專利名稱：微生物檢測制品的制作方法
微生物檢測制品相關(guān)專利串請的交叉引用本專利申請要求2009年12月30日提交的美國臨時專利申請No. 61/291，245的權(quán)益，該美國臨時專利申請全文以引用的方式并入本文中。
背景技術(shù)：
當(dāng)表面被細(xì)菌、真菌、酵母、病毒或其他微生物污染時，可能引發(fā)疾病(發(fā)病)，有時甚至導(dǎo)致死亡(致死)。當(dāng)食品加工廠和醫(yī)療衛(wèi)生場所(如醫(yī)院)中的表面被微生物污染時，尤其如此。在食品加工廠中，表面(例如，固體表面、設(shè)備表面、防護(hù)服等)可能變得被污染。此 類污染可能由肉類或其他食物引起，或轉(zhuǎn)移到肉類或其他食物上。在醫(yī)療衛(wèi)生場所中，微生物可能會從被感染的個體或以其他方式釋放到表面(如固體表面、設(shè)備表面、衣物等)上。一旦表面被微生物污染，與被污染表面接觸就會輕易地將微生物轉(zhuǎn)移至其他位置，例如其他表面、個體、設(shè)備、食物等。眾所周知，某些環(huán)境中的微生物污染和轉(zhuǎn)移可能會引起嚴(yán)重的健康風(fēng)險。例如，來自受污染的食品加工廠的食品將隨后被吃掉，并可能引起疾病，并且可能引起死亡。特別相關(guān)的是諸如單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteriditis)和大腸埃希氏桿菌0157:H7之類的微生物。微生物污染涉及于醫(yī)療衛(wèi)生場所中，因為這種場所的某些患者常常遭受病原微生物的感染，因而將病原微生物帶入這類場所中。另外，處于這類場所中的許多人(例如患者)是患病的，可能會免疫失能。因而，這些個體因受污染微生物的感染而患病的風(fēng)險增大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用于檢測微生物的制品和方法。具體地講，本發(fā)明涉及多層檢測制品，該制品可用于在重新定位或去除多層中的一層以將微生物暴露于檢測試劑之前允許微生物在有限時間段內(nèi)生長。在一個方面，本發(fā)明提供了用于檢測樣品中的微生物并對其進(jìn)行計數(shù)的制品。所述制品可包括基體構(gòu)件、微孔膜、覆蓋片材和阻擋層。所述基體構(gòu)件可包括具有上主表面和下主表面的水不能透過的自支承基材。基體構(gòu)件的上主表面可包括含有冷水溶性膠凝劑的第一干涂層。覆蓋片材可包括含有檢測試劑的第二干涂層。阻擋層可被構(gòu)造用于在微孔膜和覆蓋片材之間形成流體阻擋。微孔膜可設(shè)置在基體構(gòu)件和阻擋層之間。在前述任一個實施例中，所述制品還可包括墊片。所述墊片可包括孔。所述墊片可連接到所述基體構(gòu)件，以形成樣品接納凹槽。在前述任一個實施例中，覆蓋片材可附著于基體構(gòu)件。在前述任一個實施例中，微孔膜可附著于基體構(gòu)件。在前述任一個實施例中，阻擋層可附著于基體構(gòu)件。在前述任一個實施例中，阻擋層可以可分離的方式附著于基體構(gòu)件。在前述任一個實施例中，所述微孔膜可含有選自以下的材料聚醚砜、尼龍、聚碳酸酯、聚酯、醋酸纖維素、混合的纖維素酯、聚偏二氟乙烯、硝化纖維、陶瓷、以上材料中任一種的衍生物以及以上材料中的任意兩種或更多種的組合物。在前述任一個實施例中，所述微孔膜還可包括滲透邊界。在前述任一個實施例中，所述制品還可包括營養(yǎng)培養(yǎng)基。在前述任一個實施例中，所述制品還可包括選擇劑。在前述任一個實施例中，所述制品還可包括多種檢測試劑。在前述任一個實施例中，所述多種檢測試劑中的至少兩種可區(qū)分至少兩種類型的微生物。在前述任一個實施例中，所述覆蓋片材還可包括冷水溶性膠凝劑。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種檢測樣品中是否存在微生物的方法。所述方法可包括提供懷疑含有微生物的液體樣品和檢測制品。所述檢測制品可包括基體構(gòu)件、微孔膜、覆蓋片材和阻擋層，該阻擋層在微孔膜和覆蓋片材之間形成流體阻擋。所述基體構(gòu)件可包括含有冷水溶性膠凝劑的第一干涂層。所述覆蓋片材可包括含有檢測試劑的第二干涂層。微孔膜可設(shè)置在基體構(gòu)件和阻擋層之間。所述方法還可包括使預(yù)定量的所述樣品接觸所述第一干涂層。所述方法還可包括使所述微孔膜接觸所述樣品。所述方法還可包括將所述制品孵育第一時間段。所述方法還可包括將所述阻擋層重新定位，以在所述覆蓋片材和所述微孔膜之間提供接觸。所述方法還可包括將所述制品孵育第二時間段并且觀察微生物生長是否存在的指征。在前述任一個方法的實施例中，重新定位所述阻擋層的步驟可包括從所述制品去除所述阻擋層。在前述任一個方法的實施例中，所述制品還可包括與所述基體構(gòu)件形成樣品接納凹槽的墊片。在這些實施例中，使預(yù)定量的所述樣品接觸所述第一干涂層的步驟可包括將所述樣品轉(zhuǎn)移到所述樣品接納凹槽中。在前述任一個方法的實施例中，所述方法還可包括將所述樣品與營養(yǎng)物質(zhì)、選擇齊U、檢測試劑或以上物質(zhì)中的任何兩種或更多種的組合物混合的步驟。在前述任一個方法的實施例中，所述第一時間段可以是約I小時至約48小時。在前述任一個方法的實施例中，所述第二時間段可以是約15分鐘至約96小時。在前述任一個方法的實施例中，所述第一干涂層的至少一部分可包括多種檢測試 齊U。在這些實施例中，觀察微生物生長的指征的步驟可包括檢測并區(qū)分兩種或更多種類型的微生物。在前述任一個方法的實施例中，觀察是否存在微生物生長的指征可包括對至少一種類型的微生物進(jìn)行計數(shù)。在前述任一個方法的實施例中，觀察是否存在微生物生長的指征可包括得到所述制品的圖像。在前述任一個方法的實施例中，觀察是否存在微生物生長的指征還可包括打印、顯示或分析所述圖像。詞語“優(yōu)選的”和“優(yōu)選地”是指在某些情況下可以提供某些有益效果的本發(fā)明的實施例。然而，在相同的情況或其他情況下，其他實施例也可以是優(yōu)選的。此外，對一個或多個優(yōu)選實施例的表述并不暗示其他實施例是不可用的，且并非意圖將其他實施例排除在本發(fā)明范圍之外。本文所用的“一種(個)”、“所述(該)”、“至少一種(個)”以及“一種或多種(一個或多個)”可互換使用。因此，例如，含有“一種”微生物的樣品可被理解為意指該樣品可包含“一種或多種”微生物。
術(shù)語“和/或”意指所列要素的一個或全部，或所列要素的任何兩個或更多個的組
口 o還有，本文通過端點表述的數(shù)值范圍包括該范圍內(nèi)的所有數(shù)值(比如，I到5包含1,1.5,2,2. 75,3,3. 80、4、5 等)。本發(fā)明的上述發(fā)明內(nèi)容并非意圖描述本發(fā)明的每一個公開的實施例或每種實施方式。以下具體實施方式
更具體地舉例說明了示例性實施例。在整個專利申請的若干地方，通過實例列表提供了導(dǎo)引，其中可以按多種組合方式來使用實例。在每一種情形下，所列舉的列表僅僅作為代表性群組，而不應(yīng)被理解為排他性列表。


將參照下面列出的附圖來進(jìn)一步說明本發(fā)明，其中在全部視圖中類似的結(jié)構(gòu)由類似的數(shù)字標(biāo)注。圖Ia是根據(jù)本發(fā)明的包括微孔膜的檢測制品的一個實施例的分解側(cè)視圖。圖Ib是圖Ia的檢測制品的俯視圖。圖Ic是圖Ia的檢測制品的局部剖視的頂部透視圖。圖2是根據(jù)本發(fā)明的包括連接到膜載體的微孔膜的檢測制品的一個實施例的分解側(cè)視圖。圖3a是根據(jù)本發(fā)明的包括墊片和微孔膜的檢測制品的一個實施例的分解側(cè)視圖。圖3b是圖3a的檢測制品的俯視圖。圖3c是圖3a的檢測制品的局部剖視的頂部透視圖。圖4是根據(jù)本發(fā)明的包括連接到膜載體的微孔膜和墊片的檢測制品的一個實施例的分解側(cè)視圖。圖5是根據(jù)本發(fā)明的用于檢測液體樣品中的微生物的方法的一個實施例的框圖。
