專利名稱：用于處理纖維素材料的方法和適用于該方法的cbhii/cel6a酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用真菌CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶或含有所述酶的酶制劑來處理纖維素材料的方法。所述酶適用于 各種工業(yè)用途，特別適用于生物燃料的生產(chǎn)，其中可有利地在中到高溫的范圍內(nèi)從木質(zhì)纖維材料中生產(chǎn)可發(fā)酵糖。本發(fā)明還涉及真菌CBHII/Cel6A多肽以及編碼所述酶的獨立的核酸分子、重組載體、生產(chǎn)所述酶的宿主細胞、含有所述酶的酶組合物，以及這些組合物的制備方法。本發(fā)明還涉及所述酶或酶組合物的各種應(yīng)用，其中需要對纖維素或木質(zhì)纖維材料進行酶轉(zhuǎn)化。
背景技術(shù)：
有限的化石燃料資源、由其釋放出的越來越多的二氧化碳以及所引起的溫室現(xiàn)象提出了使用生物質(zhì)作為可再生和清潔能源的需求。一種有希望的替代技術(shù)是生物燃料的生產(chǎn)，如從纖維素材料中制備乙醇、丁醇或丙醇。在運輸領(lǐng)域中，生物燃料暫時是唯一的選擇，其能夠?qū)⒍趸寂欧帕繙p少一個數(shù)量級。乙醇可以用于現(xiàn)有的車輛和分布系統(tǒng)，因此不需要昂貴的基礎(chǔ)設(shè)施投資。源自纖維素和木質(zhì)纖維可再生原料的糖還可以用作用于可取代石油基化學品的各種化學產(chǎn)品的原料。植物中的大多數(shù)碳水化合物以木質(zhì)纖維素的形式存在，其實質(zhì)上是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。在傳統(tǒng)的由木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇的方法中，木質(zhì)纖維材料首先進行化學或物理的預(yù)處理，使用酸水解、蒸汽爆破、氨纖維膨脹、堿性濕態(tài)氧化或臭氧預(yù)處理，以使纖維素成分更易于酶解。然后，纖維素成分被水解后，獲得可以通過酵母發(fā)酵成乙醇再蒸餾而獲得純乙醇的糖。木質(zhì)素是作為可以用作固體燃料的主要副產(chǎn)品而獲得的。在這種單獨的水解和發(fā)酵(SHF)過程中，酶水解溫度一般高于發(fā)酵溫度。水解過程中使用耐熱酶提供了潛在優(yōu)點，如在高溫體下的較高反應(yīng)速率，由于較高的比活和酶壽命而減少酶的用量，增大了流程配置和更好的衛(wèi)生方面的靈活性。為使生物乙醇生產(chǎn)過程更加經(jīng)濟而進行了持續(xù)的研究。其中一種選擇是同步糖化和發(fā)酵(SSF)法。其主要優(yōu)點是降低酶水解的終產(chǎn)物抑制，并減少了投資成本。其挑戰(zhàn)是尋找酶水解和發(fā)酵的有利條件，例如溫度和PH值。在綜合生物過程(CBP)中，外部添加的酶量可以通過利用能夠產(chǎn)生一組木質(zhì)纖維素酶的發(fā)酵生物質(zhì)或生物乙醇而大大減少。近年來，用于乙醇生產(chǎn)的微生物代謝工程已取得重大進展。除了釀酒酵母外，微生物如細菌屬發(fā)酵單胞菌和大腸桿菌以及酵母如樹干畢赤酵母、脆壁克魯維酵母已經(jīng)被確定可用于從纖維素中制備乙醇。在SSF法中，抑制劑和耐熱性以及利用多種糖的能力都是發(fā)酵微生物的重要特性。已經(jīng)開發(fā)的工程酵母菌除葡萄糖外還能夠發(fā)酵戊糖、木糖和阿拉伯糖。嗜熱微生物如解糖熱厭氧桿菌或熱纖梭菌已經(jīng)用于在50 60°C的高溫條件下將糖、包括木糖發(fā)酵成乙醇(嗜熱SSF或TSSF)。這種發(fā)酵生物質(zhì)也有用于CBP的潛力(Shaw等人，2008)。酶水解被認為是用于將纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖的最有前途的技術(shù)。然而，酶水解僅用于有限數(shù)量的工業(yè)規(guī)模，尤其是在使用高度木質(zhì)化的材料如木材或農(nóng)業(yè)廢棄物時，該技術(shù)并不令人滿意。