欧美在线观看视频网站,亚洲熟妇色自偷自拍另类,啪啪伊人网,中文字幕第13亚洲另类,中文成人久久久久影院免费观看 ,精品人妻人人做人人爽,亚洲a视频

一種運載荷載細胞因子的雙調控溶瘤腺病毒的新型cik細胞的制作方法

文檔序號:393805閱讀:241來源:國知局
專利名稱:一種運載荷載細胞因子的雙調控溶瘤腺病毒的新型cik細胞的制作方法
技術領域
本發(fā)明涉及基因工程和腫瘤生物治療領域。具體的說,本發(fā)明涉及利用基因突變和重組技術,缺失病毒ElB55-kD蛋白、調控病毒ElA蛋白的表達、改造溶瘤腺病毒的纖毛蛋白,以提高溶瘤腺病毒靶向感染CIK細胞的能力和安全性。同時在溶瘤腺病毒中插入治療基因IL-2,通過CIK細胞將荷載IL-2的雙調控溶瘤腺病毒運載到腫瘤組織部位,發(fā)揮CIK 細胞、溶瘤腺病毒和細胞因子的協(xié)同殺傷腫瘤作用,在增強靶向抗腫瘤作用的同時,避免了全身應用的副作用。
背景技術
溶瘤腺病毒作為一種特殊的腫瘤治療藥物和基因治療載體近年來發(fā)展迅速,許多高效、靶向性病毒相繼進入臨床試驗,顯示出廣闊的應用前景。目前,已進入臨床試驗的溶瘤病毒中,ElB-55kD蛋白缺失型腺病毒Onyx-015被認為是療效最佳、最有前途的一種溶瘤腺病毒。Onyx-015是1996年由美國Onyx醫(yī)藥公司開發(fā)的腺病毒基因藥物,腺病毒缺失 ElB-55kD蛋白后,不能在正常細胞內復制,而在p53失活的腫瘤細胞中大量復制,并溶解腫瘤細胞。在I期臨床試驗中,0riyX-015治療14例常規(guī)治療失敗的頭頸癌患者,有6例腫瘤明顯縮小,部分病例病情改善,未見明顯不良反應。然而,在II期臨床試驗中,Onyx-015治療胰腺癌43例、胃腸癌19例、卵巢癌16例、大腸癌肝轉移33例、遠處轉移癌9例,均無明顯的客觀療效[1-3]。為提高溶瘤病毒的療效,劉新垣院士把Onyx-015改造成能夠插入抗癌基因的載體pZD55,隨著病毒在腫瘤細胞內的復制,抗癌基因表達量大大提高。雖然荷載抗癌基因的溶瘤腺病毒ZD55在體內外實驗均顯示出更好的抗腫瘤療效W-5],但仍無法完全消滅腫瘤。主要原因是溶瘤病毒進入人體后會受到多種免疫機制的清除。目前病毒主要給藥方法是瘤內注射或靜脈注射,由于各種免疫、生化或物理屏障的作用,導致病毒遞送效率很低 [6,7]。所以,病毒進入體內后很快被補體、抗病毒抗體及各種吞噬細胞等破壞,不能發(fā)揮有效的抗腫瘤作用。如何將病毒準確而高效地運輸?shù)侥[瘤有待解決。研究人員想到利用細胞作為病毒的運載工具,即病毒感染并進入具有腫瘤識別能力的細胞中,靜脈注射細胞,利用細胞對腫瘤組織的趨向性,幫助病毒越過復雜的血液環(huán)境將病毒運抵腫瘤組織。目前常用的細胞載體主要有三類腫瘤細胞、干細胞和T淋巴細胞,但這些細胞載體存在諸多問題,如獲取困難、安全性低、血管穿透性差、腫瘤識別能力單一及細胞大量擴增困難等,無法滿足臨床要求[8-10]。因此,尋找一種能夠對腫瘤組織廣譜識別、保護病毒逃避免疫清除、有效穿透血管和腫瘤組織屏障的新型細胞載體,是確保溶瘤病毒發(fā)揮治療作用的關鍵。細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells,CIK)具有向腫瘤組織局部趨化聚集的特性,大量臨床應用證明CIK細胞大劑量回輸?shù)陌踩訹11,12]。因此,利用CIK細胞作為病毒的載體是個理想的選擇。2006年Thorne等[13]在《Science》報道了利用CIK細胞運載牛痘病毒(vvDD)的研究。結果顯示,CIK細胞成功地將wDD準確運載到小鼠腫瘤組織部位,效果明顯優(yōu)于其他種類細胞載體。病毒必須對載體細胞具有較強的感染能力,才能順利進入細胞,并達到抗腫瘤所需要的滴度。