具體實施例方式在詳細(xì)說明本發(fā)明的任何實施例之前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并不將其應(yīng)用局限于以下描述所提及的或附圖所示出的具體構(gòu)造和組件布置方式。本發(fā)明可具有其他實施例，并且能夠以多種方式實踐或?qū)嵤?。另外還應(yīng)理解，本文中所用的用語和術(shù)語的目的是為了進(jìn)行說明，不應(yīng)被認(rèn)為是限制性的。本文所用“包括”、“包含”、“含有”或“具有”及其變型形式意指涵蓋列在其后的項目及其等同形式以及額外項。除非另外規(guī)定或限制，否則術(shù)語“支承”和“連接”及其變型形式以其廣義使用，并且涵蓋直接和間接支承與連接。應(yīng)理解，其他的實施例也可采用，且可在不偏離本發(fā)明范圍的情況下作出結(jié)構(gòu)變化或邏輯變化。此外，諸如“前”、“后”、“頂部”、“底部”之類的術(shù)語僅用于描述元件彼此的關(guān)系，而決不用來描述裝置的具體取向，也不用來指示或暗示裝置的必要或需要的取向，或用來規(guī)定本文所述發(fā)明在使用過程中的操作、安裝、顯示或設(shè)置方式。本發(fā)明整體涉及用于檢測液體樣品中的微生物的方法和制品。多層檢測制品提供i)可重新定位或可去除阻擋層，阻擋層被構(gòu)造用于控制生長的微生物暴露于檢測試劑和/或選擇劑和ii)微孔膜，其用于防止液體樣品中存在的微生物及其后代和阻擋層之間直接接觸。通過防止微生物和阻擋層之間直接接觸，消除了當(dāng)阻擋層相對于制品重新定位或者從制品去除阻擋層時微生物在制品內(nèi)擴散和/或微生物脫離制品的可能性。本發(fā)明的發(fā)明多層制品允許使用相對高濃度的檢測試劑，以縮短檢測微生物所需的時間量。因為在制品中存在阻擋層，所以防止了在第一孵育時間段期間微生物暴露于檢測試劑(檢測試劑的可能存在量可以對微生物表現(xiàn)出抑制性或毒性)。在第一孵育時間段之后，可以重新定位或去除阻擋層，從而將微生物(如果存在的話)暴露于檢測試劑。本發(fā)明的制品可包括可選的裂解劑和/或選擇劑，阻擋層也可以在第一孵育時間段期間隔絕該裂解劑和/或選擇劑與微生物的接觸。本發(fā)明的制品和方法允許使用可擴散的檢測試劑。當(dāng)用在傳統(tǒng)制品(例如，瓊脂培養(yǎng)皿)中時，可擴散的檢測試劑(例如，下述的被水解成水溶性可檢測產(chǎn)物的生色底物或熒光酶底物)可以橫向地擴散通過檢測裝置，成為大的有色或熒光區(qū)。這些區(qū)可能疊置兩個或更多個微生物菌落，從而難以測定該區(qū)只是由一個菌落生成的還是由不止一個菌落生成的。通過提供在微生物暴露于可擴散的檢測試劑之前允許其生長的制品，用戶可以縮短將 微生物暴露于檢測試劑的時間量，從而使指示劑的擴散程度最小并且減小對應(yīng)的有色或熒光區(qū)的大小。因此，與傳統(tǒng)的制品和方法相比，本發(fā)明的制品和方法提高了對不止一個微生物菌落的分辨率。除非另外定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。與本文所述的方法和材料類似或等同方法和材料可用于實踐本發(fā)明，并且以下描述了示例性的合適方法和材料。例如，方法可以描述為包括不止兩個步驟。在這類方法中，為實現(xiàn)限定的目標(biāo)，可能并非所有步驟都是需要的，并且本發(fā)明設(shè)想使用孤立的步驟來實現(xiàn)這些分立的目標(biāo)。所有出版物、專利申請、專利及其他參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容都以全文引用方式并入本文中。另外，材料、方法和實例僅是示例性的，并無意于限制本發(fā)明。如本文使用的“靶微生物”是指要檢測的特定微生物(即，微生物菌種)或特定微生物組(例如，微生物的特定屬、大腸桿菌、耐抗生素細(xì)菌)。樣品和微牛物本發(fā)明的一個方面是，其可用于檢測各種各樣的表面上存在的生物體。本發(fā)明的裝置和方法可用于希望檢測樣品中是否存在微生物的各種應(yīng)用；所述樣品包括(但不限于)食品樣品(例如，原材料、在制食物物料、成品)、表面(例如，環(huán)境表面、食品加工表面、設(shè)備)、水(例如，表面水、加工水)和飲料(例如，鮮奶、巴氏滅菌牛奶、果汁)。這些樣品可基本上由單獨的或成多種組合的固體、半固體、凝膠狀或液態(tài)材料組成。本發(fā)明的裝置以及本發(fā)明的方法可用于定性或定量地測定一種或多種所關(guān)注的微生物的存在。—種示例性的所關(guān)注的臨床分析物是金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。這是一種引起廣譜感染的病原體,所述感染包括淺表損傷，例如小的皮膚膿腫和傷口感染；全身性且致命的病癥，例如心內(nèi)膜炎、肺炎和敗血?。灰约爸卸景Y，例如食物中毒和中毒性休克綜合征。某些菌株(如耐甲氧苯青霉素金黃色葡萄球菌或MRSA)對除了少數(shù)之外的所有選擇抗生素有抗性。要在食品加工區(qū)域中檢測的示例性的所關(guān)注分析物是李斯特菌屬的成員。李斯特菌屬被分類為革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌并且由如下種組成單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、無害李斯特菌(L. innocua)、威氏李斯特菌(L. welshimeri)、斯氏李斯特菌(L. seeligeri)、綿羊李斯特菌(L. ivanovii)和格雷氏李斯特菌(L. grayi)。其中，單核細(xì)胞增多性李斯特菌是造成大多數(shù)人李斯特菌病例的原因，并且免疫失能的、孕婦、老年人和新生兒具有增加的感染易感性。李斯特菌病的最普通癥狀是敗血病、腦膜炎和流產(chǎn)。
特別關(guān)注用于分析目的的其他微生物包括原核生物和真核生物，特別是革蘭氏陽性細(xì)菌、革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌、支原體和酵母。特別相關(guān)的生物體包括如下科屬的成員腸桿菌科(Enterobacteriaceae),或微球菌科(Micrococcaceae)或葡萄球菌屬(Staphylococcus spp.)、鏈球菌屬(Streptococcus spp.)、假單胞菌屬(Pseudomonasspp.)、腸球菌屬(Enterococcus spp.)、沙門氏菌屬(Salmonella spp.)、軍團(tuán)菌屬(Legionella spp.)、志賀桿菌屬(Shigella spp.)、耶爾森氏菌屬(Yersinia spp.)、腸桿菌屬(Enterobacter spp.)、腸埃希桿菌屬(Escherichia spp.)、芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)、弧菌屬(Vibrio spp.)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium spp.)、棒桿菌屬(Corynebacteria spp.)以及曲霉菌屬(Aspergillus spp.)、鍵刀菌屬(Fusariumspp.)和假絲酵母菌屬(Candida spp.)。