已經(jīng)進行了提高纖維素材料的酶水解效率的工作(Badger，2002 ；Kurabi 等人，2005)。W02001060752 (丹麥Forskningscenter R丨so)公開了一種將固體木質(zhì)纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可燃性燃料產(chǎn)品的連續(xù)式方法。在用濕法氧化或蒸汽爆破進行預(yù)處理后，生物質(zhì)被部分地分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，然后再使用一種或多種糖酶進行部分水解(EC3. 2)。W02002024882 (加拿大Iogen Bio-Products公司)涉及一種通過采用含有纖維素酶和利用滅活其纖維素接合域(CBD)獲得的改性纖維二糖水解酶I (CBHI)的酶混合物對經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維基質(zhì)進行處理來將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖的方法。US2004/0005674 (美國Athenix公司)公開了可以直接用于木質(zhì)纖維素基質(zhì)的新型的酶混合物。協(xié)同酶混合物包含纖維素酶，以及諸如纖維素酶、木聚糖酶、木質(zhì)酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶或葡萄糖苷酸酶或其任何組合的輔助酶。纖維素酶被視為包括內(nèi)切葡聚糖酶(EG)、β-葡萄糖苷酶(BG) 和纖維二糖水解酶(CBH)。US20050164355 (美國Novozymes Biotech公司)公開了一種采用一種或多種選自EG、BG和CBH的纖維素分解酶在至少一種表面活性劑存在的條件下降解纖維素材料的方法。也可以使用其他的酶，如半纖維素酶、酯酶、過氧化物酶、蛋白酶、漆酶或其混合物。研究最多、應(yīng)用最廣泛的真菌來源的纖維素分解酶源自里氏木霉(無性型紅褐肉座菌)。已有源自更不為人所知的真菌的纖維素酶被公開。Hong等人(2003a和2003b)表征了耐熱子囊菌的EG和CBHI及其用于酵母的生產(chǎn)。Tuohy等人(2002)公開了三種類型的纖維二糖水解酶，包括來自埃默森籃狀菌的CBHI和 CBHII。將纖維二糖水解酶I (CBHI)、即糖基水解酶家族7中的成員用于纖維素材料的酶轉(zhuǎn)化是公知的，例如見W003/000941(丹麥Novozymes公司)，其涉及從不同真菌獲得的CBHI酶。W02005074656 (美國Novozymes公司)披露了源自如耐熱子囊菌的具有纖維素分解活性的多肽。W02007071818 (芬蘭Roal公司)公開了通過酶轉(zhuǎn)化以及含有所述酶的酶制劑從纖維素材料中制備糖水解產(chǎn)物的方法。所述方法中使用的酶包括耐熱纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β -葡萄糖苷酶，以及可選的源自耐熱子囊菌、嗜熱枝頂孢霉或嗜熱毛殼菌的木聚糖酶。在幾種應(yīng)用中已公開了纖維二糖水解酶II。W02004056981 (丹麥Novozymes公司)披露了具有纖維二糖水解酶II活性的多肽，編碼該多肽的多聚核苷酸，以及用于制備多肽并將多肽用于實際應(yīng)用、如生產(chǎn)乙醇的方法。所公開的全長DNA序列來自塔賓曲霉、嗜熱毛殼菌、嗜熱毀絲霉，以及梭孢殼屬菌、嗜熱枝頂包酶、囊狀長毛盤菌、環(huán)紋束梗孢菌和樟絨枝霉。專利EP 1578964Β1 (丹麥Novozymes公司)披露了嗜熱毛殼菌CBHII和多肽的全長氨基酸序列，該多肽由核苷酸序列編碼，并在嚴謹?shù)臈l件下與編碼所述酶的核苷酸序列的片段雜交。CN1757709 (中國山東農(nóng)業(yè)大學)披露了嗜熱毛殼酶CT2的嗜熱CBHII酶的核苷酸序列及其在畢赤氏酵母菌菌體中的表達。這種酶能夠轉(zhuǎn)化廢棄纖維材料。