常用的5型腺病毒(Ad5)通過細胞表面柯薩奇-腺病毒受體(CAR)感染細胞。 但CIK細胞低表達CAR,因此利用Ad5感染CIK細胞效果可能不佳。研究表明,人35型腺病毒(Ad35)感染細胞不依賴CAR受體,能夠高效感染淋巴細胞及腫瘤細胞[14,15]。利用 Ad35纖毛蛋白的knob和shaft替換Ad5纖毛蛋白的knob和shaft,構建的具有嵌合型纖毛蛋白的重組病毒能夠高效地感染T淋巴細胞及NK細胞[16,17]。因此,用pBHG-fiber5/35 代替腺病毒右臂質粒PBHGE3作為病毒重組包裝的骨架質粒,使重組病毒具有嵌合型纖毛蛋白結構,可以提高病毒感染CIK細胞的能力。溶瘤腺病毒感染并進入CIK細胞后,如果病毒過早復制必然會導致CIK細胞的溶解破壞,削弱CIK細胞的抗腫瘤作用,也無法將病毒運載到腫瘤組織。前已述及,ElB-55kD 蛋白缺失的溶瘤腺病毒ZD55可以選擇性地在腫瘤細胞內繁殖,而對正常細胞幾乎無影響。 為進一步控制其對CIK細胞及正常組織的毒副作用,利用在腫瘤細胞中高活性的人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)基因啟動子替換ZD55的ElA基因啟動子,希望通過雙重調控嚴格限制病毒在CIK細胞的增殖能力,而不影響其在腫瘤細胞內的增殖。前已述及,溶瘤腺病毒荷載抗癌基因將進一步提高其抗腫瘤療效。大量研究發(fā)現(xiàn) IL-2可刺激細胞毒T淋巴細胞、NK細胞等增殖,從而加強機體的免疫功能,控制腫瘤生長, 減少復發(fā)[18]。但是,IL-2全身大劑量應用時產(chǎn)生嚴重的毒副作用,甚至導致病人死亡。 將IL-2基因轉染腫瘤細胞,在轉染細胞的局部分泌IL-2,不僅可以避免全身性副作用,而且可以誘導機體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應[19]。同時,IL-2還是刺激誘導單個核細胞生成CIK 細胞不可缺少的細胞因子。因此,利用CIK細胞運輸荷載IL-2的溶瘤腺病毒進入體內,能避免機體對溶瘤腺病毒的破壞;CIK細胞殺傷腫瘤細胞后,釋放出的溶瘤腺病毒能發(fā)揮二次靶向殺傷腫瘤細胞作用;同時所分泌的細胞因子IL-2能增強CIK細胞的抗腫瘤能力,發(fā)揮“細胞-病毒-基因”的三重協(xié)同抗腫瘤作用。還能起到有效減少全身應用細胞因子和溶瘤腺病毒所導致的副作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及一種運載荷載IL-2的雙調控溶瘤腺病毒的新型CIK細胞。更具體地說,在本發(fā)明中CIK既是抗腫瘤的效應細胞,又是溶瘤腺病毒的運載工具。所運載的溶瘤腺病毒經(jīng)基因重組改造后具有如下特點對CIK細胞具有較強的感染力;能保證病毒只在腫瘤細胞中增殖;荷載了治療基因。在實施例中,CIK運載的溶瘤腺病毒是雙調控并荷載IL-2 作為治療基因的溶瘤腺病毒。本發(fā)明的技術方案是一種運載荷載IL-2的雙調控溶瘤腺病毒的新型CIK細胞, 用pBHG-fiber5/35作為病毒重組的骨架質粒,以腫瘤特異性hTERT啟動子替換ElB_55kD 蛋白缺失的溶瘤腺病毒穿梭質粒PZD55的ElA啟動子,并插入IL-2基因,重組為荷載IL-2 的雙調控溶瘤腺病毒。重組溶瘤腺病毒感染CIK細胞后,由CIK將其運載到腫瘤部位,待CIK殺傷腫瘤細胞自身死亡后,釋放出溶瘤病毒,發(fā)揮溶瘤病毒和IL-2的抗腫瘤作用,避免了全身應用的副作用。同時,局部釋放的IL-2又能進一步刺激CIK細胞的增殖和激活,增強CIK的抗腫瘤作用。上述說明以及下面的實例僅是用作舉例說明,并不構成對本發(fā)明范圍的限制。