毒性特別強的生物體包括金黃色葡萄球菌(包括抗性菌株例如耐甲氧苯青霉素金黃色葡萄球菌(MRSA))、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、無乳鏈球菌(S. agalactiae)、釀胺鏈球菌(S. pyogenes)、幾腸球菌(Enterococcus faecalis)、耐萬古霉素腸球菌(VRE)、耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(VRSA)、萬古霉素敏感性減低金黃色葡萄球菌(VISA)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大腸埃希氏桿菌、黑曲霉(Aspergillus niger)、煙曲霉(A. fumigatus)、棒曲霉(A. clavatus)、爺病鍵刀菌(Fusarium solani)、尖孢鐮刀菌(F. oxysporum)、厚孢鐮刀菌(F. chIamydosporum)、霍亂弧菌(Vibrio cholera)、副溶血性弧菌(V. parahemolyticus)、豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholerasuis)、傷寒沙門氏菌(S. typhi)、鼠傷寒沙門氏菌(S. typhimurium)、白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(C. glabrata)、克魯斯念珠菌(C. krusei)、阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)、大腸埃希氏桿菌0157、含ESBL的微生物以及多重抗藥性的革蘭氏陰性桿菌(MDR)。檢測丨制品本發(fā)明提供了用于檢測樣品中是否存在微生物的制品。圖Ia示出根據(jù)本發(fā)明的檢測制品100的一個實施例的分解側(cè)視圖。該制品包括基體構(gòu)件110，該基體構(gòu)件包括水不能透過的第一基材112、粘附于第一基材112的可選第一粘合劑層114以及第一干涂層116。第一基材112優(yōu)選地是自支承的并且基本不吸水。適用于第一基材112的材料的非限制性例子包括聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯膜。其他適用材料包括具有防水(例如，聚合物型)涂層的紙張或硬紙板材料。第一基材112可以是透明的、半透明的或不透明的，這取決于是否想要透過該基材112觀察細(xì)菌菌落。為了有利于對細(xì)菌菌落進(jìn)行計數(shù)，第一基材112可在上面印刷有正方形網(wǎng)格圖案，如在美國專利No. 4，565，783中所述的，該專利以引用方式并入本文中。用于構(gòu)造第一基材112的材料應(yīng)該對微生物具有相對惰性，并且優(yōu)選地應(yīng)該與消毒過程(例如，環(huán)氧乙烷消毒)相配合。
在一些實施例中，基體構(gòu)件110還可包括粘附于第一基材112的主表面的可選第一粘合劑層114。第一粘合劑層114可以是水不溶性的，應(yīng)該對于微生物的生長是非抑制性的，并且應(yīng)該能夠經(jīng)受住消毒過程(如果用到消毒過程的話)。優(yōu)選地，第一粘合劑層114在潤濕時是充分透明的，以能夠透過涂覆有粘合劑層114的第一基材112觀察細(xì)菌菌落。在一些實施例中，例如，第一粘合劑層114可包括壓敏粘合劑，如增粘高壓敏感的丙烯酸異辛酯/丙烯酸共聚物粘合劑(96重量％的丙烯酸異辛酯和4重量％的丙烯酸)。在一些實施例中，第一基材112可包括覆蓋基材112的整個主表面的第一粘合劑層114。在一些實施例中，第一基材112可包括只覆蓋基材112的一部分主表面的第一粘合劑層114。第一干涂層116包括冷水溶性膠凝劑(例如，瓜耳膠、黃原膠、刺槐豆膠)，如以引用方式全文并入本文的美國專利No. 4，565，783中所描述的。可選地，干涂層116還可包括營養(yǎng)培養(yǎng)基、選擇劑、檢測試劑或以上兩種或更多種的任意組合。營養(yǎng)培養(yǎng)基、選擇劑和/或檢測試劑應(yīng)該基本不妨礙膠凝劑并且通常將基于要檢測的微生物來進(jìn)行選擇。用于檢測微生物的適用的營養(yǎng)物質(zhì)、選擇劑和檢測試劑的非限制性例子可見于美國專利 No. 4，575，783、No. 5，089，413、No. 5，443，963、No. 5，462，860、No. 5，601，998、No. 5，635，367、No. 5，681，712和No. 5，364，766，這些專利的全文以引用方式并入本文。制備第一干涂層116中的營養(yǎng)培養(yǎng)基、選擇劑和/或檢測試劑的量，使得當(dāng)接觸預(yù)定量的液體樣品時，它們有助于微生物的生長和/或檢測。在一些實施例中，例如，通過用第一粘合劑層114粘附涂層116，可將第一干涂層116 (例如，干粉膠凝劑；可選地具有干粉營養(yǎng)物質(zhì)、選擇劑和/或檢測試劑)連接到第一基材112，如在美國專利No. 4，565，783中所描述的。在一些實施例中，例如，通過含有膠凝劑(可選地具有干粉營養(yǎng)物質(zhì)、選擇劑和/或檢測試劑)的液體混合物涂覆到第一基材112或第一粘合劑層114上并且之后將混合物干燥，可以將第一干涂層116連接到第一基材112，如在美國專利No. 4，565，783中所描述的。在一些實施例中，第一基材112可包括覆蓋基材112的整個主表面的第一干涂層116。在一些實施例中，第一基材112可包括只覆蓋基材112的一部分主表面的第一干涂層116。重新參考圖Ia,制品100還包括微孔膜150。在一些實施例中，微孔膜150或其一部分連接到基體構(gòu)件110。在圖示實施例中，微孔膜150借助雙面粘合劑帶130的帶連接到基體構(gòu)件110，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識到其他連接手段(例如，粘合劑、熱粘合、超聲焊接)可能是合適的?？蛇x地，微孔膜150可包括凸塊區(qū)151，該凸塊區(qū)延伸超出基體構(gòu)件110和/或覆蓋片材120的外圍邊界。微孔膜150可含有本領(lǐng)域已知的各種水可滲透的微孔膜材料中的任一種，包括(例如)纖維素膜(例如，醋酸纖維素、混合的纖維素酯、硝化纖維)、尼龍、聚碳酸酯、聚醚砜、尼龍、聚酯、聚偏二氟乙烯、陶瓷、以上任何物質(zhì)的衍生物和以上任何兩種或更多種物質(zhì)的組合。根據(jù)要檢測的微生物，選擇微孔膜150的標(biāo)稱孔尺寸。例如，約0. 05i!m至約1.2i!m(例如，0. 05 u m、0. I u m、0. 2 u m、0. 45 u m、0. 8 u m 或 I. 2 u m)優(yōu)選地約 0. 2 u m 至約 0. 45 u m的標(biāo)稱孔尺寸可用于檢測細(xì)菌。在一些實施例中，約0. 05iim至約3iim (例如，0.45 ym、 0.8 U m、I. 2 U m或3 U m)優(yōu)選地約0. 45 u m至約I. 2 u m的標(biāo)稱孔尺寸可用于檢測酵母和/或霉囷。