W02006074005 (美國Genencor Int.公司)披露了紅褐肉座菌(里氏木霉)CBHII/Ce 16A酶的變異體。變異體酶是有用的，例如用于乙醇生產(chǎn)。W02007094852(美國Diversa公司和美國Verenium公司)披露了纖維素分解酶、編碼該酶的核酸及其生產(chǎn)和使用方法。所述酶可以是內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、β -葡萄糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、β -木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或寡聚酶。所述酶及酶混合物例如可用于制備燃料或生物乙醇。
W02008095033 (瑞士 Syngenta公司和美國Verenium公司)披露了具有木質(zhì)纖維素分解活性的酶，包括纖維二糖水解酶，其例如可用在制備燃料和加工生物質(zhì)材料中。W02009045627 (美國Verenium公司)披露了采用具有木聚糖酶、甘露聚糖酶和/或葡聚糖酶活性并且在提高PH值和溫度條件下活性提高且穩(wěn)定的酶類來分解半纖維素的方法。W02009089630 (加拿大Logen Energy公司)披露了通過葡萄糖減少抑制并含有一個或多個氨基酸取代基的纖維素酶家族6的變異體。W02009059234 (美國Novozymes公司)披露了生產(chǎn)在氧化還原活性金屬離子中還原的纖維素材料的方法，其可用于降解或轉(zhuǎn)化纖維素材料并制備發(fā)酵產(chǎn)物。實際應(yīng)用披露了例如嗜熱毛殼酶的CBHII的多肽。W02009085868 (丹麥Novozymes公司)披露了編碼酶的多肽、多聚核苷酸，以及用于制備發(fā)酵產(chǎn)品的方法，包括采用包含有所述多肽的纖維素分解酶組合物來糖化纖維素材料。這種纖維二糖水解酶可以來自里氏木霉、特異腐質(zhì)霉、嗜熱毀絲霉、太瑞斯梭殼孢霉和嗜熱毛殼菌。W02006074435和US2006218671 (美國Novozymes公司)披露了太瑞斯梭殼孢霉Cel6A纖維二糖水解酶的核苷酸及氨基酸序列。US7220565 (美國Novozymes公司)披露了具有提高的纖維素分解活性以及與嗜熱毀絲霉CBHII的成熟氨基酸序列的一致性的多肽。US2OO7O238I55 和 US20090280105 (美國 Genencor Int.公司)披露了含有來自Chrysosporium Iucknowense的新型酶的酶組合物，例如含有屬于糖基水解酶家族6的CBHIIa和CBHIIb酶。該酶組合物對于木質(zhì)纖維材料的水解很有效。Galagan等人(2003)披露了粗糙鏈孢菌0R74A的基因組序列，包括外切葡聚糖酶2前體的序列。Collins等人(2003)披露了埃默森籃狀菌CBHII/Cel6A的編碼序列。生物燃料如可再生的運輸燃料的市場預(yù)計在不久的將來將大大增漲。結(jié)果，人們對于使用替代性原料來生產(chǎn)生物燃料的興趣日漸迅速增長。利用存在于植物和森林或市政垃圾中的纖維素生物質(zhì)來發(fā)酵制備乙醇和其他醇成為補充化石燃料的燃料的一種有吸引力的途徑。由纖維素和木質(zhì)纖維素生物質(zhì)制備生物燃料的一個障礙是細胞壁的堅固性和無法以聚合物的形式存在的糖單體，其需要大量的加工來使糖單體成為通常用來通過發(fā)酵生產(chǎn)酒精的微生物。因此，存在對于提高纖維素和木質(zhì)纖維基質(zhì)的降解效率的新方法，以及新酶和酶混合物的持續(xù)需求。特別是，需要那種能夠攻擊結(jié)晶纖維素材料的不同糖苷鍵并由此對不同的待處理材料進行幾乎完全的水解的酶和酶混合物。亦即，需要這樣的酶，其在高的處理溫度下穩(wěn)定，由此能夠利用生物量的高度一致性，產(chǎn)生較高的糖和乙醇濃度。這種方法可以致使能源和投資成本大大節(jié)省。高溫也減少了水解過程中污染的危險。本發(fā)明的目的是至少解決這些需求中的一部分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于提高纖維素水解效率的新型的酶和酶組合物?？