專(zhuān)利名稱(chēng)：一種二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及涉及一種二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
L-2,4- 二氨基丁酸(L-2，4-diaminobutyric acid,英文縮寫(xiě) DABA)，也稱(chēng) 2，4- 丁二氨酸，是一種次生非蛋白質(zhì)氨基酸，屬于四碳化合物，其結(jié)構(gòu)式為(NH2)CH2CH2CH(NH2) C00H，屬于堿性氨基酸。它廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)，具有獨(dú)特的生理功能，目前其研究處于起步階段，尚未大規(guī)模應(yīng)用。二氨基丁酸在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)中具有良好的應(yīng)用前景。在農(nóng)業(yè)方面，研究發(fā)現(xiàn)在高等植物中，尤其是山黧豆屬(Lathyrus)中，游離的二氨基丁酸含量較高，當(dāng)外界環(huán)境惡劣時(shí)，二氨基丁酸含量上升，環(huán)境改善時(shí)，二氨基丁酸含量又下降，這可能與這種植物抗旱、耐瘠薄、耐鹽堿、抗蟲(chóng)的特性有關(guān)，實(shí)驗(yàn)室研究表明如果外界提供氮源，固氮植物以硝酸鹽的形式提供無(wú)機(jī)氮，則該植物體內(nèi)二氨基丁酸含量上升，以儲(chǔ)存多余的氮素，消除氨態(tài)氮對(duì)植物的毒害作用。美國(guó)農(nóng)業(yè)部將植物抗逆性的研究作為一個(gè)研究方向，專(zhuān)門(mén)撥款研究林生山黧豆和其體內(nèi)的二氨基丁酸。在我國(guó)，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)也在進(jìn)行該方面的研究。除了水土保持，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于體內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)二氨基丁酸的植物來(lái)說(shuō)，二氨基丁酸是一種競(jìng)爭(zhēng)性的代謝抑制劑，國(guó)外研究者證實(shí)二氨基丁酸對(duì)萵苣、蠶豆的生長(zhǎng)有抑制作用，對(duì)一些蝗蟲(chóng)的生長(zhǎng)也有抑制作用。含有二氨基丁酸的植物在植物群落中生存力強(qiáng)， 具有競(jìng)爭(zhēng)力，可能就是由于釋放出的二氨基丁酸對(duì)其他動(dòng)植物的生長(zhǎng)起到了抑制作用。除了抑制作用，二氨基丁酸能促進(jìn)豌豆根瘤菌的生長(zhǎng)，對(duì)土壤桿菌和其他的根瘤菌的生長(zhǎng)也有刺激作用。在醫(yī)學(xué)方面，過(guò)量的二氨基丁酸對(duì)人體有毒性，但在適當(dāng)?shù)膭┝肯掠质且环N藥物，研究發(fā)現(xiàn)二氨基丁酸能引起高滲透壓，對(duì)小鼠纖維瘤細(xì)胞有毒害性，對(duì)人體惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞有溶解作用，因此，二氨基丁酸能用于腦腫瘤的防治。把抗癌藥物道諾霉素制成二氨基丁酸衍生物，用它治療白血病療效更好，更為安全。本課題組在篩選具有聚賴氨酸能力的菌株時(shí)發(fā)現(xiàn)一株能同時(shí)生產(chǎn)聚賴氨酸及聚二氨基丁酸的菌株 Sti^ptomyces albulus PD-1 (CCTCC NO :M2011043)。目前該菌株保藏于武漢中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC)，地址武漢武漢大學(xué)，郵編430072， 登記入冊(cè)的編號(hào)是CCTCC NO :M2011043，保藏日期是2011年2月21日，詳見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利 2011100499868。二氛基丁酸 _2_ If 戊二酸轉(zhuǎn)氛 Sl (diaminobutyrate-2-oxoglutarate transaminase，簡(jiǎn)稱(chēng)DABAT，EC 2.6. 1.76)在L-2，4-二氨基丁酸的合成中起重要作用，天冬氨酸的衍生物天冬氨酸-β -半醛和谷氨酸在該酶催化下生成L-2，4- 二氨基丁酸和α -酮戊二酸。目前L-2，4-二氨基丁酸尚未大規(guī)模生產(chǎn)，作為精細(xì)化工品，只能通過(guò)有機(jī)合成的方法得到，價(jià)格昂貴，價(jià)格達(dá)900元/克。山黧豆屬的植物中，L-2，4-二氨基丁酸占種子干重的_3%，含量低，直接從種子中提取在技術(shù)角度、經(jīng)濟(jì)角度上都不可行。因此，本發(fā)明從微生物合成的角度研究如何發(fā)酵生產(chǎn)L-2，4- 二氨基丁酸，為L(zhǎng)-2，4- 二氨基丁酸高產(chǎn)基因工程菌的構(gòu)建及L-2，4_ 二氨基丁酸的生產(chǎn)開(kāi)辟了一條新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供編碼上述二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶的基因序列。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供包含上述二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶基因的表達(dá)載體及基因工程菌。本發(fā)明還要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供上述基因工程菌的構(gòu)建方法。