在任一個實施例中，微孔膜150應(yīng)該被構(gòu)造用于形成阻擋件，用于防止沉積在基體構(gòu)件110上的液體樣品中的微生物傳遞物接觸阻擋層140。在一些實施例中，這可以通過以下步驟實現(xiàn)選擇樣品容積和/或確定微孔膜150的尺寸，使得液體樣品不能擴散或超出微孔膜150的外緣。在一些實施例(如圖I中所示)中，微孔膜150的尺寸可以被設(shè)計為與基體構(gòu)件110的尺寸至少共延。通過如上所述將微孔膜150連接到基體構(gòu)件110，有利地可以保持微孔膜150正確定位，以避免樣品和阻擋層140之間的直接接觸。微孔膜150還可包括可選的橫向滲透邊界153，用于將液體的橫向滲透限定至微孔膜150的選定部分。滲透邊界153例如包括微孔膜150的已被處理(例如，已施用某一組分)以限制含水樣品移動經(jīng)過和/或透過微孔膜的區(qū)域。例如，疏水性組分(例如，蠟)可以按例如圓形圖案(參見圖Ib)施用，并且被允許滲透微孔膜150。該組分會形成阻擋，以基本防止含水液體橫向擴散透過微孔膜150。因此，將基本防止?jié)B透邊界153—側(cè)的區(qū)域中與微孔膜150接觸的液體樣品橫向擴散透過微孔膜150，到達(dá)滲透邊界另一側(cè)的區(qū)域。制品100還包括阻擋層140。在一些實施例中，阻擋層140以可分離的方式連接到微孔膜150，如圖I中所示。阻擋層140可借助雙面粘合劑帶130的帶連接到微孔膜150。優(yōu)選地，阻擋層140還包括分離部件(例如，穿孔145)，以有助于從制品100分離和去除阻擋層140。可選地，阻擋層140可包括凸塊區(qū)141，該凸塊區(qū)延伸超出基體構(gòu)件110和/或覆蓋片材120的外圍邊界。已經(jīng)認(rèn)識到，其他連接手段(例如，粘合劑、熱粘合、超聲焊接)可適于將阻擋層140附著于微孔膜150。還已經(jīng)認(rèn)識到，阻擋層140可以直接連接到基體構(gòu)件110，前提是微孔膜設(shè)置在基體構(gòu)件110和阻擋層140之間。在替代實施例中，可以在雙面粘合劑帶130的至少一側(cè)使用某些低粘合性的粘合劑混合物，如以引用方式全文并入本文的美國專利No. 5，118，750中描述的那些粘合劑混合物，以在阻擋層與微孔膜150和覆蓋片材120之間都形成可分離的附著。在又一個替代實施例(未示出)中，在接種制品100之前和/或之后，可以將阻擋層140松弛地設(shè)置在微孔膜150和覆蓋片材120之間。阻擋層140應(yīng)該是防水的。阻擋層140優(yōu)選地是透明的，以使得能觀察位于阻擋層140下面的物體，并且對于細(xì)菌、水和水汽基本上不可滲透的。通常，阻擋層140可以與基體構(gòu)件110具有相同的性質(zhì)。用于阻擋層140的示例性材料包括(例如)聚丙烯膜(例如
I.6密耳的雙軸取向聚丙烯(BOPP))或聚乙烯薄膜。阻擋層140被示出為具有可選延伸部分(凸塊141)，這有利于抓握阻擋層140并從制品110去除阻擋層。 制品100還包括覆蓋片材120。覆蓋片材120優(yōu)選地連接(直接地或間接地)到基體構(gòu)件110。在圖示實施例中，覆蓋片材120借助雙面粘合劑帶130的帶連接到阻擋層140。已經(jīng)認(rèn)識到，其他連接手段(例如，粘合劑、熱粘合、超聲焊接)可適于將覆蓋片材120附著于微孔膜阻擋層140。還已經(jīng)認(rèn)識到，覆蓋片材120可以直接連接到基體構(gòu)件110，前提是微孔膜設(shè)置在基體構(gòu)件110和覆蓋片材120之間。覆蓋片材120包括水不能透過的第二基材122、可選第二粘合劑層124和第二干涂層126。第二干涂層126包括用于檢測微生物的檢測試劑。可以通過目測和/或通過使用自動檢測器對檢測試劑進(jìn)行檢測。自動檢測器可包括成像系統(tǒng)。檢測試劑可以是生色底物、熒光底物或產(chǎn)熒光底物。在任一個實施例中，檢測試劑在接觸預(yù)定量的液體樣品時到達(dá)足以檢測靶微生物的濃度。有利地，第二干涂層126中的檢測試劑的量可高得足以快速檢測是否存在靶微生物，即使液體樣品中的高濃度檢測試劑也抑制了靶微生物的生長。在一些實施例中，第二干涂層126中的檢測試劑的量足以檢測靶微生物，即使其基本抑制了靶微生物的生長。第二干涂層126中相對較高量的檢測試劑與相對較低量的檢測試劑相比，允許更快速地檢測靶微生物，即使所述相對較高量基本會抑制微生物的生長。檢測試劑可以是所存在的微生物類型的非特異性指示劑，或者它可以是所存在的微生物類型的特異性指示劑。非特異性檢測試劑的非限制性例子包括PH指示劑(例如，偶氮苯pH指示劑(例如，甲基紅)、磺酞pH指示劑(例如，溴甲酚紫、氯酚紅、溴百里酚藍(lán)、溴甲酚藍(lán))和蒽醌pH指示劑(例如，茜素紅S —水合物、3，4- 二羥基-9，10- 二氧代-2-蒽磺酸、鈉鹽)和氧化還原指示劑(例如，氯化三苯基四唑(TTC)、3-[4，5- 二甲基噻唑-2-基]-2，5- 二苯基四氮唑溴鹽(MMT)、2，3-雙[2-甲氧基-4-硝基-5-磺酸苯基]-2H-四唑鎗-5-羥基苯胺內(nèi)鹽(XTT)、硝基藍(lán)四唑鎗)。檢測試劑可以是所存在的微生物類型的特異性指示劑。特異性檢測試劑包括(例 如)與某些微生物或微生物的群組相關(guān)的酶(例如，糖苷酶、蛋白酶、氨肽酶、磷酸酶、酯酶等)的底物。檢測試劑可能能夠形成有色沉淀。已知可以參與本發(fā)明的方法和裝置的各種染料，包括含吲哚基染料，所述含吲哚基染料包括但不限于5-溴代-4-氯吲哚磷酸鹽或該化合物的二鈉鹽、5-溴代-4-氯吲哚吡喃糖苷或該化合物的二鈉鹽，包括5-溴代-4-氯代-3-吲哚基-D-葡糖醛酸、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基-P -D-半乳糖苷、5-溴代-4-氯代-3-吲哚基-P -D-吡喃葡萄糖苷、6-氯代-3-吲哚基磷酸、5-溴代-6-氯代-3吲哚氧基磷酸鹽。優(yōu)選地，有色沉淀是藍(lán)色的。形成藍(lán)色沉淀的底物包括但不限于5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基-N-乙?；?P -D-氨基半乳糖苷、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基-N-乙?；?P -D-氨基葡糖苷、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基-P -D-纖維二糖糖苷、5-溴代-4-氯代-3- ^ -D-巖藻糖、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基-a -D-吡喃半乳糖苷、5_溴代_4_氯代-3-吲哚氧基-P -吡喃半乳糖苷、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基- a -D-吡喃葡萄糖苷、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基-P -D-吡喃葡萄糖苷、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基-P -D-葡糖醛酸、環(huán)己基銨鹽、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基-P -D-葡糖醛酸、鈉鹽和5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基-P -D-木吡喃糖苷。這些染料可用作某些類型的細(xì)菌內(nèi)存在的特定酶的底物。例如，作為酯酶底物的形成藍(lán)色沉淀的染料包括但不限于5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基丁酸鹽、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基辛酸鹽和5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基棕擱酸鹽。磷酸酶的底物包括但不限于5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基磷酸二(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇)鹽、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基磷酸二鈉鹽、5-溴代-4-氯代-3-吲哚氧基磷酸對甲苯胺鹽(p-toluidine salt)、5_溴代_4_氯代_3_ 口引哚氧基磷酸鹽和鉀鹽。作為糖苷酶底物的生色底物染料包括但不限于3-吲哚氧基-P -D-吡喃半乳糖苷、3-吲哚氧基-P -D-吡喃葡萄糖苷、3-吲哚氧基-P -D-葡糖醛酸環(huán)己胺鹽和3-吲哚基-3-D-葡糖醛酸鈉鹽。