梢詮氖葻嶂旀呙?、黑果白絲菌(Melanocarpus albomyces)、嗜熱毛殼菌或埃默森籃狀菌中獲得的纖維二糖水解酶以及特別是纖維二糖水解酶II可用于水解和降解纖維素材料。所述酶在廣泛的溫度范圍內(nèi)在動力學上非常有效，并且盡管它們在高溫下具有高活性，然而它們在標準水解溫度下也非常高效。這使得它們極其適合于在常溫和高溫下進行的不同的纖維素基質(zhì)水解過程。本發(fā)明涉及一種采用CBHII/Cel6A多肽或含有所述多肽的酶制劑或產(chǎn)生所述多肽的發(fā)酵微生物來處理纖維素材料的方法，所述方法包括以下步驟i)制備本發(fā)明的
CBHII/Ce16A多肽或者含有所述多肽的酶制劑或者產(chǎn)生所述多肽的發(fā)酵微生物；ii)將纖維素材料與本發(fā)明的CBHII/Cel6A多肽或者含有所述多肽的酶制劑或者產(chǎn)生所述多肽的發(fā)酵微生物反應(yīng)；以及iii)獲得部分或完全水解的纖維素材料。在所述方法中使用的CBHII/Cel6A多肽具有纖維二糖水解酶活性，并且含有這樣的氨基酸序列，其與SEQIDNO: 12的全長多肽具有至少76%的一致性，與SEQ ID NO: 14的全長多肽具有至少76%的一致性，與SEQ ID NO: 15的全長多肽具有至少95%的一致性，或者與SEQ ID NO: 16的全長多肽具有至少91%的一致性。所述CBHII/Cel6A多肽也可以是具有類似特性如類似的底物特異性以及PH值和溫度的依賴性或穩(wěn)定性的片段或變異體。在所述方法中使用的CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶是糖基水解酶家族6中的纖維二糖水解酶II酶,其兼具水解反應(yīng)的保守折疊和立體化學結(jié)構(gòu)。適用于所述方法的CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶可從枝頂孢霉屬、黑果屬、毛殼菌屬或籃狀菌屬中獲得，更優(yōu)選地源自于嗜熱枝頂孢霉、黑果白絲菌、嗜熱毛殼菌或埃默森籃狀菌，最優(yōu)選地源自于保藏菌株嗜熱枝頂孢霉CBS 116240、黑果白絲菌CBS 685. 95、嗜熱毛殼菌CBS 730. 95或埃默森籃狀菌DSM 2432。適用于所述方法的CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶能夠在中到高溫條件下水解不同的纖維素材料，特別是與另外的酶相結(jié)合而用于水解各種纖維素或木質(zhì)纖維材料。本發(fā)明的CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶適用于各種用途，特別是用于生物燃料的生產(chǎn)。本發(fā)明還涉及新型的CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶，其具有纖維二糖水解酶活性，并且含有如下的氨基酸序列，其與SEQ ID NO: 12的全長多肽具有至少76%的一致性，與SEQ ID NO: 14的全長多肽具有至少76%的一致性，與SEQ ID NO: 15的全長多肽具有至少95%的一致性，或者與SEQ ID NO: 16的全長多肽具有至少91%的一致性。所述CBHII/Cel6A多肽也可以是具有類似特性如類似的底物特異性以及pH值和溫度的依賴性或穩(wěn)定性的片段或變異體。所述CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶能夠在中到高溫的條件下水解纖維素材料。所述酶由獨立的核酸分子編碼，該核酸分子含有編碼本發(fā)明的多肽的多聚核苷酸序列。優(yōu)選地，所述核酸含有如 SEQ IDNO: IUSEQ IDNO:13,SEQ IDN0:9 或 SEQ IDNO: 10 PJf定義的多聚核苷酸序列或其子序列。