本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述基因工程菌在制備L-2，4_ 二氨基丁酸的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶，它具有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。 包含422個(gè)氨基酸。其來(lái)源于小白鏈霉菌(Sti^ptomyces albulus)PD-I (菌種保藏號(hào) CCTCC NO :M2011043，關(guān)于上述小白鏈霉菌具體見(jiàn)中國(guó)專(zhuān)利2011100499868)。一種權(quán)利要求1所示二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶的編碼基因，它具有如SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列，其含有1269bp堿基。。一種表達(dá)載體，包含權(quán)利要求2所述的二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶基因。其中，所述的表達(dá)載體為pET28a(+)。一種基因工程菌，它包含權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體。上述基因工程菌優(yōu)選為包含有重組質(zhì)粒pET-dabat的E. coli BL21 (DE3)。上述基因工程菌的構(gòu)建方法，包含如下步驟(1) 二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶的基因dabat擴(kuò)增根據(jù)GeneBank公布的Mi^ptomyces coelicolor A3 (2)的基因組序列，設(shè)計(jì)如下一對(duì)引物引物 1 :5，-CCGGAATTCATGACCATCACCCAGCCCGA-3‘
引物 2 5，-CCCAAGCTTTCAGGCGCAGTCGCGCACCG-3，在上述引物的5’端的下劃線部分分別引入EcoR I和Hind III酶切位點(diǎn)，以小白鏈霉菌 PD-I (Sti^ptomyces albulus PD-I, CCTCC NO :M2011043)總 DNA 為模板，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)物組成如下(25 μ 1 體系)2. 5μ 1 IOXEx Taq Buffer, 2 μ 1 dNTP,2. 5μ 1 MgCl2, 2 μ 1 DMS0，2y 1 模板，引物 1和引物2 各 2μ 1，0· 5μ 1 Ex Taq,9. 5μ 1 ddH20，PCR 反應(yīng)程序?yàn)?51變性51^11，然后941308，581608，721908，共30個(gè)循環(huán)，721延續(xù)10111土11。 將PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序。(2)重組表達(dá)質(zhì)粒pET-dabat的構(gòu)建將步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物純化后用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III酶切， 與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的質(zhì)粒pET48a(+)，在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒 pET-dabat ；(3)將該重組質(zhì)粒pET-dabat轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中將重組質(zhì)粒pET-dabat轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)中，涂布含有25 μ g/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)18 24h得到初步陽(yáng)性克?。?4)經(jīng)抗性培養(yǎng)基篩選得到陽(yáng)性克隆分別挑取初步陽(yáng)性克隆于5mL含有25 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C， 200rpm培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和Hind 111酶切質(zhì)粒，根據(jù)電泳結(jié)果判斷具有序列表SEQ ID N0:1的DNA片段的質(zhì)粒為重組質(zhì)粒pET-dabat，具有該質(zhì)粒的菌落為陽(yáng)性克隆，即為基因工程菌。對(duì)重組質(zhì)粒pET-dabat進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明插入片段為一個(gè)含有U69bp，編碼422個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。上述二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)方法將包含如SEQ ID NO=I所示的核苷酸序列的基因工程菌接種于添加了 25 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜；再以2 10% (ν/ν)的接種量轉(zhuǎn)接到含25 μ g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)5- 后，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)，IPTG的終濃度為0. 