磷酸酶的其他生色底物包括但不限于3-吲哚氧基磷酸二(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇)鹽和3-吲哚氧基二鈉鹽、3-吲哚氧基磷酸對甲苯胺鹽。硫酸酯酶的底物包括但不限于3-吲哚基硫酸鉀鹽。針對糖苷酶、酯酶、磷酸酶和硫酸酯酶形成品紅色的可沉淀染料包括但不限于作為糖苷酶的底物的5-溴代-6-氯代-3-吲哚氧基-N-乙?；?D-氨基葡糖苷、5-溴代-6-氯代-3-吲哚氧基-P -D-吡喃半乳糖苷、5-溴代-6-氯代-3-吲哚氧基-P -D-吡喃半乳糖苷、5-溴代-6- 氯代-3-吲哚氧基-P -D-吡喃葡萄糖苷和5-溴代-6-氯代-3-吲哚氧基-葡糖醛酸環(huán)己基銨鹽；用作酯酶的底物的5-溴代-6-氯代-3-吲哚氧基丁酸鹽、5-溴代-6-氯代-3-吲哚氧基辛酸鹽和5-溴代-6-氯代-3-吲哚氧基棕擱酸鹽；用作硫酸酯酶的底物的針對磷酸酶的5-溴代-6-氯代-3-吲哚氧基磷酸對甲苯胺鹽以及5-溴代-6-氯代-3-吲哚氧基硫酸鉀鹽。針對糖苷酶、酯酶和磷酸酶形成橙紅色的可沉淀染料包括但不限于6-氯代-3-吲哚氧基-吡喃半乳糖苷、6-氯代-3-吲哚氧基-P -D-吡喃葡萄糖苷和6-氯代-3-吲哚氧基-D-葡糖醛酸環(huán)己基銨鹽(針對糖苷酶)；6-氯代-3-吲哚氧基丁酸鹽、6-氯代-3-吲哚氧基辛酸鹽和6-氯代-3-吲哚氧基棕擱酸鹽(針對酯酶)；以及6-氯代-3-吲哚氧基磷酸對甲苯胺鹽(針對磷酸酶)。形成紫色的生色底物包括5-碘代-3-吲哚氧基-P -D-吡喃半乳糖苷并且形成綠色的生色底物包括N-甲基-吲哚氧基-P -D-吡喃半乳糖苷。其他可沉淀染料包括4，6-二氯-N-乙?；胚?3-醇、6-氯吲哚-D-半乳糖五乙酸酯、6-氯吲哚-P-D半乳糖苷、6-氯吲哚氧-1，3- 二醋酸鹽、5-氯代-2-羧基苯甘氨酸鈉鹽、4-氯代氨茴酸、甲基[6-氯代-N-乙酰吲哚-3-基-(2，3，4-三-氧-乙?；?P -D-吡喃葡萄糖苷)]糖醛酸、6-氯吲哚-P-D-吡喃葡萄糖苷糖醛酸單環(huán)己胺鹽、Sadler等人在J.Am Chem. Soc. (78:1251-1255，1956)中報道的氯吲哚(chloroindigo)以及 4，6-二氯吲哚基-P -D-葡萄糖苷酸、6，7- 二氯吲哚基-P -D-葡萄糖苷酸、6，7- 二氯吲哚基-P -D-葡萄糖苷酸、4，6，7-三氯吲哚基-P -D-葡萄糖苷酸、4，6- 二氯吲哚基-P -D-半乳糖苷、6，7- 二氯吲哚基-P -D-半乳糖苷和4，6，7-三氯吲哚基-P -D-半乳糖苷。合適的檢測試劑還包括非沉淀指示劑染料(S卩，能夠在水凝膠中擴散的水溶性染料)。非沉淀性指示劑染料包括如本文所描述的pH指示劑(例如，偶氮苯pH指示劑、磺酞pH指示劑和蒽醌PH指示劑。非沉淀性指示劑染料還包括與酶發(fā)生反應(yīng)以釋放出水溶性染料的顯色酶底物(例如，對硝基酚磷酸鈉或?qū)ο趸交?3 -D-葡糖苷，它們都可被水解，形成對硝基苯)以及可與酶發(fā)生反應(yīng)以釋放水溶性熒光染料的熒光酶底物(例如，4-甲基傘形酮磷酸酯或4- 3 -D-葡糖苷，它們都可被水解，形成對硝基苯)。在傳統(tǒng)的制品和方法(例如，瓊脂培養(yǎng)皿方法)中使用非沉淀性染料的問題在于，通常將指示劑染料摻入瓊脂中并且微生物在整個生長周期期間能夠與染料發(fā)生反應(yīng)。通過這種相對長時間段地暴露于指示劑染料，允許水溶性產(chǎn)品的明顯橫向擴散，這會導(dǎo)致形成疊置兩個或更多個菌落的大指示劑染料區(qū)。因此，在傳統(tǒng)方法中，操作者可能不能區(qū)分是哪個或哪些菌落與指示劑染料發(fā)生反應(yīng)。相比之下，本發(fā)明的方法(下述的)包括第一孵育時間段，在第一孵育時間段期間，微生物(如果存在的話)不能夠與檢測試劑發(fā)生反應(yīng)。本發(fā)明的方法還包括第二孵育時間段，在第二孵育時間段中，微生物(如果存在的話)暴露于檢測試劑。因為第二孵育時間段可相對短(例如，約15分鐘、約30分鐘、約I小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時或約10小時)，所以非沉淀性指示劑染料沒有足夠時間完全擴散穿過由液體樣品和冷水溶性膠凝劑形成的凝膠。有利地，這樣允許使用水溶性指示劑試劑，如果在水凝膠中用微生物較長時間段(例如，18小時、24小時、36小時或48小時)地孵育指示劑試劑，則該試劑將會擴散至離菌落附近太遠(yuǎn)的地方。優(yōu)選地，第二基材122是透明或半透明的，以允許透過基材122觀察細(xì)菌菌落或?qū)ζ溥M(jìn)行成像，并且第二基材基本不吸水。適用于第二基材122的材料的非限制性例子包括聚酯、丙烯酸或聚苯乙烯。其他合適材料包括具有防水(例如，聚合物型)涂層的紙張或硬紙板材料。用于構(gòu)造第二基材122的材料應(yīng)該對微生物具有相對惰性，并且優(yōu)選地應(yīng)該與消毒過程(例如，環(huán)氧乙烷消毒)相配合。在一些實施例中，覆蓋片材120還可包括粘附于第二基材122的可選第二粘合劑層124。第二粘合劑層124可以是水溶性的，應(yīng)該對于微生物的生長是非抑制性的，并且應(yīng)該能夠經(jīng)受住消毒過程(如果用到消毒過程的話)。優(yōu)選地，第二粘合劑層124在潤濕時是充分透明的，以能夠透過覆蓋片材110觀察細(xì)菌菌落或?qū)ζ溥M(jìn)行成像。在一些實施例中，例 如，第二粘合劑層124可包括壓敏粘合劑，如增粘高壓敏感的丙烯酸異辛酯/丙烯酸共聚物粘合劑(96重量％的丙烯酸異辛酯和4重量％的丙烯酸)。第二干涂層126包括檢測試劑。可選地，第一干涂層126還可包括冷水溶性膠凝齊IJ (例如，瓜耳膠、黃原膠、刺槐豆膠)，如美國專利No. 4，565，783中所描述的；營養(yǎng)物質(zhì)、裂解劑、選擇劑或以上兩種或更多種的任意組合。通常，將基于要檢測的微生物來選擇營養(yǎng)物質(zhì)、選擇劑和/或裂解劑。合適的營養(yǎng)物質(zhì)、選擇劑和用于檢測微生物的檢測試劑的非限制性例子可見于美國專利 No. 4，575，783、No. 5，089，413、No. 5，443，963、No. 5，462，860、No. 5，601，998,No. 5，635，367,No. 5，681，712、和 5，364，766，這些專利的全文都以引用方式并入本文?？蛇x的裂解劑可以將微生物部分或全部裂解，從而能夠檢測微生物的內(nèi)部組分(例如，酶)。裂解劑包括洗滌劑、酶(例如，溶菌酶、溶葡球菌酶)和噬菌體。在一些實施例中，例如，通過將第二干涂層126粘附于第二粘合劑層124，可以將第二干涂層126連接到第二基材122，如在美國專利No. 4，565，783中所描述的。在一些實施例中，例如，通過將含有檢測試劑(可選地具有膠凝劑(例如，冷水溶性膠凝劑)、營養(yǎng)物質(zhì)、選擇劑和/或裂解劑)的液體混合物涂覆到第二基材122或第二粘合劑層124上并且之后將混合物干燥，可以將第二干涂層126連接到第二基材122，如在美國專利No. 4，565，783中所描述的。第二干涂層126可包括檢測試劑，該檢測試劑在接觸預(yù)定量的液體樣品時達(dá)到足以檢測靶微生物的濃度，但卻還抑制靶微生物的生長。在一些實施例中，第二干涂層126中的檢測試劑的量足以檢測靶微生物，但卻還基本抑制靶微生物的生長。圖Ib示出圖Ia的檢測制品100的俯視圖。該圖示出覆蓋片材120、阻擋層的凸塊區(qū)141和微孔膜的凸塊區(qū)151。該圖還示出可選的滲透邊界153和由沿著制品100邊緣對齊的雙面粘合劑帶130形成的鉸接區(qū)域(hinge region) 105。圖Ic示出圖Ia的制品100的頂部透視圖。制品100包括基體構(gòu)件110，該基體構(gòu)件包括第一基材112、可選的第一粘合劑層114和第一干涂層116。另外，圖Ic中示出的是微孔膜150、阻擋層140和覆蓋片材120，該覆蓋片材包括第二基材122、可選的第二粘合劑層124和第二干涂層126。