本發(fā)明的CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶可以由獨立的核酸分子編碼，所述核酸分子在嚴謹?shù)臈l件下雜交到 SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10、SEQID N0:7或SEQ ID NO:8所含的多聚核苷酸序列或其子序列。所述酶由保存于在登記號為DSM 22946的大腸桿菌中的質(zhì)粒pALK2582、保存于在登記號為DSM 22945的大腸桿菌中的質(zhì)粒pALK2581、保存于在登記號為DSM 22947的大腸桿菌中的質(zhì)粒PALK2904或保存于在登記號為DSM23185的大腸桿菌中的質(zhì)粒pALK3006中所包含的獨立的多聚核苷酸來編碼。本發(fā)明中的CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶可以從含有編碼所述纖維二糖水解酶的核酸分子或核苷酸序列的重組表達載體中制備。所述纖維二糖水解酶多肽可以在異源宿主、優(yōu)選微生物宿主內(nèi)制備。本發(fā)明還涉及一種獨立的核酸分子，其包括編碼真菌CBHII/Cel6A多肽的多聚核苷酸序列，其選自 (a) 一種編碼多肽的核酸分子或多聚核苷酸序列，該多肽具有纖維二糖水解酶活性，并含有如 SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 或 SEQ ID NO: 16 所列的全長氨基酸序列，或者是具有類似特性的其片段或變異體；(b) 一種編碼多肽的核酸分子或多聚核苷酸序列，該多肽具有纖維二糖水解酶活性，并且與SEQ ID NO: 12的全長氨基酸序列具有至少76%的一致性，與SEQ ID NO: 14的全長氨基酸序列具有至少76%的一致性，與SEQ ID NO: 15的全長氨基酸序列具有至少95%的一致性，或者與SEQ ID NO: 16的全長氨基酸序列具有至少91%的一致性，或者是具有類似特性的其片段或變異體；(c) 一種核酸分子，其含有如 SEQ ID NO: IUSEQ ID NO: 13,SEQ ID N0:9 或 SEQIDNO: 10所列的多聚核苷酸序列的編碼序列；(d) 一種核酸分子,其含有 DSM 22946、DSM 22945、DSM 22947 或 DSM 23185 所包含的多聚核苷酸序列的編碼序列；(e) 一種核酸分子，其編碼序列由于遺傳密碼的降解而與(C) (d)中任一種核酸分子的編碼序列不同；以及(f) 一種在嚴謹條件下雜交到 DSM 22946,DSM 22945,DSM 22947 或 DSM 23185 所包含的核酸分子上且編碼多肽的核酸分子，該多肽具有纖維二糖水解酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 12的全長氨基酸序列具有至少76%的一致性，與SEQ ID NO: 14的全長氨基酸序列具有至少76%的一致性，與SEQ ID NO: 15的全長氨基酸序列具有至少95%的一致性，或者與SEQ ID NO: 16的全長氨基酸序列具有至少91%的一致性的氨基酸序列，或者是具有類似特性的其片段或變異體。本發(fā)明進一步涉及一種重組表達載體，其含有可操作地連接到能夠在合適宿主中直接表達編碼本發(fā)明的CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶的基因以及產(chǎn)生所述CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶的調(diào)控序列上的本發(fā)明的核酸分子或多聚核苷酸序列。本發(fā)明還涉及含有上述重組表達載體的宿主細胞。優(yōu)選地，所述宿主為微生物宿主,例如絲狀真菌宿主。優(yōu)選的宿主為木霉屬、曲霉屬、鐮刀霉屬、腐質(zhì)霉屬、金孢霉屬、脈孢菌屬、根霉屬、青霉屬和被孢酶屬。更優(yōu)選地是，所述宿主為木霉屬或曲霉屬，最為優(yōu)選地是絲狀真菌里氏木霉。本發(fā)明涉及一種制備具有纖維二糖水解酶活性的本發(fā)明的多肽的方法，所述方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞以及收集所述多肽的步驟。