2 lmmol/L，降溫至25 30°C，繼續(xù)表達(dá)12 20h后，離心收集菌體。上述基因工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)L-2，4 二氨基丁酸中的應(yīng)用。具體方法為將基因工程菌在含有25 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中30 40°C液體培養(yǎng)8-20h，按2 10% (ν/ν)的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)5 幾后，加入終濃度為0. 2 lmmol/L的乳糖誘導(dǎo)，降溫至25 30°C再誘導(dǎo)培養(yǎng)12 20h。其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下組分葡萄糖10 50g/L, (NH4)2SO4 5 10g/L, NaCl 5 10g/L, KH2PO4I 3g/L，MgSO4 0. 1 lg/L，溶劑為水。有益效果本發(fā)明首次從小白鏈霉菌(Sti^ptomyces albulus)中提取、測(cè)序、克隆表達(dá)的了二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶基因，將該基因上傳至NCBI上進(jìn)行同源性比
Streptomyces coelicolor A3 (2) ψ ^ Aminotransferase SH^WMi^ 1 ] ! 86%，通過(guò)構(gòu)建基因工程菌，利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)L-2，4-二氨基丁酸，開(kāi)辟了一條新的L-2，4- 二氨基丁酸獲取途徑。


圖1 是本發(fā)明的產(chǎn)L-2，4_ 二氨基丁酸的大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建示意圖。圖2 是本發(fā)明重組表達(dá)質(zhì)粒pET-dabat的構(gòu)建示意圖。圖3 是重組的DABAT酶SDS-PAGE圖譜，最左邊泳道為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，自上向下的條帶分別為(kDa) :116，66，45，35，25。其中，第1、2泳道是工程菌，3、4泳道是對(duì)照菌。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1 小白鏈霉菌(Sti^ptomyces albulus)PD-I基因組DNA的提取。按照生產(chǎn)商提供的使用說(shuō)明書(shū)，用Genomic DNA Purification Kit(Takara，大連)抽提處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小白鏈霉菌PD_l(Str印tomyces albulus PD-I, CCTCC N0: M2011043)的基因組DNA，并用8g/L瓊脂糖凝膠電泳對(duì)獲得的細(xì)菌基因組進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)施例2，二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶的基因(dakit)的克隆和重組菌構(gòu)建。
2. Idabat 的 PCR 擴(kuò)增根據(jù)GeneBank公布的Mi^ptomyces coelicolor A3 (2)的基因組序列，設(shè)計(jì)如下一對(duì)引物引物 1 :5，-CCGGAATTCATGACCATCACCCAGCCCGA-3‘引物 2 5，-CCCAAGCTTTCAGGCGCAGTCGCGCACCG-3，在上述引物的5’端的下劃線部分分別引入EcoR I和Hind III酶切位點(diǎn)，以小白鏈霉菌 PD-I (Sti^ptomyces albulus PD-I, CCTCC NO :M2011043)總 DNA 為模板，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)物組成如下(25 μ 1 體系)2. 5μ 1 IOXEx Taq Buffer, 2 μ 1 dNTP,2. 5μ 1 MgCl2, 2 μ 1 DMS0，2y 1 模板，引物 1 和引物 2 各 2μ 1，0· 5μ 1 Ex Taq,9. 5μ 1 ddH20, PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5°C變性5min，然后94°C 30s, 58°C 60s, 72°C 90s，共30個(gè)循環(huán)，72°C延續(xù) IOmin0將擴(kuò)增條帶切膠后用Axygen公司柱式割膠回收試劑盒純化回收，連接于Takara公司pMDIS-T載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。通過(guò)在氨芐青霉素LB平板上結(jié)合質(zhì)粒單雙酶切驗(yàn)證，鑒定出陽(yáng)性克隆，并在南京金斯瑞生物科技公司進(jìn)行序列測(cè)定。2. 2dabat基因的表達(dá)利用pET18a(+)質(zhì)粒(Novagen)，構(gòu)建表達(dá)載體，表達(dá)目的基因，進(jìn)一步確認(rèn)基因克隆的正確性。2. 2. 1限制性酶切反應(yīng)，純化及連接反應(yīng)將PCR產(chǎn)物純化，用預(yù)先設(shè)計(jì)在引物序列中酶切位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，同時(shí)，將pET48a(+)質(zhì)粒(Novagen)進(jìn)行酶切反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，所用的酶是EcoRI 和Hind III。