，購自天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司，產(chǎn)品批號2010年9月10日；上述本發(fā)明的無水乙醇(分析純，AR) ,10009218，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，產(chǎn)品批號:20091105o以下的實施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明。實施例1樣品RNA提取本實施例的材料為人卵巢癌的福爾馬林固定石蠟包埋組織，本實施例中1Μ、2Μ、 3皿、411、511、811、1011、1說、2￥、3￥、4￥、5￥、6￥，分別代表了組織從固定包埋開始到進(jìn)行實驗的保存時間分別為1個月，2個月，3個月，4個月，5個月，8個月，10個月，11個月，2年，3年，4 年，5年，6年。1年內(nèi)的標(biāo)本21個依次編號為1 21。2 6年的標(biāo)本21個依次編號為22 42。該編號系統(tǒng)也適用于本說明書其它實施例。用本發(fā)明的方法從上述42個標(biāo)本中提取RNA，經(jīng)過核酸微量測試儀(品牌 NanoVue Plus , GE Healthcare產(chǎn)品，美國，型號=28923216)測定的濃度及純度如下表1 表 權(quán)利要求
1.從石蠟包埋組織中提取總RNA的方法，包括如下步驟①脫蠟將待處理的石蠟包埋組織切成厚度為20μ m的組織片，取4片組織片置于無菌的1.5ml離心管內(nèi)，加入Iml 二甲苯，漩渦震蕩混勻，50°C水浴3分鐘，室溫條件下， 14000rpm,棄上清，重復(fù)操作1 3次；加Iml無水乙醇，混勻，室溫條件下，HOOOrpm離心 2 4分鐘，棄上清，重復(fù)操作2次，所得樣品室溫空氣干燥15 30分鐘；②消化向步驟①所得樣品中加入400ul消化緩沖液和4ul蛋白酶，55°C水浴30 150 分鐘；③提取在480ul提取劑中加入IlOOul無水乙醇，加入離心管中，用吸頭反復(fù)吹打直到組織沒有成團(tuán)，90%的組織碎裂，呈白色云霧狀為止；準(zhǔn)備一個帶濾柱的收集管，加700ul 混合液，9000rpm離心30秒，再加剩余液體，再9000rpm離心30秒，棄濾液；加700ul洗液 l,9000rpm離心30秒，加500ul洗液2/3，9000rpm離心30秒，棄濾液，再9000rpm離心30秒，棄濾液；④純化提前95°C水浴預(yù)熱無核酸酶水，準(zhǔn)備DNase混合液6ulIOxDNA酶緩沖液，4ul DNA酶，50ul無核酸酶水；加60ul DNA酶混合液到濾柱中央，室溫靜置30分鐘，加700ul洗液1室溫靜置30 60秒，9000rpm離心30秒，棄濾液，加500ul洗液2/39000rpm離心30 秒，棄濾液，再加500ul洗液2/3，9000rpm離心60秒，棄濾液；用新的收集管，加60ul的預(yù)熱的無核酸酶水，室溫靜置2 3分鐘，12000rpm離心1分鐘，反復(fù)收集一次。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟①中采用二甲苯對待處理的石蠟包埋組織進(jìn)行脫蠟的操作根據(jù)樣品的石蠟含量調(diào)整次數(shù)石蠟含量高于50%時，重復(fù)操作3次； 石蠟含量30 50%時，重復(fù)操作2次；石蠟含量低于30%時，操作1次。
全文摘要
一種從石蠟包埋組織中提取總RNA的方法，該方法是在試劑盒的基礎(chǔ)上所提出的改進(jìn)方法，包括脫蠟、消化、提取和純化的步驟。采用本發(fā)明的方法，可以提取出保存時間最長達(dá)6年的石蠟包埋保存的組織樣品中的RNA，經(jīng)過核酸微量測試儀和國際公認(rèn)的Agilent 2100bioanalyzer分析，提取的濃度在211-3116ng/μl，提取純度A260/2801.75-2.04，都非常理想，可以進(jìn)一步進(jìn)行mRNA及miRNA水平的qRT-PCR和miRNA的microarray的高豐度基因的表達(dá)研究，這對于開展大量FFPE的基因研究提供了實驗基礎(chǔ)，具有廣闊的應(yīng)用價值。
文檔編號C12N15/10GK102181431SQ20111005947
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月11日
發(fā)明者丁艷芳, 崔世英, 趙瑾瑤 申請人:大連醫(yī)科大學(xué)