如上所述，微孔膜150包括滲透邊界153。圖2示出根據(jù)本發(fā)明的檢測制品200的另一個實施例的分解側(cè)視圖。如上所述，制品200包括基體構(gòu)件210、阻擋層240和覆蓋片材220。制品200還包括具有微孔膜250的膜載體255。膜載體255設(shè)置在基體構(gòu)件210和阻擋層240之間。在一些實施例中，膜載體255連接到基體構(gòu)件210和/或阻擋層240 (例如，借助雙面粘合劑帶230)。如上所述，膜載體250可通過替代手段連接到基體構(gòu)件210和/或阻擋層240。膜載體255被構(gòu)造用于支承微孔膜250。膜載體255優(yōu)選地是自支承的并且基本不吸水。適用于膜載體255的材料的非限制性例子包括聚酯、聚丙烯或聚苯乙烯膜。其他適用材料包括具有防水(例如，聚合物型)涂層的紙張或硬紙板材料。膜載體255可以是透明的、半透明的或不透明的。膜載體255還包括孔257，當(dāng)從制品200拆下阻擋層240時，該孔允許從基體構(gòu)件210穿過微孔膜250直至覆蓋片材220的流體連通?？蛇x地，膜載體 255可包括凸塊區(qū)251，該凸塊區(qū)延伸超出基體構(gòu)件210和/或覆蓋片材220的外圍邊界。例如，孔257可以是任何形狀，如，圓形、方形、矩形、六邊形、八邊形、橢圓形或不規(guī)則形狀。微孔膜250的尺寸可以被設(shè)計為與孔257共延。在一些實施例中，微孔膜250小于孔257。在一些實施例中，如圖2中所示，微孔膜250大于孔257。微孔膜的尺寸可以被設(shè)計為提供適于分配預(yù)定量液體樣品的區(qū)域。例如，為了分配I毫升的樣品，微孔膜250可以是約20cm2至約30cm2。例如，為了分配5毫升的樣品，微孔膜250可以是約45cm2。微孔膜250 (優(yōu)選地，通過粘合劑)連接到膜載體255，使得這種連接防止液體樣品經(jīng)過膜載體255和微孔膜250之間。因此，液體從微孔膜250的一個主表面流至另一個主表面基本上要求液體經(jīng)過膜250。圖3a示出根據(jù)本發(fā)明的檢測制品300的另一個實施例的分解側(cè)視圖。如本文所描述的，制品300包括覆蓋片材320、阻擋層和微孔膜350。如本文所描述的，阻擋層340和微孔膜350還分別包括可選的凸塊區(qū)341和351。如本文所描述的，微孔膜350還包括可選的滲透阻擋件353。在這個實施例中，如本文所描述的，基體構(gòu)件310包括基材312、可選粘合劑層314和干涂層316?；w構(gòu)件還包括墊片318。包括孔319的墊片318應(yīng)該由水不溶性材料構(gòu)造。孔319的壁與基體構(gòu)件310 —起形成預(yù)定尺寸和形狀的樣品接納凹槽，用于限定制品300中沉積的液體樣品的體積。墊片318的厚度以及孔319的大小應(yīng)該足以形成具有所需容積(例如，I毫升、2毫升、3毫升、5毫升或更大體積)的凹槽。閉孔聚乙烯泡沫或聚苯乙烯泡沫是適用于墊片318的材料，但是可以使用為疏水性(不可潤濕)的、對微生物惰性的材料，并且優(yōu)選能夠經(jīng)受住滅菌處理的材料。如美國專利No. 4，565，783中所描述的，例如，可以通過粘合劑將墊片318連接到基體構(gòu)件310。在一些實施例中，微孔膜350可以被構(gòu)造在具有滲透邊界353的制品300中，該滲透邊界與孔319的形狀、尺寸和位置相符。在一些實施例中，微孔膜350由滲透邊界353限定的面積可以大于孔319的面積。在一些實施例中，滲透邊界353可以防止樣品液體在微孔膜350內(nèi)過渡擴散。微孔膜350應(yīng)該被設(shè)置成使得在使用過程中，微孔膜350的至少一部分覆蓋孔319。優(yōu)選地，在使用過程中，微孔膜350被設(shè)置成使得微孔膜350完全覆蓋孔319。在一些實施例中，微孔膜350的面積大于孔319的面積并且微孔膜350延伸超出孔319的周邊。在一些實施例中，如圖3a中所示，基體構(gòu)件310、微孔膜350、阻擋層340和覆蓋片材320可以彼此連接。例如，它們可以用雙面粘合劑帶330的單個片段彼此連接。然而，上述的其他連接手段可能是合適的。圖3b示出圖3a的檢測制品300的俯視圖。該圖示出覆蓋片材320、阻擋層的凸塊區(qū)341和微孔膜的凸塊區(qū)351。圖3b還示出可選滲透邊界353、孔319、由沿著制品300邊緣對齊的雙面粘合劑帶330形成的鉸接區(qū)305。盡管圖3b的孔319的形狀為圓形，但具有其他形狀的孔319也可能是合適的。例如，孔319的形狀可以是方形、橢圓形、矩形、六邊形、八邊形或它可以是不規(guī)則的形狀。
圖3c示出圖3a的制品300的頂部透視圖。制品300包括基體構(gòu)件310，該基體構(gòu)件包括第一基材112、可選的第一粘合劑層114、第一干涂層316和墊片318。另外，在圖3c中示出的是微孔膜350、阻擋層340和覆蓋片材320，該覆蓋片材包括第二基材322、可選的第二粘合劑層324和第二干涂層326。圖4示出根據(jù)本發(fā)明的檢測制品400的另一個實施例的分解側(cè)視圖。制品400包括所有如本文描述的阻擋層440、覆蓋片材420和支承微孔膜450的膜載體455。如本文所描述的，該制品還包括基體構(gòu)件410，該基體構(gòu)件包括具有孔419的墊片418。微孔膜450可以構(gòu)造在制品400中，使得微孔膜450的面積與孔419共延。在一些實施例中，微孔膜450的面積可小于孔419的面積。在一些實施例中，微孔膜450的面積可小于孔419的面積。微孔膜450應(yīng)該被設(shè)置成使得在使用過程中，微孔膜450的至少一部分覆蓋孔419。優(yōu)選地，在使用過程中，微孔膜450被設(shè)置成使得微孔膜450基本覆蓋孔419。在一些實施例中，微孔膜450的面積大于孔419的面積并且微孔膜450延伸超出孔419的周邊。檢測微牛物的方法本發(fā)明提供了一種檢測液體樣品中的微生物的方法。該方法包括提供被懷疑含有微生物的液體樣品和本文描述的檢測制品的任一個實施例。該制品包括基體構(gòu)件，其包括含有冷水溶性膠凝劑的第一干涂層；微孔膜；覆蓋片材，其包括含有檢測試劑的第二干涂層；以及可去除阻擋層，其形成微孔膜和覆蓋片材之間的流體阻擋。微孔膜設(shè)置在基體構(gòu)件和阻擋層之間。在圖5中示出該方法的其他步驟?？蛇x地，可用營養(yǎng)物質(zhì)混合或稀釋液體樣品，以有助于微生物(未示出)的生長?？蛇x地，可以用選擇劑或檢測試劑(未示出)混合或稀釋液體樣品。在一些實施例中，可以用營養(yǎng)物質(zhì)、選擇劑和檢測試劑的任何組合來混合或稀釋液體樣品。在一些實施例中，當(dāng)檢測制品不含有營養(yǎng)物質(zhì)、選擇劑和/或檢測試劑時，可以向液體樣品中添加營養(yǎng)物質(zhì)、選擇劑和/或檢測試劑。在一些實施例中，即使檢測制品含有營養(yǎng)物質(zhì)、選擇劑和/或檢測試劑，也可以向液體樣品中添加營養(yǎng)物質(zhì)、選擇劑和/或檢測試劑。該方法還包括使預(yù)定量的液體樣品接觸基體構(gòu)件的過程581。最開始，暴露基體構(gòu)件的第一干涂層。這可以通過(例如)將制品(參見，例如圖Ia和圖Ic的制品100)放置在相對水平的表面上并且抬起微孔膜來暴露第一干涂層來實現(xiàn)?？梢酝ㄟ^凸塊區(qū)(如果存在的話)抓握微孔膜。
