專利名稱：用作體外和體內(nèi)dna轉(zhuǎn)染與基因治療載體的完整微細胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用完整細菌微細胞將寡核苷酸和多聚核苷酸轉(zhuǎn)運至宿主細胞，尤其但不專屬于基因治療的背景中。本發(fā)明還涉及一種藥學(xué)上兼容的方法，用于提純完整的細菌微細胞。
背景技術(shù)：
Salser等人的一項U. S. patent No. 4，497，796闡述了在1980年左右可用于轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞的各種早期方法。特別的，Salser等人公布使用DNA共沉淀技術(shù)和磷酸鈣將編碼二氫葉酸還原酶的基因(其能夠產(chǎn)生甲氨蝶呤耐藥性)轉(zhuǎn)染至小鼠的L1210細胞或骨髓細胞中。Salser等人還提到了“許多其他方法……，用于將遺傳物質(zhì)插入細胞”，除了 “病毒載體，，外，還包括某些細胞融合技術(shù)“細胞-細胞融合涉及將包裹在核膜中的有限數(shù)量的染色體融入細胞中；……微細胞融合；……與含有質(zhì)粒DNA的細菌原生質(zhì)體融合；以及與用DNA包裹的紅細胞影融合”(第18-30行，第5欄；引用被省略)。這些技術(shù)的共同點是使用一種通過單層膜界定的含有DNA的細胞結(jié)構(gòu)，在存在細胞融合促進劑，例如聚乙烯乙二醇(PEG)的條件下，將其與目標哺乳動物細胞接觸。哺乳動物細胞與細胞結(jié)構(gòu)融合，形成一種雜交細胞，后者所含有的DNA被釋放入前者的細胞質(zhì)中并傳輸至雜交細胞的細胞核中，隨后該雜交細胞可能表達DNA。Salser公布的內(nèi)容提到了“紅細胞影”，即缺乏細胞質(zhì)成分但保持原始形態(tài)學(xué)的紅細胞殘余物，以及“細菌原生質(zhì)”，或者被剝離了外膜(細胞壁)的細菌細胞，其典型的通過水解酶或抑制肽聚糖合成的抗生素產(chǎn)生。Salser等人還間接提到了使用簡化細胞結(jié)構(gòu)的第三種類型，即微細胞原生質(zhì)。微細胞是大腸桿菌或其他細菌細胞的一種無核形式，其通過在分離DNA的細胞分裂二分體中干擾協(xié)調(diào)機能產(chǎn)生。原核染色體的復(fù)制物被聯(lián)接至正常的二分體，其涉及細胞中隔的形成。例如，在大腸桿菌中，min基因的突變，比如minCD，可以在細胞分裂過程中解除對細胞極處隔膜形成的抑制作用，導(dǎo)致產(chǎn)生一個正常的子細胞和一個無核微細胞(de Boer 等人，1992 年；Raskin&de Boer, 1999 年；Hu&Lutkenhaus，1999 年；Harry, 2001 年)。除了 min操縱子突變外，還可以通過一類影響隔膜形成的其他基因重排或突變， 例如在枯草桿菌的divIVBl中產(chǎn)生無核細胞(Reeve和Cornett，1975年；Levin等人，1992 年)。還可以在細胞分裂/染色體分離過程中通過在蛋白質(zhì)的基因表達水平進行干擾形成微細胞。例如，minE的過度表達會導(dǎo)致極性分裂并產(chǎn)生微細胞。類似的，染色體分離的缺陷也可能產(chǎn)生少染色體微細胞，例如枯草桿菌中的smc突變(Britton等人，1998年)，枯草桿菌中的spoOJ缺失(Ireton等人，1994年)，大腸桿菌中的mukB突變(Hiraga等人，1989年)，以及大腸桿菌中的ParC突變(Mewart和D’Ari，1992年)。可以提供反式基因產(chǎn)物。 例如，當cafA通過一種高拷貝數(shù)質(zhì)粒過度表達時，可以提高細胞分裂的比例和/或在復(fù)制后抑制染色體的分離(Okada等人，1994年)，導(dǎo)致連鎖細胞和無核微細胞的形成(Wachi等人，1989 年；Okada 等人，1993 年)。微細胞與在某些情況下同時產(chǎn)生并釋放的其他小泡截然不同，后者與微細胞相反，它們不是特殊基因重排或游離基因表達所產(chǎn)生的。這種其他小泡的例子有細菌氣泡，它是小膜泡(Dorward等人，1989年)。在例如農(nóng)桿菌、芽孢桿菌、博爾德氏桿菌、埃希氏菌、奈瑟氏菌、假單胞菌、沙門氏菌和志賀氏菌等數(shù)種細菌中已經(jīng)觀察到了氣泡。細菌氣泡可以通過比如操縱生長環(huán)境(Katsui等人，1982年)以及使用外源性膜失穩(wěn)劑(Matsuzaki等人， 1997年)產(chǎn)生。存在其他亞細菌成分，比如細菌影(Lubitz等人，1999年)，它是當phiX174溶解基因E表達時，在多種革蘭氏陰性菌中形成的細菌空殼。細菌影的形成來自一種穿透細菌細胞包膜的跨膜管道結(jié)構(gòu)。由于細胞內(nèi)的高滲透壓，細胞質(zhì)成分被排出至周圍介質(zhì)中，導(dǎo)致形成細菌細胞空殼。因為原核細胞內(nèi)的質(zhì)粒復(fù)制依賴于染色體復(fù)制，所以在上述異常細胞分裂過程中，質(zhì)?？梢苑蛛x入正常的子細胞和微細胞中。因此，來自重組min大腸桿菌的微細胞攜帶大量的質(zhì)粒拷貝，具有除染色體外的全部細菌細胞成分，并且已經(jīng)被用作比如體外表達質(zhì)粒編碼基因的研究中。參見Brahmbhatt (1987年)，Harlow等人(1995年)和Kihara等人 (1996年)。Brhambhatt (1987年)證明，例如，大腸桿菌微細胞可以攜帶含有201Λ DNA插入物的重組質(zhì)粒，不含有任何染色體DNA，并且能夠同時表達9種或更多種重組蛋白質(zhì)。這種無復(fù)制性但具有代謝活性的完整微細胞已經(jīng)被用于分析質(zhì)粒運載基因所編碼的蛋白質(zhì)。但是，在&ilser等人所提到的“微細胞融合”背景中，微細胞被剝離外膜以產(chǎn)生一種類似于細菌原生質(zhì)的結(jié)構(gòu)，當與PEG或其他細胞融合促進劑一起培養(yǎng)時，其能夠與靶細胞融合。