在本發(fā)明中還包括一種由本發(fā)明的核酸分子編碼的具有纖維二糖水解酶活性的多肽，其通過上述方法獲得。本發(fā)明還涉及一種用于獲得酶制劑的方法，其包括培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞，以及制備全培養(yǎng)肉湯，或者從用過的培養(yǎng)基中分離細胞并獲得上清液的步驟。在本發(fā)明中還包括一種通過上述方法獲得的酶制劑。本發(fā)明還涉及一種酶制劑，其包括本發(fā)明的CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶。所述酶制劑可以進一步包括選自如下集合中的其它的酶纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶、葡聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、β -甘露糖苷酶、α -葡萄糖苷酸酶、乙?；揪厶酋ッ?、α -阿拉伯呋喃糖苷酶、α -半乳糖苷酶、果膠酶、內(nèi)切a-L-阿拉伯糖酶和外切a-L-阿拉伯糖酶、α-半乳糖苷酶、內(nèi)切半乳糖醛酸酶和外切半乳糖醛酸酶、內(nèi)切果膠裂解酶、果膠酸鹽裂解酶和果膠(甲)酯酶、苯酚酯酶、包括過木質(zhì)素過氧化物酶的木質(zhì)酶、錳過氧化物酶、H2O2-生成酶以及有介體或無介體的漆酶。所述酶制劑以全培養(yǎng)肉湯或用過的培養(yǎng)基的形式存在。它也可以液體、粉末或者 顆粒的形式存在。在本發(fā)明中還包括了本發(fā)明的CBHII/Cel6A多肽或酶制劑在制備生物燃料、洗滌齊IJ、處理纖維、處理食物或飼料、紙漿和紙、飲料或任何涉及纖維素材料水解或改性用途中的應(yīng)用。特別是，所述CBHII/Cel6A多肽或含有所述多肽的酶制劑可用于制備生物燃料。


圖I示意性顯示了在用于高效制備重組CBHII/Cel6A蛋白質(zhì)的里氏木霉原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化過程中所使用的表達框。cbh2/cel6A基因在里氏木霉cbhl/cel7A啟動子(p cbhl)的調(diào)控下，并且通過使用里氏木霉cbhl/cel7A終止子序列(t cbhl)來確保轉(zhuǎn)錄的終止。還包括作為轉(zhuǎn)化標記的amdS基因。圖2顯示了含有嗜熱枝頂孢霉CBS 116240、黑果白絲菌CBS 685.95、嗜熱毛殼菌CBS 730. 95和埃默森籃狀菌DSM 2432的重組CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶的酶組合物(100 μ g蛋白的反應(yīng))的pH值依賴性的測定。在3-10的pH值范圍內(nèi)在50°C下對AvicelPh101纖維素進行21h的水解。利用纖維二糖標準曲線通過對羥基苯甲酸酰肼(PAHBAH)法(Lever, 1972)來測定還原性糖的生成。圖3顯示了含有嗜熱枝頂孢霉CBS 116240、黑果白絲菌CBS 685.95、嗜熱毛殼菌CBS 730. 95和埃默森籃狀菌DSM 2432的重組CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶的酶組合物(100 μ g蛋白的反應(yīng))的熱穩(wěn)定性的測定。在40-80°C的溫度范圍內(nèi)在酶組合物的最佳pH值下對Avicel Ph 101纖維素進行21h的水解。利用纖維二糖標準曲線通過對羥基苯甲酸酰肼(PAHBAH)法(Lever，1972)來測定還原性糖的生成。圖4顯示了采用含有本發(fā)明的CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶的酶混合物對蒸汽爆破的硬木材料進行水解的結(jié)果。硬木底物在55°C和37°C下以每克總干物質(zhì)5mg蛋白質(zhì)的劑量采用不同的酶混合物進行水解。含有At_ALK04245_Cel6A、Ma_ALK04237_Cel6A或Ct_ALK04265_Cel6A的嗜熱酶混合物(混合物2)和嗜溫酶混合物(混合物里氏木霉酶和混合物ACC)的組合物的詳細說明見實施例4。