在抬起微孔膜從而暴露第一干涂層之后，將預(yù)定量(例如，I毫升、2毫升、3毫升、5毫升)的液體樣品轉(zhuǎn)移(例如，傾倒或移取)到第一干涂層上，從而接觸第一干涂層。在一些實施例中，液體樣品可以沉積到通過墊片中的孔形成的樣品接納凹槽中，該墊片連接到包括第一干涂層的基體構(gòu)件。該方法還包括使微孔膜接觸樣品的過程582。微孔膜接觸液體樣品使得至少一部分液體樣品遷移到微孔膜中，從而形成水合物區(qū)域。例如，可以簡單通過將被抬起以暴露干涂層的微孔膜放低來實現(xiàn)微孔膜與液體樣品的接觸。過程582可選地還可包括使用種菌撒布裝置(例如，用于接種PETRIFILM板的撒布機，可得自3M公司(St. Paul, MN))將液體樣品分配到第一干涂層和微孔膜的選定部分(例如，預(yù)測量區(qū)域)上。該方法還包括在第一時間段期間孵育制品的過程583。第一孵育提供了有助于微生物生長的條件(即，時間、溫度)。相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識到，可以根據(jù)要檢測的 微生物來選擇孵育時間。例如，如果要檢測的是酵母或霉菌，則第一孵育溫度通?？梢允菑募s室溫(大約23°C)至約32°C。例如，如果要檢測的是細(xì)菌，則第一孵育溫度通?？梢允羌s室溫至約45 °C。根據(jù)本發(fā)明，第一孵育時間段可以短至約I小時。在一些實施例中，第一孵育少于約4小時(例如，少于約2小時、少于約3小時或少于約4小時)。在一些實施例中，第一孵育時間段少于約8小時(例如，少于約5小時、少于約6小時、少于約7小時或少于約8小時)。在一些實施例中，第一孵育少于約12小時(例如，約9小時、約10小時、約11小時或約12小時)。在一些實施例中，第一孵育時間段少于或等于約15小時(例如,少于13小時、少于約14小時或少于約15小時)。在一些實施例中，第一孵育時間段長達(dá)48小時(例如,少于約24小時、少于約36小時或少于約48小時)。該方法還包括重新定位阻擋層的過程584。阻擋層被重新定位成提供微孔膜的水合物區(qū)域的至少一部分和第二干涂層的至少一部分之間的接觸。優(yōu)選地，阻擋層被重新定位成提供微孔膜的整個水合物區(qū)域和第二干涂層之間的接觸。例如，可以通過扭曲或折疊阻擋層來提供水合物區(qū)域和第二干涂層之間的接觸，從而將阻擋層重新定位。在一個優(yōu)選的實施例中，可以從檢測制品去除阻擋層(即，阻擋層松弛地插入制品中或者以可分離的方式附著于制品)，以提供微孔膜的水合物區(qū)域和第二干涂層之間的接觸。微孔膜的水合物區(qū)域和第二干涂層之間的接觸允許第二干涂層進(jìn)行水合作用，由此允許第二干涂層中的檢測試劑、裂解劑或選擇劑與微生物、微生物的組分和/或微生物的代謝副產(chǎn)物的相互作用。這種相互作用可以提供可檢測信號。該方法還包括在第二時間段內(nèi)孵育制品的過程585。在一些實施例中，第二時間段內(nèi)的孵育溫度可以與用于第一時間段的溫度相同。在一些實施例中，第二時間段內(nèi)的孵育溫度可以與用于第一時間段的溫度不同。有利地，第二時間段內(nèi)的孵育溫度可以高于用于第一時間段的溫度，從而縮短觀察可檢測信號所需的時間。根據(jù)本發(fā)明，第二孵育時間段應(yīng)該是足以觀察可檢測信號的時間量。在一些實施例中，優(yōu)選地，第二孵育時間段比第一孵育時間段短。與以上的第一孵育時間段中的任一個結(jié)合，第二孵育時間段可以為短至約15分鐘。與以上的第一孵育時間段中的任一個結(jié)合，第二孵育時間段少于約30分鐘。與以上的第一孵育時間段中的任一個結(jié)合，第二孵育時間段少于或等于4小時(例如，少于或等于約I小時、少于或等于約2小時、少于或等于約3小時或少于或等于約4小時)。與以上的第一孵育時間段中的任一個結(jié)合，第二孵育時間段少于或等于8小時(例如，少于或等于約5小時、少于或等于約6小時、少于或等于約7小時或少于或等于約8小時)。與以上的第一孵育時間段中的任一個結(jié)合，第二孵育時間段少于或等于12小時(例如，少于或等于約9小時、少于或等于約10小時、少于或等于約11小時或少于或等于約12小時)。與以上的第一孵育時間段中的任一個結(jié)合，第二孵育時間段長達(dá)約96小時(例如，少于或等于約48小時、少于或等于約72小時、少于或等于約96小時)。該方法還包括觀察是否存在微生物生長的指征的過程586?？梢杂媚繙y和/或通過儀器(例如，成像系統(tǒng))觀察這種指征，并且這兩種類型(人工和自動的)檢測手段都是本發(fā)明料想到的。微生物生長指征的性質(zhì)取決于制品中的檢測試劑(或多種檢測試劑)。例如，某些檢測試劑(例如，酶底物)當(dāng)其與微生物或其組分相互作用時產(chǎn)生可檢測的有色或熒光產(chǎn) 物。例如，某些檢測試劑(例如，PH指示劑)在存在酸性或堿性的微生物代謝副產(chǎn)物時用顏色或熒光產(chǎn)生可檢測的變化。例如，某些檢測試劑(例如，多糖或多肽聚合物)在其實質(zhì)狀態(tài)下是相對不透明的，并且當(dāng)被微生物或其組分降解時變得相對透明。在一些實施例中，存在微生物生長的指征包括存在可檢測微生物菌落。可通過目測檢測微生物菌落?？墒褂贸上裣到y(tǒng)檢測微生物菌落。適用于檢測微生物菌落的系統(tǒng)在全文都以引用方式并入本文的例如2009年6月15日提交的國際專利公開No. WO2005/024047、美國專利申請公開No. US 2004/0101954和US 2004/0102903以及美國專利申請No. 61/187，107 (代理人案卷號65250US002)中有所描述。合適的成像系統(tǒng)的非限制性例子包括可獲自3M公司(St. Paul, MN)的PETRIFILM讀板機(PPR)，可獲自SpiralBiotech (Norwood, MA)的PETRI SCAN菌落計數(shù)器和可獲自Synbiosis (英國劍橋)的PROTOCOL 和 ACOLYTE 板掃描機。在一些實施例中，存在微生物生長的指征包括存在通過目測或與用目測不可檢測的微生物菌落相關(guān)的通過儀器檢測到的反應(yīng)。在任何一個上述實施例中，該方法還可包括對微生物進(jìn)行計數(shù)的步驟。在一些實施例中，可以通過對制品中離散菌落的數(shù)量進(jìn)行計數(shù)，對微生物進(jìn)行計數(shù)。在一些實施例中，可以通過對制品中與用目測不可檢測的菌落相關(guān)的離散反應(yīng)(例如，有色區(qū)、熒光區(qū)、透光區(qū))的數(shù)量進(jìn)行計數(shù)，對微生物進(jìn)行計數(shù)。對微生物進(jìn)行計數(shù)的步驟可包括使用成像系統(tǒng)對微生物進(jìn)行計數(shù)。觀察是否存在微生物生長的指征可包括得到制品的圖像。觀察是否存在微生物生長的指征還可包括打印、顯示或分析圖像?，F(xiàn)將參考以下非限制性實例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。所有的份數(shù)和百分?jǐn)?shù)均以重量份表示，除非另有指明。除非另外指明，否則實例中的所有份數(shù)、百分?jǐn)?shù)、比率等均按重量計。除非另外指明，否則所使用的溶劑和其他試劑均得自Sigma-AldrichChemical公司(Milwaukee, WI)。實例I微孔膜載體的制備將用水溶性粘合劑(96重量％的丙烯酸異辛酯和4重量％的丙烯酸)的薄層涂覆的雙軸取向聚丙烯(BOPP，I. 6mil(0. 04mm)厚度)膜沖切成環(huán)狀墊圈。墊圈的外徑是大約52. 5mm并且墊圈的內(nèi)徑是大約45mm。從BOPP (0. 04mm厚)的矩形片材(大約75mmX95mm)沖切出圓形孔(大約44mm的直徑)。尼龍膜過濾器(47mm, 0. 45mm 標(biāo)稱孔徑,得自 Alltech Associates (Deerfield, IL))在BOPP片材的粘合劑涂布面上的孔上方保持居中。墊圈的粘合劑面在膜過濾器的外邊緣上方保持居中并且被壓向過濾器和BOPP片材，從而將膜過濾器的邊緣密封至BOPP片材。檢測制品的制備如下地制備基體構(gòu)件。用比率為2:1的Meyprogat Guar (Ml50)和標(biāo)準(zhǔn)方法營養(yǎng)物質(zhì)肉湯制劑(Standard Methods Nutrients Broth)的組合物粉末涂布一個主表面上(粘合劑表面上)包括有機娃粘合劑的塑料膜(Microamp Optical Adhesive Film,編號4311971,得自 Applied Biosystems (Foster City, CA)),如美國專利 No. 4，565，783 中所描述的。在表I中列出標(biāo)準(zhǔn)方法營養(yǎng)物質(zhì)肉湯制劑的組分。粉末的涂層重量為每24平方英寸大約8 粒。將一側(cè)具有水溶性粘合劑薄層和約5cm的圓形孔的泡沫墊片(聚苯乙烯夾板襯墊泡沫(capliner foam), 0. 5mm 厚，American Fuji Seal Inc. (Bardstown, KY))層合至基體構(gòu)件的涂布面。表I.標(biāo)準(zhǔn)方法營養(yǎng)物質(zhì)肉湯制劑所有組分被作為粉末添加并且在使用前徹底混且。