同樣與細菌原生質(zhì)相仿，這種微細胞原生質(zhì)必須保存在等張條件下以防止?jié)B透性溶解，并且它們極易受到酶的攻擊。因此，它們不適合用于基因治療。另外，隨著其他更方便的轉(zhuǎn)化方法的出現(xiàn)，Salser等人所說的微細胞技術(shù)便陷于無用的境地。新近，基因治療的進展已經(jīng)突出了多種用于介導(dǎo)外源性遺傳物質(zhì)進入受體哺乳動物基因組的方法。參見Romano等人(1998，1999年)，Balicki和Beutler (2002年)以及 Wadhwa等人(2002年)的回顧。由于嚴重的安全性考慮，這些技術(shù)的臨床應(yīng)用，比如腺病毒和重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的使用，已經(jīng)被擱置。目前轉(zhuǎn)化方法學(xué)所提出的直觀問題是用野生型病毒進行重組、插入和致癌潛力、病毒誘導(dǎo)的免疫抑制、病毒載體攜帶治療性DNA大片段的能力有限、減毒病毒的毒性回復(fù)、重組病毒的制造和分布困難、穩(wěn)定性差以及不良反應(yīng)， 例如現(xiàn)有免疫性造成的炎癥反應(yīng)。能夠解決這些問題的方法將提供顯著的收益，使得基因治療更加安全并且更加有效。已經(jīng)研究了活的減毒細菌載體作為人類基因治療的基因傳輸載體，包括沙門氏菌 (Darji 等人，1997 年；Paglia 等人，2000 年；Urashima 等人，2000 年)，志賀氏菌(Sizemore 等人，1995 年；GriIlot-Courvalin 等人，2002 年)，李斯特氏菌(Dietrich 等人，1998 年) 和侵襲性大腸桿菌(Grillot-Courvalin等人，1998年)。但是，細菌載體具有顯著的局限性，因為活的細菌盡管被減毒，還必須經(jīng)過操作以攜帶吞噬溶酶體結(jié)構(gòu)以使足夠數(shù)量的重組DNA逸出至哺乳動物細胞液與細胞核中。這種操作對于大量的細胞內(nèi)細菌病原體而言困難較大并且或許是不可能的。此外，只有少數(shù)細菌種類的減毒細菌突變體是已知的，例如沙門氏菌、大腸桿菌以及志賀氏菌的芳香氨基酸生物合成基因突變體。由于許多細菌種類的減毒突變體仍然未知，細菌基因傳輸系統(tǒng)就無法使用大組的細菌性細胞內(nèi)病原體。由于部分染色體DNA可以被轉(zhuǎn)染至接受基因治療的人或動物宿主體內(nèi)的其他微生物群落中，故細菌載體提出了有關(guān)染色體DNA存在的其他問題。由于可能出現(xiàn)新型的有毒和/或耐藥菌，這種細菌物種之間的混雜DNA轉(zhuǎn)染是不符合要求的。

發(fā)明內(nèi)容
為了說明這些和其他需要，本發(fā)明根據(jù)一方面提供了一種組合物，其含有(i)重組的完整微細胞以及(ii) 一種藥學(xué)上可接受的載體，其中微細胞含有一種治療性核酸分子，其編碼例如白介素-2。在一個優(yōu)選實施例中，該組合物含有的污染細胞少于1個污染親代細胞/IO7, IO8或IO9個微細胞。根據(jù)另一方面，本發(fā)明為重組完整微細胞在藥物制劑中的使用提供了含有治療性核酸分子的微細胞，用于治療疾病或通過將該藥物給予細胞、組織或器官以改變特性的方法。在此范圍內(nèi)治療的疾病可以是比如腫瘤，或者一種獲得性疾病，比如艾滋病、肺炎、肺氣腫，或者由先天性代謝失調(diào)產(chǎn)生的疾病，比如囊性纖維化。換句話說，該治療可以影響特性， 比如繁殖能力或者與一種變態(tài)反應(yīng)原或傳染劑相關(guān)的免疫反應(yīng)。根據(jù)另一方面，本發(fā)明還提供了一種遺傳轉(zhuǎn)化方法，其包括(i)提供含有由一種核酸序列，優(yōu)選編碼治療性表達產(chǎn)物的核酸序列所組成質(zhì)粒的重組完整微細胞，以及隨后 (ii)將微細胞與具有噬菌作用或內(nèi)吞作用的哺乳動物細胞相接觸，使得微細胞被哺乳動物細胞吞噬，后者借此產(chǎn)生核酸序列的表達產(chǎn)物。微細胞與哺乳動物細胞的接觸可以在體外或體內(nèi)進行。前面提到的質(zhì)粒也可以含有功能為調(diào)節(jié)成分的第二核酸片段，例如促進子、終止物、增強子或一種信號序列，其經(jīng)過操作連接至第一核酸片段。另外，質(zhì)?？梢院幸环N指示成分，例如一種編碼綠色熒光蛋白的核酸片段。根據(jù)本發(fā)明的另一方面提供了一種提純方法，其包括將含有微細胞的樣品通過 (i) 一系列橫向流動濾器以及隨后(ii)通過終端濾器，借此將微細胞與該樣品中的污染物分離以獲得純化的微細胞制劑。此方法選擇性的包括用抗生素處理提純的微細胞制劑。還可以選擇一個預(yù)備步驟，對含有微細胞的樣品進行差速離心。在一個優(yōu)選實施例中，該系列橫向流動濾器包括(A)至少一個或兩個孔徑大于或等于0.45微米的濾器以及(B)至少一個或兩個孔徑小于或等于0. 2微米的濾器。


圖1顯示了一幅正常細菌細胞分裂以及min基因突變?nèi)绾螌?dǎo)致微細胞形成的示意圖。圖2顯示了一幅用于產(chǎn)生產(chǎn)微細胞細菌株的質(zhì)粒制劑示意圖。特別的，該圖顯示了可用于生成一種產(chǎn)傷寒桿菌來源微細胞細菌株的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。顯示了克隆的插入DNA以及環(huán)形質(zhì)粒載體部件的素描。質(zhì)粒的名稱以粗體顯示在插入DNA的左側(cè)以及環(huán)形載體圖的內(nèi)部。在使用PCR引物產(chǎn)生克隆的地方，引物編號顯示在鄰近虛線箭頭處。