酶切體系為PCR產(chǎn)物或pET48a(+)質(zhì)粒溶液50 μ L，EcoRI 3 μ L, Hind ΙΙΙ3μ L, IOX 緩沖液 10 μ L, ddH20 34 μ L，總體積 100 μ L。由于所選用的兩個(gè)酶切位點(diǎn)在pET48a(+)空質(zhì)粒上相距很近(約20bp)，因此，酶切之后的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體只需要經(jīng)過(guò)PCR清潔試劑盒即可達(dá)到純化的目的。經(jīng)酶切純化后的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體，可以用于連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系為酶切純化的PCR產(chǎn)物4 μ L，酶切純化的質(zhì)粒4 μ L，Τ4連接酶1 μ L，10 X連接酶緩沖液1 μ L。連接后獲得重組質(zhì)粒pET-dabat，其主要結(jié)構(gòu)如圖2所示。2. 2. 2質(zhì)粒制備與轉(zhuǎn)化質(zhì)粒抽提采用Axypr印plasmid miniprep Kit (Axygen，杭州)，參照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE!3)細(xì)胞使用熱激法。2. 2. 3重組質(zhì)粒pET-dabat的轉(zhuǎn)化(1)取 0. 1-1 μ g 重組質(zhì)粒 pET-dabat DNA 于 200 μ L 大腸桿菌 BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘。(2) 42 °C水浴熱激90秒，快速置于冰上1_3分鐘。(3)加入新鮮LB液體培養(yǎng)基800 μ L，于37°C振蕩培養(yǎng)45分鐘。(4)取200 μ L菌體涂布于含有25 μ g/mL卡那霉素的LB平板表面。37°C培養(yǎng)12-16 個(gè)小時(shí)至單菌落出現(xiàn)。2. 2. 4重組子的鑒定將陽(yáng)性菌落接種于含有卡那霉素(25 μ g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，按照實(shí)施例2. 2. 1中的酶切體系和條件分別用EcoRI和Hind III對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行單-雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。經(jīng)電泳結(jié)果證實(shí)，該陽(yáng)性克隆菌落含有DNA片段插入質(zhì)粒pET-dabat，含此重組質(zhì)粒pET-dabat的重組大腸桿菌，即為轉(zhuǎn)化的重組工程菌E. coli BL21-pET-dabat0測(cè)序結(jié)果顯示插入片段含有一個(gè)長(zhǎng)1269bp的開(kāi)放閱讀框架。實(shí)施例3 二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶的誘導(dǎo)表達(dá)。將重組大腸桿菌BL21-pET-dabat接種于5mL添加了 25 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜；再以5% (ν/ν)的接種量轉(zhuǎn)接到裝有IOOmL LB培養(yǎng)基(含 25 μ g/mL卡那霉素)的500mL搖瓶中，37 °C搖床培養(yǎng)至0D600約為0. 6時(shí)加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)(IPTG終濃度lmmol/L)，降溫至25 30°C，繼續(xù)表達(dá)12小時(shí)后，離心收集菌體。實(shí)施例4、工程菌E. coli BL21-pET-dabat中二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)分析。1、SDS-PAGE 分析如實(shí)施例2. 2. 2-2. 2. 4所述步驟，將沒(méi)有經(jīng)過(guò)酶切的空質(zhì)粒pET_28a (+)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到包含pET48a(+)的大腸桿菌BL21 (DE3)，將該菌作為對(duì)照菌，命名為E. coli BL21-pET。將重組大腸桿菌BL21-pET-dabat和對(duì)照菌E. coli BL21-pET接種于5mL添加了 25yg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜；再以5% (ν/ν)的接種量轉(zhuǎn)接到裝有IOOmL LB培養(yǎng)基(含25 μ g/mL卡那霉素)的500mL搖瓶中，37°C搖床培養(yǎng)至0D600 約為0. 6時(shí)加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)(IPTG終濃度lmmol/L)，降溫至25 30°C，繼續(xù)表達(dá)12小時(shí)后，各取樣1. 5mL，離心，TE溶液(Tris-HCl IOmM, EDTA ImM)洗滌兩次，再加入100 μ 1 TE溶液和20 μ 1 10mg/ml的溶菌酶(購(gòu)自華美生物工程公司)處理1個(gè)小時(shí)，煮沸3min， 離心，取上清即可使用。