也就是說,凡通過對溶瘤腺病毒改造,并以CIK作為溶瘤病毒載體均在本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的有益效果是利用基因突變和重組技術,缺失病毒ElB55_kD蛋白、調控病毒ElA蛋白的表達、改造溶瘤腺病毒的纖毛蛋白,提高了溶瘤腺病毒靶向感染CIK細胞的能力和安全性。同時在溶瘤腺病毒中插入治療基因IL-2,通過CIK細胞將荷載IL-2的雙調控溶瘤腺病毒運載到腫瘤組織部位,發(fā)揮CIK細胞、溶瘤腺病毒和細胞因子的協(xié)同殺傷腫瘤作用,在增強靶向抗腫瘤作用的同時,避免了全身應用的副作用。


圖1-1 MTT檢測不同CIK細胞體外抑制肺癌細胞A549的增殖; 圖1-2 MTT檢測不同CIK細胞體外抑制肝癌細胞HepG2的增殖;
圖1-3 MTT檢測不同CIK細胞體外抑制宮頸癌細胞HeLa的增殖; 圖1-4 MTT檢測不同CIK細胞體外抑制腎癌細胞ACHN的增殖; 圖2-1 Annexin V染色檢測不同CIK細胞誘導ACHN腫瘤細胞凋亡; 圖2-2 DAPI染色檢測不同CIK細胞誘導HeLa腫瘤細胞凋亡。上述圖中,圖1-1至圖1-4是MTT檢測不同CIK細胞體外抑制腫瘤細胞的增殖; 圖2-1至是圖2-2是Armexin V染色及DAPI染色分別檢測不同CIK細胞誘導腫瘤細胞凋亡。
具體實施例方式下面結合優(yōu)選具體實施例對本發(fā)明進行詳細描述,但并不構成對本發(fā)明范圍的限制。也就是說,凡針對溶瘤腺病毒改造,并以CIK作為溶瘤病毒載體均在本專利的范圍。使用本發(fā)明治療各種腫瘤疾病等也均在本發(fā)明的范圍。實施例1 一種運載荷載IL-2的雙調控溶瘤腺病毒的新型CIK細胞 (一)利用hTERT啟動子替換溶瘤病毒ZD55的ElA基因啟動子
(DhTERT啟動子的克隆
設計引物:P1 5' -AT CTCGAG TGG CCC CTC CCT CGG GTT AC-3,
Xho I
P2 5' -GC TACGTA CGC GGG GGT GGC CGG GGC CA-3' SnaB I
以含pGL3-hTERT質粒為模板,PCR擴增條件為94°C lmin, 55°C lmin,72°C Imin0 PCR擴增得到hTERT啟動子基因片段,并引人Β ο I和SnaB I酶切位點。(2) hTERT啟動子基因替換病毒的ElA基因啟動子 ①缺失ElA基因啟動子
設計引物
P3 5' - TCC TGT GGATCC GGG CCC CCA TTT C -3,BamH I
P4 :5’ - TTCAGTACGTAGTCGACCTCGAGATATTACGCGCTATGAGT AAC AC -3,
與P3互補
P5 :5, - TATCTCGAGGTCGACTACGTACTGAAAATGAGACATATTATC -3,
與P2互補
P6 5' - TACT ACT ATT GCA TTC TCTAGA CAC A -3,
Xba I
以pXCl質粒為PCR反應的模板,引物P3與P4進行第一次PCR反應,電泳回收394 bp片段。以pXCl質粒為PCR反應的模板,引物P5與引物P6進行第二次PCR反應,電泳回收830 bp片段。兩次PCR反應的產(chǎn)物有^bp互補序列,以兩次PCR產(chǎn)物混合作為模板,以引物P3與引物P6進行第三次PCR反應,電泳回收1198 bp片段。以BamH I + Xba I酶切 1198 bp的PCR產(chǎn)物,克隆進BamH I + Xba I酶切過的pZD55質粒。②hTERT啟動子插入ElA啟動子缺失的質粒pZD55中