圖3顯示了一幅可用于產(chǎn)生一種產(chǎn)微細胞細菌株的質(zhì)粒制劑示意圖。特別的，該圖顯示了一種質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，以產(chǎn)生一種產(chǎn)志賀氏痢疾桿菌加來源微細胞的細菌株。圖4顯示了一幅可用于產(chǎn)生一種產(chǎn)微細胞細菌株的質(zhì)粒制劑示意圖。特別的，該圖顯示了一種質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，以生成一種產(chǎn)李斯特單胞菌來源微細胞的細菌株。圖5A-圖5F顯示了經(jīng)傷寒桿菌來源的微細胞轉(zhuǎn)染的小鼠巨噬細胞的透射電子顯微鏡像。對于每一幅照片提供了轉(zhuǎn)染后的時間和放大倍數(shù)。照片顯示了巨噬細胞空泡內(nèi)的微細胞樣電子致密顆粒(箭頭)。圖6A-圖6C顯示了微細胞介導(dǎo)的基因傳輸至乳腺癌細胞和異種基因表達。照片圖 6A顯示用非重組微細胞轉(zhuǎn)染96小時后的對照乳腺癌細胞系SK-BR-3，標記物為抗HER-2抗體，檢測物為與Alexafluor結(jié)合的第二抗體。照片圖6B顯示了用攜帶pEGFP-Cl質(zhì)粒的重組微細胞轉(zhuǎn)染96小時后，SK-BR-3細胞中GFP的表達(GFP的真核表達)。照片圖6C顯示了用微細胞/pEGFP-Cl轉(zhuǎn)染的SK-BR-3細胞，標記物為抗HER-2抗體，檢測物為與Alexaf Iuor 結(jié)合的第二抗體。圖像可以用共焦顯微鏡觀察。圖7顯示了腹膜內(nèi)給予攜帶pEGFP-Cl質(zhì)粒的重組微細胞和滅活傷寒沙門氏菌14 天后的小鼠血清抗GFP反應(yīng)。在圖例以及圖8-10的圖例中，10*8和10*9分別代表IO8和 IO90圖8顯示了腹膜內(nèi)給予攜帶pEGFP-Cl質(zhì)粒的重組微細胞和滅活傷寒沙門氏菌14 天后的小鼠血清抗LPS反應(yīng)。圖9顯示了腹膜內(nèi)給予攜帶pEGFP-Cl質(zhì)粒的重組微細胞14天后，小鼠的血清抗 GFP反應(yīng)。圖10顯示了腹膜內(nèi)給予攜帶pEGFP-Cl質(zhì)粒的重組微細胞14天后，小鼠的血清抗 LPS反應(yīng)。
具體實施例方式本發(fā)明者已經(jīng)測定具有完整細胞壁的微細胞(“完整微細胞”)是用于在體外或體內(nèi)將寡核苷酸與多聚核苷酸(總的說來，“核酸分子”)傳輸至宿主細胞(優(yōu)選人或動物體內(nèi)的哺乳動物細胞)的有效載體。因此，發(fā)明者發(fā)現(xiàn)完整的微細胞可以被哺乳動物細胞所吞噬，就像吞噬取得微細胞的細菌細胞(“親代細菌細胞”)那樣。另外還發(fā)現(xiàn)，令人驚訝的，完整重組微細胞的成分被宿主細胞吞噬后，經(jīng)過這種方式的處理，至少有一些來自微細胞的質(zhì)粒DNA能夠逃脫降解并被運輸穿過胞漿，直至宿主細胞核，隨后宿主細胞可以表達該質(zhì)粒DNA。因此，依據(jù)本發(fā)明，將一種攜帶需要進行異源性表達之DNA的完整微細胞在體內(nèi)或體外與一種能夠以細胞內(nèi)細菌致病原的方式吞噬親代細菌細胞的哺乳動物細胞相接觸。 出于同樣的原因，那種哺乳動物細胞，這里表示為“有吞噬能力的”，能夠吞噬微細胞并表達所討論的DNA。在完整微細胞被給定類型宿主細胞吞噬的過程中涉及到多種機制，而本發(fā)明在這方面不依賴于任何一種特殊機制。例如，噬菌作用是一種經(jīng)過良好證明的程序，其中巨噬細胞以及其他吞噬細胞，例如嗜中性粒細胞，通過伸展偽足覆蓋顆粒表面直至完全包裹顆粒來攝入顆粒。盡管被描述為“非特異性”的噬菌作用，在此過程中仍然顯示涉及到特異性受體。見 Wright&Jong(l986 年)；Speert 等人(1淵8 年)。因此，一種形式的噬菌作用涉及表面配體與偽足膜上配體受體之間的相互作用 (Shaw和Griffin，1981年)。這種由特殊受體介導(dǎo)的附著步驟被認為依賴于細菌表面的粘附因子。至于毒性更低的細菌，例如不產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌，噬菌作用還可以在缺乏噬菌細胞受體的表面配體的條件下發(fā)生。例如，參見Pikaar等人(19%)。因此，本發(fā)明包括但不局限于具有或缺乏表面粘附因子的完整微細胞的使用，其保持了它們親代細菌細胞的特性，并且為噬菌細胞(例如“具備噬菌能力”的宿主細胞)所吞噬，哺乳動物體內(nèi)的主要噬菌細胞類型是嗜中性粒細胞和巨噬細胞。另一種吞噬過程是內(nèi)吞作用，其中細胞內(nèi)致病原的示例為進入哺乳動物上皮細胞并在那里復(fù)制的沙門氏菌、埃希氏菌、志賀氏菌、哈比特屬菌、假單胞菌和乳酸桿菌等菌屬。 在這一點上的兩種基本機制是內(nèi)涵素依賴受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，又稱作“被膜小窩內(nèi)吞作用”(Riezman，1993年)以及內(nèi)涵素非依賴的內(nèi)吞作用(Sandvig&Deurs，1994年)。根據(jù)本發(fā)明，當一種具吞噬能力的細胞通過內(nèi)吞作用(例如，“具內(nèi)吞能力的1主細胞)吞噬完整的重組微細胞并表達微細胞所攜帶的DNA時，可以涉及一種或兩種機制。代表性的具內(nèi)吞能力的細胞有乳腺上皮細胞、胃腸道內(nèi)的腸細胞、胃上皮細胞、肺上皮細胞以及尿道和膀胱上皮細胞。本發(fā)明尤其可以用于將核酸分子導(dǎo)入具吞噬能力的細胞，通過轉(zhuǎn)錄和/或翻譯， 用于改善或另外治療疾病或改變與患者的特殊細胞、組織或器官類型相關(guān)的特性。為了進行此項描述，這些分子被劃分為“治療性核酸分子”。例如，給定治療性核酸分子的轉(zhuǎn)錄或翻譯可以用于治療腫瘤或一種獲得性疾病， 比如艾滋病、肺炎、肺氣腫，或糾正先天性代謝失調(diào)，比如囊性纖維化。治療性核酸的轉(zhuǎn)錄和翻譯還可能實現(xiàn)絕育性滅菌，包括野生動物的絕育性滅菌。依據(jù)本發(fā)明，通過給予治療性核酸分子，在患者體內(nèi)表達，影響與相應(yīng)的變態(tài)反應(yīng)原和感染因子相關(guān)的免疫反應(yīng)，還能夠抵抗變態(tài)反應(yīng)原介導(dǎo)的炎性疾病以及感染因子介導(dǎo)的炎性疾病。