專利名稱：一種利用食品級啟動子表達(dá)牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域中一種表達(dá)牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽的食品級載體和工程菌。
背景技術(shù)：
牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽(Beefy Meaty Peptide, BMP)最初是從牛肉的木瓜蛋白酶水解物中分離得到，其一級結(jié)構(gòu)為Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-leu-Ala。BMP與食鹽、MSG有較好的協(xié)同呈味的作用，并且具有很好的熱穩(wěn)定性，適合于食品工業(yè)生產(chǎn)中的熱處理要求。因此，BMP有望代替MSG成為新一代風(fēng)味強(qiáng)化劑，具有廣闊的市場前景。畢赤酵母是一個理想的外源蛋白表達(dá)體系，它具有真核生物表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)，能夠?qū)δ康牡鞍走M(jìn)行類似高等真核生物的信號肽剪切、二硫鍵形成、糖基化等過程的翻譯后蛋白加工；能進(jìn)行大體積高密度連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)；自身分泌蛋白少等優(yōu)秀的特點(diǎn)。誘導(dǎo)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了 400多種蛋白的表達(dá)，并且廣泛地應(yīng)用在工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)研究中。畢赤酵母具有較強(qiáng)的醇氧化酶基因(alcohol oxidase, A0X)啟動子,可在甲醇誘導(dǎo)下嚴(yán)格控制外源基因的表達(dá)，然而AOX啟動子需要甲醇誘導(dǎo)存在食品安全的隱患，需要開發(fā)一種沒有毒害的誘導(dǎo)物或表達(dá)方式。本發(fā)明利用組成型、半乳糖誘導(dǎo)型啟動子進(jìn)行對牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，該啟動子不需要甲醇或其它有害物質(zhì)誘導(dǎo)就可進(jìn)行對外源基因的表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是通過對成熟畢赤酵母表達(dá)體系中啟動子的改造，構(gòu)建成一個無毒害、更安全的微生物食品級表達(dá)體系。本發(fā)明所提供表達(dá)體系是通過將食品級表達(dá)載體整合畢赤酵母而構(gòu)建完成的。所述的表達(dá)載體含有串連多拷貝的牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽表達(dá)基因和組成型啟動子、半乳糖誘導(dǎo)型啟動子。所述巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體為可為pPIC9、pPIC3、pPIC3K、pPIC3. 5K、pHIL_D2、 pPICZA、pPICZAB、pPICZAC、pPIC9K、pAC0815、pPICZetA、pPICZetB、pPICZetC 或 pHIL-Sl。所述巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體優(yōu)選為PPIC9。所述組成型啟動子、半乳糖誘導(dǎo)型啟動子，其特征在于所述表達(dá)啟動子為GAP、 PGKI、YPTI、TP11、ENOI、HSP82、SSA4、KAR2、RSP7、RSP2、REP31、PET9、TEFI、THI11、GALI。所述巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體啟動子優(yōu)選為GAP。所述多拷貝的牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽表達(dá)基因?yàn)榇?lián)多拷貝。所述多拷貝的牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽表達(dá)基因優(yōu)選為16拷貝。含有上述表達(dá)牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽的巴斯德畢赤酵母表達(dá)菌株也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明針對牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽來源少、生產(chǎn)成本高的問題，通過構(gòu)建工程菌，將多拷 貝串連的牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽表達(dá)基因和組成型表達(dá)啟動子GAP與酵母表達(dá)載體pPIC9連接， 與畢赤酵母基因組整合，獲得了能高效表達(dá)牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽的工程菌。本發(fā)明的生產(chǎn)方法 目的性強(qiáng)，產(chǎn)品純度高，產(chǎn)量高，產(chǎn)品性狀穩(wěn)定，提供了一種大規(guī)模廉價生產(chǎn)牛肉風(fēng)味強(qiáng)化 肽的方法。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)方法如下1、組成型表達(dá)載體的構(gòu)建首先以畢赤酵母基因組為模板，PCR得到組成型啟動子GAP的序列，通過EcoR I、 Not I兩個限制性酶切位點(diǎn)將pPIC9質(zhì)粒的甲醇誘導(dǎo)啟動子A0X換成組成型啟動子GAP。