SDS-PAGE凝膠制備好后點(diǎn)樣，每個(gè)點(diǎn)5-15μ 1，然后電泳、染色及脫色，SDS-PAGE結(jié)果表明二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶在工程菌Ε. coli BL21-pET-dabat 中獲得了可溶性表達(dá)，而對(duì)照菌Ε. coli BL21-pET則沒(méi)有。2，二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶的酶活測(cè)定將重組大腸桿菌BL21-ρΕΤ-dabat接種于5mL添加了 25 μ g/mL卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜；再以5% (ν/ν)的接種量轉(zhuǎn)接到裝有IOOmL LB培養(yǎng)基(含25 μ g/mL卡那霉素)的500mL搖瓶中，37 °C搖床培養(yǎng)至0D_約為0. 6時(shí)加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)(IPTG終濃度lmmol/L)，降溫至25 30 °C，繼續(xù)表達(dá)12小時(shí)后，各取樣1.5mL，離心，TE溶液(Tris-HCl IOmM, EDTA ImM)洗滌兩次，再加入100 μ 1 TE 溶液和20 μ 1 10mg/ml的溶菌酶(購(gòu)自華美生物工程公司)處理1個(gè)小時(shí)，離心后去上清液作為酶液，參照Hisato Ikai等報(bào)道的方法進(jìn)行二氨基丁酸_2_酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶酶活測(cè)定(Ikai, H, and S. Yamamoto. Identification and analysis of a gene encoding L~2,4-diaminobutyrate :2~ketoglutarate 4-aminotransferase involved in thel,3-diaminopropane production pathway in Acinetobacter baumannii. J. Bacteriol. 1997(179) :5118-5125.)，重復(fù)測(cè)定酶活三次。結(jié)果顯示，本發(fā)明克隆的基因工程菌的酶活為5.6U/mg，而對(duì)照菌E.coli BL21_pET幾乎檢測(cè)不到酶活，說(shuō)明本發(fā)明克隆的二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶基因在大腸桿菌中得到了活性表達(dá)。3，本發(fā)明的基因工程菌BL21-pET-dabat的發(fā)酵性能測(cè)試
將活化好的工程菌BL21-pET_dabat接種到裝有IOOmL LB培養(yǎng)基(含25 μ g/mL卡那霉素)的500mL搖瓶中，37°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜，按5% (ν/ν)的接種量轉(zhuǎn)接至裝有IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基的 500mL 搖瓶中(葡萄糖 50g/L，(NH4)2SO4 8g/L，NaCl 10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0. 5g/L，溶劑為水。)培養(yǎng)5- 后，加入終濃度為lmmol/L的乳糖誘導(dǎo)，降溫至25 30°C， 繼續(xù)培養(yǎng)12h。離心棄去菌體，收集培養(yǎng)液。參照沈黎明等改進(jìn)的方法測(cè)定培養(yǎng)液中L-2， 4- 二氨基丁酸含量(沈黎明，吳顯榮，林生山黧豆體內(nèi)的一種特異游離氨基酸-丁二氨酸， 北京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1992，18 (4) :347-351)，結(jié)果表明，搖瓶培養(yǎng)液中L-2，4- 二氨基丁酸含量達(dá)5. 6g/L，相信經(jīng)過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化，有望實(shí)現(xiàn)二氨基丁酸的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.一種二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶，其特征在于它具有如SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列。
2.—種權(quán)利要求1所示二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶的編碼基因，其特征在于它具有如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。
3.—種表達(dá)載體，其特征在于包含權(quán)利要求2所述的二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于所述的表達(dá)載體為pET18a(+)。
5.一種基因工程菌，其特征在于它包含權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因工程菌，其特征在于所述的基因工程菌為包含有重組質(zhì)粒 pET-dabat 的 E.coli BL21 (DE3)。