一種治療性核酸分子還可以具有一種表達產(chǎn)物，或者有一種表達產(chǎn)物的翻譯后變體的下游產(chǎn)物，能夠減少與移植相關(guān)的免疫后遺癥或幫助促進組織生長和再生。換句話說，表達產(chǎn)物或相關(guān)的翻譯后介質(zhì)可以是一種蛋白質(zhì)，其代表為促紅細胞生成素，一種生長因子比如TGF-β，一種細胞因子比如IL-2、IL-10、IL-12或其他白介素， 一種血清無色蛋白酶抑制劑，或者一種抗體比如CTLA4-Ig，其能夠為宿主提供所需的受益。 其他類型的該種蛋白包括，沒有限制的，α-、β-和γ-球蛋白，胰島素，粒-巨噬細胞集落刺激因子，巨噬細胞集落刺激因子，促紅細胞生成素，腫瘤壞死因子，MGF，腺苷脫氨酶，腫瘤表面相關(guān)抗原比如病毒、突變或錯誤表達的抗原(⑶Κ4，0-連接素，&111-￥，01印8)，腫瘤特異性抗原比如MAGE、BAGE, GAGE、PRAME和NY-ES0-1，分化抗原比如酪氨酸酶、Melan-A/ MART-I、gplOO和TRP-l/gp75，以及過度表達的抗原比如Her2/neu和CEA。治療性核酸分子的進一步分類示例為分別編碼囊性纖維化跨膜調(diào)解器(CFTR)，VIII因子或其他血液蛋白，低密度脂蛋白受體，β-葡糖腦苷脂酶，α-和β-半乳糖苷酶，胰島素，甲狀旁腺素， α -1-抗胰蛋白酶，fasR以及fasL的DNA。依據(jù)本發(fā)明，由宿主細胞進行的治療性核酸分子的表達能夠提供一種所需的化合物，其能夠調(diào)解靶向免疫反應(yīng)或干擾病變。例如，一種治療性核酸分子可以用于反義或核糖酶治療。在此背景下，反義治療涉及引介一種依據(jù)本發(fā)明的多聚核苷酸序列拷貝，使得拷貝的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物與多聚核苷酸序列相應(yīng)的信使RNA (mRNA)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行原位雜交。這種雜交能夠典型的防止轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被翻譯成蛋白或者開始破壞mRNA的降解途徑。治療性核酸還可以在哺乳動物細胞中編碼短干擾RNA 二聯(lián)體(siRNA’ s)。更確切的說，siRNA’ s已經(jīng)顯示能夠在哺乳動物細胞中抑制目標基因。干擾RNA(RNAi)的這種過程是一種發(fā)生于動物、人類以及植物中的，序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因靜默法，并且由與被靜默基因同源的雙鏈(ds) RNA所發(fā)動。在多種細胞類型中已經(jīng)成功的顯示了 SiRNA的病毒介導(dǎo)傳輸能夠特異的減少目標基因的表達(Haibin等人，2002年)。對于所有這些以及其他各種治療性核酸分子的使用，本說明采用的標題為“基因治療”，它的意思也包含短語“基因轉(zhuǎn)染”、“基因傳輸”以及“基于基因的疫苗”，涉及用于將治療性核酸分子在體內(nèi)和體外轉(zhuǎn)染入宿主細胞的方法學(xué)或系統(tǒng)，就像例如U. S. patent No. 5，399，346中所描述的。因此，本發(fā)明的含微細胞組合物可以用于達到原位治療效果，以及用于在體外轉(zhuǎn)化細胞然后將其介導(dǎo)入患者體內(nèi)。依據(jù)本發(fā)明，適合于體內(nèi)和體外方法的細胞可以是那些具有吞噬能力的細胞，例如噬菌細胞和上皮細胞。如上所述，基因治療可以治療或防止遺傳性或獲得性疾病或病癥。治療性核酸分子編碼一種產(chǎn)物，比如功能性RNA(例如，反義或siRNA)或一種肽、多肽或蛋白，需要其在體內(nèi)產(chǎn)生。例如，所關(guān)心的遺傳物質(zhì)可以編碼一種具有治療價值的激素、受體、酶或(多)肽。 這種方法可以導(dǎo)致非整合的被轉(zhuǎn)染DNA的短暫表達、染色體外復(fù)制以及被轉(zhuǎn)染復(fù)制子比如游離基因的表達，或者被轉(zhuǎn)染遺傳物質(zhì)整合入宿主細胞的染色體組DNA。治療性核酸分子可以是一種基因的正常對應(yīng)物，其編碼的蛋白質(zhì)功能異常或在疾病狀態(tài)下以異常水平存在，通常是這樣，例如囊性纖維化中的囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)性調(diào)解器(Kerem等人，1989年；Riordan等人，1989年；Rommens等人，1989年)，鐮刀狀細胞貧血中的β-球蛋白，以及地中海貧血中的任一種α-球蛋白、β-球蛋白和Y-球蛋白。如上所述，治療性核酸分子可以具有一種反義RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或小的干擾RNA。因此，依據(jù)本發(fā)明， 使用一種經(jīng)過操作含有質(zhì)粒的完整微細胞，基因治療可以改善特性為α-球蛋白相對于 β-球蛋白過度產(chǎn)生的β-地中海貧血，該質(zhì)粒整合了一種序列，其具有與α-球蛋白mRNA 的目標序列相對的反義RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在腫瘤的治療中，依據(jù)本發(fā)明適合使用的治療性核酸分子可以具有一種序列，其相應(yīng)于或來自與腫瘤抑制相關(guān)的基因，例如P53基因、視網(wǎng)膜母細胞瘤基因、以及編碼腫瘤壞死因子的基因。依據(jù)本發(fā)明，通過這種方法可以治療多種實體腫瘤-癌、乳頭瘤以及疣。 在這一點上的代表腫瘤包括結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、頭部和頸部腫瘤以及淋巴瘤。 