以B10 I和SnaB I酶切PCR擴增得到hTERT啟動子基因片段,克隆進經(jīng)相同酶切過的ElA啟動子缺失的質粒pZD55中,命名為pTERT-ZD55。(二)荷載IL-2的雙調控溶瘤腺病毒穿梭質粒PTERT-ZD55-IL-2的構建 (1)克隆 IL-2 的 cDNA
設計引物P1 :5,- AT AGATCT ATG CAA CTC CTG TC -3,
Bgl II
P2 5' - TA AGATCT TTA TGT TGA GAT GAT GC-3' Bgl II
以pcDNA3-IL-2質粒為模板,PCR擴增得到IL-2的cDNA,并引人Kpn I和Bgl II 酶切位點。(2)構建質粒 pTERT-ZD55-IL-2
將IL-2的cDNA基因片段經(jīng)Bgl II酶切,克隆進經(jīng)Bgl II酶切后的pTERT_ZD55 質粒,命名為 pTERT-ZD55-IL-2。(三)骨架質粒pBHG-fiber5/35與pTERT_ZD55-IL_2穿梭質粒重組,包裝成完整病毒的鑒定
293細胞鋪于IOcm培養(yǎng)皿,將穿梭質粒pTERT-ZD55_IL_2、pTERT_ZD55及 PTERT-ZD55-EGFP 分別與 Ad5/F;35 嵌合型腺病毒骨架質粒 pBHG_fiber5/;35 通過 Effectene 共轉染至293細胞,9-14天出現(xiàn)病毒空斑,經(jīng)過病毒空斑純化,進行擴增,提取重組腺病毒的DNA。通過PCR分析,確定重組正確的病毒,得到TERT-ZD55/F35-IL-2、TERT-ZD55/F35和 TERT-ZD55/F35-EGFP0將鑒定正確的病毒分別感染HEK293細胞擴增病毒,CsCl梯度離心純化病毒,50% 組織培養(yǎng)感染量(TCID50)法測滴度。(四)病毒感染CIK細胞 (I)CIK細胞的培養(yǎng)
抽取健康成人的外周血20ml,F(xiàn)icoll淋巴細胞分離液分離單個核細胞,生理鹽水洗滌2次后,以RPMI1640 (含10%胎牛血清)調節(jié)細胞數(shù)至1 2X106/ml,第0天加入IFN-y (1000U/ml),放置于37°C 5% CO2培養(yǎng)箱箱中培養(yǎng)Mh,第1天加入IL-1 (100U/ ml),CD3單抗(15μ g/ml),重組人IL_2 (300U/ml)繼續(xù)培養(yǎng),第4天補充新鮮培養(yǎng)液,調節(jié)細胞數(shù)為1 X 106/ml,補加IL-2 (100U/ml ),第0天、第7天及第14天取細胞用臺盼藍拒染法記數(shù),第15天收獲細胞用FCM測定⑶3+⑶56+雙陽性細胞百分數(shù)。(2)病毒感染CIK細胞
將 TERT-ZD55/F35-IL-2, TERT-ZD55/F35 和 TERT-ZD55/F35-EGFP 重組病毒(滴度為IXlO11Pfu)分別加入培養(yǎng)成熟的CIK細胞中,使得病毒感染并進入細胞中。(五)檢測包被病毒的CIK細胞體外殺傷腫瘤效應
將裝載不同病毒的CIK細胞分別作用于腫瘤細胞,MTT法檢測細胞增殖活性,Annexin V染色及DAPI染色法檢測凋亡。結果顯示,荷載IL-2的雙調控溶瘤腺病毒的CIK對腫瘤細胞的殺傷作用明顯優(yōu)于單純CIK和荷載溶瘤腺病毒的CIK。見圖1-1至1-4和圖2-1至 2-2。
權利要求
1.一種運載荷載IL-2的雙調控溶瘤腺病毒的新型CIK細胞,其特征在于以其作為病毒載體,所運載的病毒是經(jīng)過改造的荷載IL-2的雙調控溶瘤腺病毒。
2.如權利要求1所述的一種能運載荷載IL-2的雙調控溶瘤腺病毒的新型CIK細胞,其特征在于新型CIK細胞來源于患者本人,具有腫瘤組織局部趨化聚集的特性,對患者腫瘤具有識別和殺傷能力,能安全、高效的運載病毒。