權(quán)利要求
1.一種用于對樣品中的微生物進(jìn)行檢測或計數(shù)的制品，所述制品包括 基體構(gòu)件，其包括具有上主表面和下主表面的水不能透過的自支承基材，其中所述上主表面包括含有冷水溶性膠凝劑的第一干涂層； 微孔膜； 覆蓋片材，其包括含有檢測試劑的第二干涂層； 阻擋層，其被構(gòu)造用于在所述微孔膜和所述覆蓋片材之間形成流體阻擋；并且 其中所述微孔膜設(shè)置在所述基體構(gòu)件和所述阻擋層之間。
2.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的制品，還包括具有孔的墊片，其中所述墊片連接到所述基體構(gòu)件，其中所述墊片和所述基體構(gòu)件形成樣品接納凹槽。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述的制品，其中所述覆蓋片材附著于所述基體構(gòu)件。
4.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的制品，其中所述微孔膜附著于所述基體構(gòu)件。
5.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的制品，其中所述阻擋層附著于所述基體構(gòu)件。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制品，其中所述阻擋層以可分離的方式附著于所述基體構(gòu)件。
7.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的制品，其中所述微孔膜含有選自以下的材料聚醚砜、尼龍、聚碳酸酯、聚酯、醋酸纖維素、混合的纖維素酯、聚偏二氟乙烯、硝化纖維、陶瓷、以上材料中任一種的衍生物以及以上材料中的任意兩種或更多種的組合物。
8.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的制品，其中所述微孔膜還包括樣品容納區(qū)。
9.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的制品，還包括營養(yǎng)培養(yǎng)基。
10.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的制品，還包括選擇劑。
11.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的制品，還包括多種檢測試劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的制品，其中所述多種檢測試劑中的至少兩種區(qū)分至少兩種類型的微生物。
13.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的制品，其中所述覆蓋片材還包括冷水溶性膠凝劑。
14.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的制品，還包括裂解劑。
15.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的制品，其中所述檢測試劑包括非沉淀性檢測試劑。
16.—種檢測樣品中是否存在微生物的方法，所述方法包括 提供 懷疑含有微生物的液體樣品； 檢測制品，所述檢測制品包括 基體構(gòu)件，其包括含有冷水溶性膠凝劑的第一干涂層； 微孔膜； 覆蓋片材，其包括含有檢測試劑的第二干涂層； 阻擋層，其在所述微孔膜和所述覆蓋片材之間形成流體阻擋； 其中所述微孔膜設(shè)置在所述基體構(gòu)件和所述阻擋層之間； 使預(yù)定量的所述樣品接觸所述第一干涂層； 使所述微孔膜接觸所述樣品； 將所述制品孵育第一時間段； 將所述阻擋層重新定位，以在所述覆蓋片材和所述微孔膜之間提供接觸；將所述制品孵育第二時間段；和 觀察微生物生長是否存在的指征。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中重新定位所述阻擋層的步驟包括從所述制品去除所述阻擋層。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或權(quán)利要求17所述的方法，其中所述制品還包括與所述基體構(gòu)件形成樣品接納凹槽的墊片，其中使預(yù)定量的所述樣品接觸所述第一干涂層的步驟包括將所述樣品轉(zhuǎn)移到所述樣品接納凹槽中。
19.根據(jù)權(quán)利要求16至18中的任一項所述的方法，還包括將所述樣品與營養(yǎng)物質(zhì)、選擇劑、檢測試劑或以上物質(zhì)中的任何兩種或更多種的組合物混合的步驟。
20.根據(jù)權(quán)利要求16至19中的任一項所述的方法，其中所述第一時間段為約I小時至約48小時。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述第一時間段為約4小時至約6小時。
22.根據(jù)權(quán)利要求16至21中的任一項所述的方法，其中所述第二時間段為約15分鐘至約96小時或更短的時間。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述第二時間段為約15分鐘至約6小時。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述第二時間段為約2小時至約4小時。
25.根據(jù)權(quán)利要求16至24中的任一項所述的方法，其中所述第一干涂層的至少一部分包括多種檢測試劑，其中觀察微生物生長的指征的步驟包括檢測并區(qū)分兩種或更多種類型的微生物。
26.根據(jù)權(quán)利要求16至25中的任一項所述的方法，其中觀察是否存在微生物生長的指征包括對至少一種類型的微生物進(jìn)行計數(shù)。
27.根據(jù)權(quán)利要求16至26中的任一項所述的方法，其中觀察是否存在微生物生長的指征包括得到所述制品的圖像。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中觀察是否存在微生物生長的指征還包括打印、顯示或分析所述圖像。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測液體樣品中的微生物的制品。該制品包括用于選擇性調(diào)節(jié)樣品和檢測試劑之間的接觸的微孔膜和阻擋層。本發(fā)明還提供了一種使用方法。
文檔編號C12Q1/06GK102713616SQ201080060351
公開日2012年10月3日 申請日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者庫爾特·J·霍爾沃森, 斯特凡妮·J·莫勒, 耶西·D·米勒 申請人:3M創(chuàng)新有限公司