作為例證的乳頭瘤是鱗狀細胞乳頭瘤、脈絡(luò)叢乳頭瘤以及喉部乳頭瘤。疣病的實施例為生殖器疣、足底疣、疣狀表皮發(fā)育不良以及惡性疣。用于本發(fā)明的一種治療性核酸分子還可以含有一個DNA片段，其編碼將無活性前體藥物轉(zhuǎn)化成一種或多種細胞毒性代謝物的酶，使得在體內(nèi)引入前體藥物時，有效的靶細胞被強迫，可能與鄰近細胞一起，進行自殺。Spencer (2000年)，Siangra等人(2000年) 以及^zawa等人(2002年)回顧了該種非人類來源和人類來源“自殺基因”的臨床前以及臨床使用。非人類來源自殺基因的例子包括那些分別編碼HSV-胸腺嘧啶脫氧核苷激酶(rk)、胞嘧啶脫氨酶(CDA) +尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)染酶、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)染酶(GPT)、硝基還原酶(NTR)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP，DeoD)、細胞色素P450 (CYP4B1)、羧肽酶 G2(CPG2)以及D型氨基酸氧化酶(DAAO)的基因。人類來源自殺基因的例子包括分別編碼羧肽酶 Al (CPA)、脫氧胞苷激酶(dCK)、細胞色素 P450 (CYP2B1，6)、LNGFR/FKBP/Fas, FKBP/ Caspases以及ER/p53的基因。依據(jù)本發(fā)明的自殺基因療法可以用于治療艾滋病。該方法已經(jīng)使用自殺載體進行了測試，一旦經(jīng)處理的哺乳動物細胞被HIV-I感染，該載體就表達一種毒性基因產(chǎn)物。在被 HIV-I感染后，這些載體使用HIV-I調(diào)節(jié)成分，Tat和/或Rev來誘導(dǎo)毒性基因比如α -白喉毒素、胞嘧啶脫氨酶或干擾素_a2的表達(Curiel等人，1993年；Dinges等人，1995年； Harrison等人，1992a ；Harrison等人，1992b ；Ragheb等人，1999年)。使用本發(fā)明的重組微細胞法，在HIV感染后，細胞可以被這些載體轉(zhuǎn)換并比未轉(zhuǎn)換細胞清除的更快，以細胞死亡為代價防止病毒的復(fù)制。通過本發(fā)明的方法引入的一種核酸分子可以包括一種指示成分。指示成分典型的通過編碼一種在其他情況下宿主無法產(chǎn)生的多肽，使得它的重組宿主具有易于檢測的表型或特性，經(jīng)過表達后，該多肽可以被組織學(xué)或原位分析，比如體內(nèi)成像技術(shù)所檢測到。例如， 依據(jù)本發(fā)明的完整微細胞所傳輸?shù)囊环N指示成分可以編碼一種能夠在吞噬性宿主細胞中產(chǎn)生比色分析或熒光分析改變的蛋白，該變化可以通過原位分析檢測并且是轉(zhuǎn)錄活性的一種定量或半定量函數(shù)。這些蛋白的示例包括酯酶、蛋白酶和其他酶，它們的活性能夠產(chǎn)生一種可檢測的發(fā)色團或熒光團。優(yōu)選的實施例是大腸桿菌β -半乳糖苷酶，其通過裂解產(chǎn)靛青底物吲哚-β -D-半乳糖苷來導(dǎo)致色彩變化，以及一種熒光素酶，其能夠氧化一種長鏈醛(細菌熒光素酶)或一種雜環(huán)羧酸(熒光素)，伴隨光的釋放。在此范圍內(nèi)同樣有用的是一種指示成分，其能夠編碼水母Aequorea victoria的綠色熒光蛋白(GFP)，正如Prasher等人所述(1995年)。 兩項已經(jīng)發(fā)布的PCT申請，WO 095/21191(公布了編碼一種238個氨基酸的GFP脫輔基蛋白的多聚核苷序列，該脫輔基蛋白含有從氨基酸65至氨基酸67組成的發(fā)色團)和WO 095/21191 (公布了 A. Victoria GFP脫輔基蛋白cDNA的一種變體，其提供了一種肽，具有改變的熒光特性)舉例說明了 GFP相關(guān)技術(shù)的領(lǐng)域，并且Heim等人(1994年)報告了一種突變GFP，其特性為激發(fā)振幅提高了 4至6倍。其他類型的指示成分涉及一種表達產(chǎn)物，其能夠使重組微細胞抵抗毒素。例如， neo基因能夠保護宿主抵抗毒性水平的抗生素G418，而一種編碼二氫葉酸還原酶的基因能夠產(chǎn)生甲氨蝶呤耐藥性，并且氯霉素乙?；D(zhuǎn)染酶(CAT)基因能夠賦予對氯霉素的耐藥性。用作指示成分的其他基因包括那些能夠轉(zhuǎn)化宿主微細胞以表達特異細胞表面抗原，例如病毒外殼蛋白比如HIV gpl20或皰疹gD的基因，其易于為免疫測定所檢測到。按照本發(fā)明方法引介的核酸分子還可以具有操作連接至調(diào)節(jié)成分，例如啟動子、 終止子、增強子和/或信號序列的所需編碼片段。一種合適的啟動子可以是組織特異性或者甚至腫瘤特異性的，如同治療范圍所規(guī)定的那樣。當啟動子偏向于在特定的組織中激活，并且因此在靶組織中生效，促進操作連接的結(jié)構(gòu)序列表達時，它是“組織特異性”的。組織特異性啟動子的范疇包括，例如白蛋白和 al_抗胰蛋白酶各自的肝細胞特異性啟動子；彈性蛋白酶I基因控制區(qū)，其在胰腺泡細胞中是具有活性的；胰島素基因控制區(qū)，在胰腺β細胞中具有活性；小鼠乳腺腫瘤病毒控制區(qū)， 其在睪丸、乳房、淋巴和肥大細胞中具有活性；髓磷脂基礎(chǔ)蛋白基因控制區(qū)，其在大腦的少突細胞中具有活性；以及促性腺釋放激素基因控制區(qū)，其在下丘腦細胞中具有活性。參見 Frain 等人，(1990 年)，Ciliberto 等人(1985 年)，Pinkert 等人(1987 年)，Kelsey 等人 (1987 年)，Swift 等人(1984 年)，MacDonald (1987 年)，Hanahan (1985 年)，Leder 等人 (1986 年)，Readhead 等人(1987 年)以及 Mason 等人(1986 年)。