7.權(quán)利要求6所述的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于它包含如下步驟(1)二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶的基因dabat擴(kuò)增根據(jù)GeneBank公布的Mi^ptomyces coelicolor A3 (2)的基因組序列，設(shè)計(jì)如下一對(duì)引物引物 1 :5’ -CCGGAATTCATGACCATCACCCAGCCCGA-3‘引物 2 :5，-CCCAAGCTTTCAGGCGCAGTCGCGCACCG-3‘在上述引物的5’端的下劃線部分分別引入EcoR I和Hind III酶切位點(diǎn)，以小白鏈霉菌 PD-I (Sti^ptomyces albulus PD-1, CCTCC NO :M2011043)總 DNA 為模板，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增， PCR 反應(yīng)物組成如下25μ 1 體系，2. 5μ 1 IOXEx Taq Buffer, 2 μ 1 dNTP，2. 5μ1 MgCl2, 2 μ 1 DMSO, 2 μ 1 模板，引物 1 和引物 2 各 2μ 1,0. 5μ 1 Ex Taq，9. 5μ 1 ddH20, PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5°C變性 5min，然后 94°C 30s, 58°C 60s, 72°C 90s，共 30 個(gè)循環(huán)，72°C延續(xù) IOmin ；將 PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序；(2)重組表達(dá)質(zhì)粒pET-dabat的構(gòu)建將步驟(1)得到PCR產(chǎn)物純化后用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III酶切，與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的質(zhì)粒pET48a(+)，在T4連接酶的作用下進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pET-dabat ；(3)將該重組質(zhì)粒pET-dabat轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中將重組質(zhì)粒pET-dabat轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)中，涂布含有25 μ g/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)18 24h得到初步陽(yáng)性克隆；(4)經(jīng)抗性培養(yǎng)基篩選得到陽(yáng)性克隆分別挑取初步陽(yáng)性克隆于5mL含有25 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C， 200rpm培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI和Hind III酶切質(zhì)粒，根據(jù)電泳結(jié)果判斷具有序列表SEQ ID NO :1的DNA片段的質(zhì)粒為重組質(zhì)粒pET-dabat，具有該質(zhì)粒的菌落為陽(yáng)性克隆，即為基因工程菌。
8.權(quán)利要求6所述的基因工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)L-2，4二氨基丁酸中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于將基因工程菌在含有25μ g/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中30 40°C液體培養(yǎng)8-20h，按2 10% (ν/ν)的接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)5 幾后，加入終濃度為0. 2 lmmol/L的乳糖誘導(dǎo)，降溫至25 30°C再誘導(dǎo)培養(yǎng)12 20h。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含如下組分葡萄糖(10 50g/L, (NH4)2SO4 5 10g/L, NaCl 5 10g/L, KH2PO4 1 3g/L, MgSO4 0. 1 lg/L, 溶劑為水。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶及其應(yīng)用，它具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；本發(fā)明還公開(kāi)了上述酶的編碼基因，如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本發(fā)明同時(shí)公開(kāi)了包含上述二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶的編碼基因的表達(dá)載體、基因工程菌及其構(gòu)建方法。本發(fā)明首次從小白鏈霉菌(Streptomyces albulus)中提取、測(cè)序、克隆表達(dá)的了二氨基丁酸-2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶基因，通過(guò)構(gòu)建基因工程菌，利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)L-2，4-二氨基丁酸，開(kāi)辟了一條新的L-2，4-二氨基丁酸獲取途徑。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102181412SQ201110056470
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月9日
發(fā)明者倪芳, 馮小海, 夏軍, 張揚(yáng), 徐虹, 李莎, 歐陽(yáng)平凱 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)