2、表達(dá)載體整合酵母染色體將構(gòu)建好的表達(dá)質(zhì)粒用SacI線性化后電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入畢赤酵母與其基因組進(jìn)行整 合，構(gòu)建成組成型畢赤酵母表達(dá)體系。在YPG培養(yǎng)基中，通過搖瓶發(fā)酵得到目的蛋白牛肉風(fēng) 味強(qiáng)化肽。3、中空纖維超濾濃縮發(fā)酵液中的BMP 發(fā)酵原液離心后獲得的上清液經(jīng)過60kDa中空纖維超濾膜，除去菌體碎片和大的 雜質(zhì)。16BMP的分子量是16kD，所以再選擇截留分子量為6000D的超濾膜進(jìn)行濃縮，這樣， 既不損失過多的蛋白，又會除去鹽和小分子雜質(zhì)。表達(dá)發(fā)酵液通過中空纖維超濾膜，使發(fā)酵 液體積濃縮20倍。由此證明，中空纖維超濾膜可以高效的濃縮發(fā)酵液，使目的蛋白濃縮，為進(jìn)一步的 提純工作提供了時間及空間的節(jié)省作用。
具體實(shí)施方案為了理解本發(fā)明，下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不限制本發(fā)明。實(shí)施案例1 :用一對引物從畢赤酵母染色體中PCR得到的組成型啟動子GAP目的片段。PCR反應(yīng)體系及程序如下ddH208 u L模板DNA1 u LUp 引物0.5uLDown 引物0. 5 u L2 X Taq Plus PCR MasterMix10 u L_總體系20iUL反應(yīng)程序如下
權(quán)利要求
1.表達(dá)牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽的載體，使多拷貝牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽基因在組成型啟動子、半乳糖誘導(dǎo)型啟動子的控制下，由巴斯德畢赤酵母表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽表達(dá)載體，其特征在于所述基因表達(dá)啟動子為組成型啟動子或半乳糖誘導(dǎo)型啟動子，所述表達(dá)啟動子為GAP、PGK1、YPT1、TPI1、EN01、 HSP82、SSA4、KAR2、RSP7、RSP2、REP31、PET9、TEFl、THI11、GALl。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽表達(dá)載體，其特征在于將存在于表達(dá)載體中的原有啟動子改造成組成型啟動子GAP。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽表達(dá)載體，其特征在于所述巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體為 pPIC9、pPIC3、pPIC3K、pPIC3. 5K、pHIL_D2、pPICZA、pPICZAB、pPICZAC、 pPIC9K、pAC0815、pPICZetA、pPICZetB、pPICZetC 或 pHIL-Sl。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽組成型表達(dá)載體，其特征在于所述巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體為PPIC9。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組成型表達(dá)載體，其特征在于在多克隆位點(diǎn)含有串聯(lián)多拷貝的牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽表達(dá)基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽表達(dá)載體，其特征在于含有所述串聯(lián)多拷貝牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽表達(dá)基因。
8.含有權(quán)利要求1-7中任一所述的表達(dá)牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽的載體的巴斯德畢赤酵母菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種食品級表達(dá)載體的構(gòu)建方法，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。通過分子生物學(xué)手段將甲醇誘導(dǎo)啟動子AOX替換成組成型、半乳糖誘導(dǎo)型啟動子，這兩種類型啟動子不需甲醇誘導(dǎo)沒有食用安全隱患，是食品級表達(dá)啟動子。本發(fā)明所提供的組成型、半乳糖誘導(dǎo)型啟動子通過PCR擴(kuò)增得到，并在序列兩端引入酶切位點(diǎn)EcoR I、Not I，通過這兩個酶切位點(diǎn)將其連接到各種表達(dá)載體中。將載體線性化后通過電轉(zhuǎn)化整合到畢赤酵母的基因組中。通過搖瓶發(fā)酵得到高產(chǎn)量的牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽目的產(chǎn)物，并通過中空纖維進(jìn)行濃縮，濃縮后的發(fā)酵液通過美拉德呈味反應(yīng)有濃郁的牛肉香味。
文檔編號C12N15/81GK102604984SQ20111002521
公開日2012年7月25日 申請日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月24日
發(fā)明者孟琦, 王艷萍, 田雪, 白小佳 申請人:天津科技大學(xué)