還有偏向于在某些腫瘤細胞或本質(zhì)是腫瘤細胞中表達的啟動子，依據(jù)本發(fā)明其可以用于治療不同的腫瘤。此類腫瘤細胞特異性啟動子的示例有酪氨酸酶啟動子，目標為黑色素瘤；MUCl/Df3啟動子，目標為乳腺癌；雜交myoD增強子/SV40啟動子，表達目標為橫紋肌肉瘤(RMS)；癌胚抗原(CEA)啟動子，其為CEA表達細胞比如大腸癌細胞特異性的，以及己糖激酶II型基因啟動子，目標為非小細胞肺癌。參見Hart(1996年)， Morton&Potter (1998 年)，Kurane 等人(1"8 年)以及 Katabi 等人(1"9 年)。依據(jù)本發(fā)明，可以使用一種信號序列來實現(xiàn)表達產(chǎn)物的分泌或?qū)⒁环N表達產(chǎn)物定位至特殊的細胞室。因此通過完整微細胞傳輸?shù)囊环N治療性多聚核苷酸分子可以包括一個位于合適的閱讀框架中的信號序列，使得所關(guān)心的表達產(chǎn)物由吞噬細胞或其子代分泌，從而影響周圍的細胞，與所選擇的治療范例相一致。信號序列的示例包括U. S. patent No. 5，143，830中描述的溶血素C末端分泌序列，U. S. patentNo. 5，037，743中公開的BARl 分泌序列，以及U. S. patent No. 6，025，197中描述的zsig32多肽的信號序列部分。如上所述，本發(fā)明的完整重組微細胞保持體內(nèi)完整性的能力使得它們可以用于基因治療。完整微細胞不攜帶重組細菌細胞例如，志賀氏痢疾桿菌、李斯特單胞菌、大腸桿菌或傷寒沙門氏菌中存在的細菌染色體組DNA，而其他細胞已經(jīng)用其將真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入宿主細胞。參見Sizemore等人(1"5年)；Gentschev等人(2OOO年)；Catic等人(1"9 年)；Dietrich等人(1998年)；以及Courvalin等人(1995年)。因此，依照本發(fā)明使用完整微細胞的基因治療不會伴有與使用重組細菌和將一種細菌或耐抗生素標記基因無意識的轉(zhuǎn)染至患者固有微生物菌叢相關(guān)的風險。另外，必須通過細胞介導(dǎo)的免疫性從患者體內(nèi)清除重組細菌，因此重組細菌不適合用于對患有例如腫瘤或艾滋病的免疫受損患者進行基因治療?？梢詮娜魏胃锾m氏陽性或革蘭氏陰性來源的細菌細胞中制備微細胞。由于本發(fā)明使用完整微細胞而不是微細胞原生質(zhì)，本發(fā)明不需要并且優(yōu)選不涉及對微細胞進行任何抗生素或化學(xué)預(yù)處理?？梢酝ㄟ^min基因的突變，例如min⑶E基因序列的部分缺失來生成產(chǎn)微細胞細菌株，如下面的實施例1和2中所示。為了獲得重組的完整微細胞，依據(jù)本發(fā)明， 通過標準技術(shù)對所選擇產(chǎn)微細胞菌株的細菌細胞進行轉(zhuǎn)化，標準技術(shù)包括但不局限于使用電穿孔(Shigekawa&Dower, 1988年)，化學(xué)方法(Hanahan, 1983年)，往復(fù)式載體 (Marcil&Higgins，1992年)以及結(jié)合作用(Firth等人，1996年)或傳導(dǎo)(Davis等人，1980 年)。為了這種轉(zhuǎn)化，將來自任何真核、原核或合成來源的治療性核酸分子插入一種合適的市售或終端用戶專有的質(zhì)粒載體中。所選擇的DNA可以被操作連接至所需控制成分，用于體內(nèi)的基因傳輸和/或DNA在吞噬重組微細胞的細胞中進行表達。優(yōu)選在體外對重組微細胞進行分析以確保它們能夠?qū)⒅亟M質(zhì)粒或DNA序列傳輸至靶細胞核，并且在靶細胞中發(fā)生重組基因的表達。對表達的檢測將取決于異源性基因的特性。可以通過多種方法監(jiān)測表達，包括免疫學(xué)、組織化學(xué)或活性檢驗。熒光標記基因的表達可以通過顯微鏡觀察，并且此特性提供了一種特別方便的檢驗。例如，處于真核基因表達啟動子，例如CMV啟動子控制下的編碼綠色熒光蛋白的基因，可以在質(zhì)粒上通過重組微細胞轉(zhuǎn)染至真核靶細胞(參見下面)。另外，使用合適的DNA或RNA探針，northern印跡分析或逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)可以用于評價轉(zhuǎn)錄。如果可以獲得異源性基因所編碼多肽的抗體，Western印跡分析、免疫組化或其他免疫學(xué)技術(shù)均可用于評價多肽的產(chǎn)生。如果異源性基因是一種酶，則也可使用合適的生化檢驗。例如，如果異源性基因編碼抗生素耐藥性，那么測定被感染細胞對抗生素的耐藥性可以用于評價抗生素耐藥基因的表達。可以通過測定培養(yǎng)物中的DNA傳輸效率來評價推定宿主(“靶”)細胞的吞噬能力。因此，可以對靶腫瘤進行活檢，所產(chǎn)生的組織樣品將以傳統(tǒng)方式使用，通過培養(yǎng)獲得代表腫瘤細胞，以測定其吞噬本發(fā)明中攜帶，例如，一種合適指示成分的重組微細胞的能力。除了測定這種主要細胞培養(yǎng)物外或者另外，依據(jù)本發(fā)明，可以通過測試治療方案中關(guān)鍵類型組織的代表細胞系來測量吞噬微細胞的能力。細胞培養(yǎng)技術(shù)的文獻很多，例如 Freshner(1992)。依據(jù)本發(fā)明，可以通過數(shù)種方法從母細胞中提純重組微細胞。一種方法使用例如 Reeve (1979年)和Clark-Curtiss等人(1983年)所描述的蔗糖梯度法，隨后用抗生素，比如慶大霉素進行處理O00微克/毫升，2小時)以殺滅殘存的活菌。使用傳統(tǒng)方法所獲得的最佳純度為1個污染母細胞/IO6-IO7個微細胞。依據(jù)本發(fā)明，對于體內(nèi)使用而言，所需劑量高于IO6并且可能高達101°/每劑，按照前述污染比率，將轉(zhuǎn)化為10，000個活母細胞/每劑。這種污染水平會是致命的，尤其是在免疫受損的患者中。