3.如權利要求1所述的一種運載荷載IL-2的雙調控溶瘤腺病毒的新型CIK細胞,其特征在于CIK細胞殺傷腫瘤細胞死亡后,釋放出荷載IL-2的雙調控溶瘤腺病毒,溶瘤病毒在直接殺傷腫瘤細胞的同時,分泌IL-2并刺激CIK細胞增殖;發(fā)揮“細胞-病毒-基因”的協(xié)同抗腫瘤作用。
4.如權利要求1所述的一種運載荷載IL-2的雙調控溶瘤腺病毒的新型CIK細胞,其特征在于所述的荷載IL-2的雙調控溶瘤腺病毒穿梭質粒在缺失ElB55-kD的同時,利用 hTERT啟動子取代ElA啟動子,實現(xiàn)病毒在腫瘤細胞中選擇性增殖的雙重調控。
5.如權利要求4所述的一種運載荷載IL-2的雙調控溶瘤腺病毒的新型CIK細胞,其特征在于所述的荷載IL-2的雙調控溶瘤腺病毒用骨架質粒pBHG-fiber5/35與雙調控溶瘤腺病毒穿梭質粒重組,重組后完整的溶瘤病毒具有嵌合型纖毛蛋白結構,能提高病毒感染 CIK細胞的能力。
6.如權利要求1所述的一種運載荷載IL-2的雙調控溶瘤腺病毒的新型CIK細胞,其特征在于荷載IL-2的雙調控溶瘤腺病毒,其荷載的不僅指IL-2,也包括所有細胞因子和各種治療基因,如血管抑制基因、腫瘤壞死因子基因、腫瘤自殺基因、促細胞凋亡基因、抑癌基因、細胞因子基因、反義核苷酸、小干擾RNA ;IL-2在此僅作為一個具體實施例子。
7.如權利要求1所述的一種運載荷載IL-2的雙調控溶瘤腺病毒的新型CIK細胞,其特征在于荷載IL-2的雙調控溶瘤腺病毒,該溶瘤腺病毒不僅指利用hTERT啟動子替換ElA 啟動子,也包括利用其它腫瘤特異性啟動子或組織特異性啟動子,如Suvivin、Ki-67、PSA、 AFP、CEA等啟動子,實現(xiàn)病毒在腫瘤細胞中選擇性增殖的調控;hTERT啟動子在此僅作為一個具體實施例子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種運載荷載IL-2的雙調控溶瘤腺病毒的新型CIK細胞,屬新型CIK細胞的制備方法。該CIK細胞能夠運載荷載細胞因子如IL-2的溶瘤腺病毒。該溶瘤腺病毒經(jīng)過改造后,其穿梭質粒在缺失E1B55-kD的同時,利用hTERT啟動子取代E1A啟動子,達到雙重調控病毒在腫瘤細胞中的選擇性增殖。然后將此穿梭質粒與腺病毒骨架質粒pBHG-fiber5/35重組,使完整的溶瘤病毒外殼具有嵌合型纖毛蛋白結構,以提高病毒感染CIK細胞的能力。該CIK細胞進入體內殺傷腫瘤細胞后,釋放出的溶瘤腺病毒能發(fā)揮二次殺傷腫瘤細胞作用,同時所分泌的細胞因子IL-2能增強CIK細胞的抗腫瘤能力,發(fā)揮“細胞-病毒-基因”的三重協(xié)同抗腫瘤作用。該CIK細胞同時減少了全身應用細胞因子和溶瘤腺病毒的副作用。
文檔編號C12N7/01GK102154213SQ201110020769
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月19日 優(yōu)先權日2011年1月19日
發(fā)明者劉俊杰, 張寶福, 徐為, 李慧中, 李連濤, 裴冬生, 鄭駿年 申請人:鄭駿年
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1
岳西县| 定南县| 竹溪县| 佳木斯市| 汉寿县| 隆回县| 牙克石市| 巢湖市| 五河县| 东源县| 右玉县| 浏阳市| 威宁| 肇源县| 江阴市| 磴口县| 迁西县| 聂拉木县| 宜春市| 金山区| 应城市| 咸阳市| 萨嘎县| 九寨沟县| 哈尔滨市| 东至县| 邯郸县| 治多县| 阜平县| 宝清县| 元朗区| 宜良县| 揭西县| 苏尼特右旗| 富顺县| 苏尼特左旗| 阳曲县| 特克斯县| 太白县| 黔西县| 高密市|