另外，傳統(tǒng)方法使用含有梯度形成劑的介質(zhì)，比如蔗糖、甘油或Percoll ·，它們的存在對于體內(nèi)使用是有害的，正如現(xiàn)在所考慮的。因此，Percoll ·的毒性將其限制于“僅用于研究目的”的范圍內(nèi)，而用于產(chǎn)生梯度的蔗糖會產(chǎn)生高滲透壓，導(dǎo)致微細胞發(fā)生生理學(xué)改變。因此，為了應(yīng)用于依據(jù)本發(fā)明之基因治療，優(yōu)選將母細胞污染最小化并使用生物兼容性更好的介質(zhì)。為了達到這些目標，本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)將橫向流動過濾(供液與膜表面平行)與終端過濾(供液與膜表面垂直)聯(lián)合使用會有意想不到的好處。通常的，參見 Forbes (1987年)。在這種聯(lián)合前可以選擇進行差速離心，在低離心力下除去一部分細菌細胞并從而使微細胞的上清液濃縮。還可以選擇在聯(lián)合后進行抗生素處理以殺滅殘存親代細菌細胞。橫向流動過濾可以依靠濾器的孔徑將微細胞從更大的污染物，比如親代細菌細胞，以及更小的污染物，比如細菌氣泡、游離內(nèi)毒素、核酸細胞碎片以及多余的液體中分離。 為了從更大的污染物中分離微細胞，橫向流動濾器的標稱孔徑應(yīng)當允許微細胞透過濾器， 而留下更大的細菌細胞。優(yōu)選0. 45微米的孔徑用于此目的，因為微細胞的直徑大約為0. 4 微米，而細菌細胞更大。為了從更小的污染物中分離微細胞，橫向流動濾器的標稱孔徑應(yīng)當允許更小的污染物透過濾器，而留下微細胞。優(yōu)選0. 2微米的孔徑用于此目的，其他更小的污染物都小于0.2微米。在此條件下有效的使用活性流動濾器典型的需要至少有一個步驟涉及大孔徑，大約0. 45微米，然后至少有一個步驟涉及小孔徑，大約0. 2微米。在連續(xù)橫向流動過濾的步驟之間或之中，可以進行透濾以盡可能多的回收微細胞。橫向流動過濾的使用可以容納攜帶大量顆粒物質(zhì)的懸濁液，例如細菌培養(yǎng)物，其攜帶的細胞負荷為IO11至IO13個細菌和微細胞群體/升培養(yǎng)物。為了使濾器淤塞與隨后的微細胞丟失最小化，可以將細菌/微細胞培養(yǎng)物進行稀釋，優(yōu)選稀釋5至10倍。稀釋后還能使用適當?shù)牡痛髿鈮号c流率。為了在橫向流動過濾后除去殘存的親代細胞殘余物，進行終端過濾。為此，優(yōu)選使用大約0. 45微米的孔徑進行至少一次終端過濾。通常，過濾可以提供適合于轉(zhuǎn)基因研究的微細胞無菌制劑。為了進行體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染，優(yōu)選進一步用抗生素處理以降低細菌細胞污染的風險。例如，可以用含有親代細菌株敏感抗生素的生長介質(zhì)重懸微細胞。事先可以用傳統(tǒng)技術(shù)測定為此應(yīng)給予抗生素的合適數(shù)量。連續(xù)橫向流動過濾/終端過濾排列，正如所述，不但省卻了梯度形成劑的使用， 還提供了超過10_7的純度(也就是少于1個親代細胞/IO7個微細胞)。優(yōu)選純度超過 IO-8,并且更優(yōu)選近似于10_9的純度。連續(xù)橫向流動過濾/終端過濾還提供了更好的質(zhì)量控制。另外，無需氨卞青霉素、環(huán)絲氨酸或其他抗生素的耐藥基因，如Clarke-Curtiss和 Curtiss (1983)的技術(shù)所需的。此外，與Sancar等人(1979年)描述的方法不通，連續(xù)純化法不使用任何破壞DNA的射線；因此，使用通過連續(xù)橫向流動過濾/終端過濾排列制備的微細胞所傳輸?shù)闹委熜院怂岱肿硬缓蟹派渚€誘導(dǎo)的非特異性突變。本發(fā)明中實質(zhì)由重組微細胞組成的組合物(更確切的說，一種化合物，其包括該微細胞和其他不對組合物的DNA傳輸質(zhì)量產(chǎn)生不當影響的成分)可以使用一種和多種生理學(xué)上可接受的載體和賦形劑，通過傳統(tǒng)方法制造。用于注射的配方可以以單位劑量的形式，例如在安瓿或小瓶，或在多劑容器中提供，含有或不含輔助額外的防腐劑。配方可以是溶液、懸濁液或在油性或水性媒介中的乳劑，并可以含有配劑，比如懸浮、穩(wěn)定和/或分散劑。合適的溶液是接受者血液的等張液，其示例有生理鹽水、林格氏液以及右旋糖溶液。另外，微細胞可以是凍干粉的形式，用于與合適的媒介，例如無菌、無熱源水或生理鹽水重新復(fù)原。微細胞還可以制成長效制劑。這種長效配方可以通過移植(例如，皮下或肌肉內(nèi)) 或者肌肉內(nèi)注射給藥。本發(fā)明的含有微細胞組合物可以通過各種途徑給藥至哺乳動物身體的各種部位， 以獲得所需的局部或全身治療效果?？梢酝ㄟ^例如口服、將制劑用于體腔、吸入或吹入、或經(jīng)腸道、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、門脈內(nèi)、肝內(nèi)、腹膜、皮下、腫瘤內(nèi)或皮內(nèi)給藥完成傳輸。所考慮應(yīng)用的特性同樣影響(或者受影響)用于傳輸治療性核酸分子的重組微細胞細菌源的選擇。例如，沙門氏菌、埃希氏菌和志賀氏菌屬攜帶的附著因子能夠被胃腸道中腸細胞上的內(nèi)吞作用介導(dǎo)受體所識別，可能適合于口服給藥，用于傳輸對結(jié)腸癌細胞有效的治療性核酸分子。類似的，來自幽門螺旋桿菌的微細胞攜帶胃上皮細胞特異性的附著因子，適合于目標為胃癌細胞的口服傳輸。對于來自假單胞菌屬的完整微細胞，其攜帶的附著因子能夠為肺上皮細胞所識別，則吸入或吹入可能是理想的給藥方法；將編碼比如CFTR蛋白的治療性核酸分子傳輸至囊性纖維化患者的肺部。來自乳酸桿菌的微細胞攜帶尿道和膀胱上皮細胞特異的附著因子，非常適合于將治療性核酸分子從尿道內(nèi)傳輸至尿道或膀胱腫
本發(fā)明可以用于傳輸一列核酸分子，它可以是cDNA和染色體組DNA或RNA，并且其方向可以是順義或反義。依照本發(fā)明，在完整微細胞中存在的核酸分子可以是質(zhì)粒、表達載體或其他遺傳結(jié)構(gòu)的形式，但不能是來自產(chǎn)生微細胞的細菌細胞的染色體組DNA。適合于在本發(fā)明中使用的序列包括來自真核、原核或合成來源的任何所需DNA或RNA序列，其能夠受控于真核基因表達啟動子的翻譯和轉(zhuǎn)錄控制，或能夠使用來自宿主細胞的反激活因子在哺乳動物細胞中表達。實施例^MMl^從革蘭氏陰性細菌，傷寒沙門氏菌，大腸桿菌和志賀氏痢疾桿菌中產(chǎn)生細菌微細胞如這里所述(A，B和C)以及圖2和3所示，從革蘭氏陰性細菌中產(chǎn)生產(chǎn)微細胞細菌株。常規(guī)材料和方法在下面的例子中所用的細菌株列在并請參考表1。所有的細菌都生長自保存于-80攝氏度的甘油原料。沙門氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌以及李斯特菌株都生長在胰酶解酪蛋白大豆肉湯(TSB) (BBL 牌，購自 Bacto Labs, Liverpool, NSW, Australia)中。根據(jù)制造商的說明制備成30克/升，并在121攝氏度高壓滅菌15分鐘。液體培養(yǎng)物生長于37攝氏度的搖動培育箱內(nèi)。通過放置于XLD瓊脂(木糖-賴氨酸-去氧膽酸鹽)盤上分別產(chǎn)生紅色和黃色群落來區(qū)分志賀氏菌株與大腸桿菌。XLD購自O(shè)xoid (Melbourne，Australia)。 根據(jù)生產(chǎn)商的說明制備成53克/升，然后煮沸2分鐘。在液體和固體媒介中按照下列濃度使用抗生素氨卞青霉素，100微克/毫升，氯霉素，30微克/毫升，卡那霉素，30微克/毫升。表1.所用的細菌株
權(quán)利要求
1.一種組合物，其包括(i)重組的完整微細胞以及(ii)為此的一種藥學(xué)上可接受的載體，其中所說的微細胞含有一種治療性核酸分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所說的組合物所含污染物低于1個污染親代細菌細胞/IO7個微細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所說的組合物所含污染物低于1個污染親代細菌細胞/IO8個微細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所說的組合物所含污染物低于1個污染親代細菌細胞/IO9個微細胞。
5.一種組合物，其實質(zhì)上由含有一種治療性核酸分子的重組完整微細胞所組成。
6.一種遺傳轉(zhuǎn)化方法，其包括(i)提供重組的完整微細胞，其含有一種由第一核酸序列組成的質(zhì)粒，以及(ii)將上述微細胞與具有噬菌作用或內(nèi)吞作用的哺乳動物細胞接觸， 使得上述微細胞被該哺乳動物細胞吞噬，哺乳動物細胞借此產(chǎn)生該第一核酸序列的一種表達產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所說的哺乳動物細胞位于體內(nèi)，并且所說的第一核酸序列編碼治療性表達產(chǎn)物。
8.—種提純方法，其包括將含有微細胞的樣品(i)通過一系列橫向流動濾器，然后 (ii)通過一個終端濾器，借此從該樣品的污染物中分離微細胞，以獲得純化的微細胞制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的一種方法，其進一步包括用抗生素處理該純化微細胞制劑的步馬聚ο
10.根據(jù)權(quán)利要求8的一種方法，其進一步包括一個預(yù)備步驟，將上述含有微細胞的樣品進行差速離心。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的一種方法，其中所說的一系列橫向流動濾器包括至少1個孔徑大于或等于0. 45微米的濾器，以及至少一個孔徑小于或等于0. 2微米的濾器。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的一種方法，其中所說的終端濾器的孔徑為大約0.45微米。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的一種方法，其中所說的一系列橫向流動濾器包括至少2個孔徑為大約0. 45微米的濾器，以及至少1個孔徑為大約0. 2微米的濾器。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的一種方法，其進一步包括用抗生素處理該純化微細胞制劑的步馬聚ο
15.一種重組完整微細胞在藥物的制備過程中的用途，該微細胞含有治療性核酸分子， 用于治療疾病或通過將該藥物給予細胞、組織或器官以改變特性的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及用作體外和體內(nèi)DNA轉(zhuǎn)染與基因治療載體的完整微細胞。具體而言，本發(fā)明公開了一種組合物，其包括(i)重組的完整微細胞以及(ii)為此的一種藥學(xué)上可接受的載體，其中所說的微細胞含有一種治療性核酸分子。本發(fā)明還公開了一種遺傳轉(zhuǎn)化方法，其包括(i)產(chǎn)生可利用的重組完整微細胞，其含有一種由第一核酸片段組成的質(zhì)粒，以及(ii)將微細胞與具有吞噬能力的哺乳動物細胞接觸，使得微細胞被哺乳動物細胞吞噬，其隨后產(chǎn)生第一核酸片段的一種表達產(chǎn)物。另外，本發(fā)明還公開了用于提純這種微細胞制劑的方法以及重組完整微細胞在藥物的制備過程中的用途。
文檔編號C12N1/21GK102172406SQ20111002640
公開日2011年9月7日 申請日期2002年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月15日
發(fā)明者H·布拉姆哈特, J·麥克戴爾米德 申請人:恩吉尼克分子傳遞私人有限公司