水解72小時后從平行試驗的搖瓶中取樣，并用HPLC定量，測定葡萄糖和木糖的含量。從采用酶混合物所得的結(jié)果中減去以緩沖溶液替代酶樣品的底物空白樣的結(jié)果。就得 到木糖和葡萄糖的總含量。圖4A 顯示了采用補加有 At_ALK04245_Cel6A (混合物 2_AT)、Ma_ALK04237_Cel6A(混合物2_MA)或Ct_ALK04265_Cel6A (混合物2_CT)的嗜熱酶混合物(混合物2)在55°C下對蒸汽爆破的硬木進行水解的結(jié)果。圖4B 顯示了采用補加有 At_ALK04245_Cel6A(混合物 TR_AT)、Ma_ALK04237_Cel6A(混合物TR_MA)或Ct_ALK04265_Cel6A (混合物TR_CT)的嗜溫酶混合物(混合物里氏木霉酶)在37°C下對蒸汽爆破的硬木進行水解的結(jié)果。圖4C 顯示了采用補加有 At_ALK04245_Cel6A (混合物 ACC_AT)、Ma_ALK04237_Cel6A (混合物ACC_MA)或Ct_ALK04265_Cel6A (混合物ACC_CT)的嗜溫酶混合物(混合物ACC)在37 °C下對蒸汽爆破的硬木進行水解的結(jié)果。圖5顯示了采用含有本發(fā)明的CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶的酶混合物對蒸汽爆破的玉米棒材料進行水解的結(jié)果。玉米棒底物在55°C下以每克總干物質(zhì)5mg蛋白質(zhì)的劑量采用不同的酶混合物進行水解。含有本發(fā)明的At_ALK04245_Cel6A多肽(混合物2_AT)的嗜熱酶混合物(混合物2)的組合物的詳細說明見實施例5。水解72小時后從平行試驗的搖瓶中取樣，并用HPLC定量，測定葡萄糖和木糖含量。從采用酶混合物所獲得的結(jié)果中減去以緩沖溶液替代酶樣品的底物空白樣的結(jié)果。得到葡萄糖和木糖的總含量。序列表SEQ ID NO: I低聚核苷酸引物CBH_1S的序列SEQ ID NO:2低聚核苷酸引物CBH_1AS的序列SEQ ID N0:3低聚核苷酸引物CBH_8的序列SEQ ID NO:4低聚核苷酸引物CBH_9的序列SEQ ID NO:5低聚核苷酸引物Te_CBH_A的序列SEQ ID NO:6低聚核苷酸引物Te_CBH_B的序列SEQ ID NO: 7采用引物CBH_1S和 CBH_1AS從嗜熱枝頂孢霉ALK04245 (CBS 116240)中獲得的PCR片段的序列SEQ ID N0:8 采用引物 CBH_1S 和 CBH_1AS 從黑果白絲菌 ALK04237 (CBS 685.95)中獲得的PCR片段的序列。SEQ ID NO: 9 嗜熱毛殼菌 ALK04265 (CBS 730. 95) cbh2/cel6A 基因的核苷酸序列。SEQ ID NO: 10埃默森籃狀菌RF8069 (DSM 2432) cbh2/cel6A基因的核苷酸序列。SEQ ID NO: 11 嗜熱枝頂孢霉 ALK04245 (CBS 116240) cbh2/cel6A 基因的核苷酸序列。SEQ ID NO: 12 嗜熱枝頂孢霉 ALK04245 (CBS 116240) CBHII/Cel6A 的推導氨基酸序列。SEQ ID勵13黑果白絲菌么1^04237(085 685. 95) cbh2/cel6A基因的核苷酸序列。SEQ ID N0:14 黑果白絲菌 ALK04237(CBS 685. 95) CBHII/Cel6A 的推導氨基酸序列。SEQ ID NO: 15 嗜熱毛殼菌 ALK04265 (CBS 730. 95) CBHII/Cel6A 的推導氨基酸序列。
SEQ ID NO: 16 埃默森籃狀菌 RF8069 (DSM 2432) CBHII/Cel6A 的推導氨基酸序列。菌種保藏嗜熱枝頂孢霉ALK04245于2004年9月20日保存于位于荷蘭Upsalalaan8，3584CT, Utrecht的荷蘭微生物菌種保藏中心(CBS)，登記號為CBS 116240。嗜熱毛殼菌ALK04265于1995年11月8日保存于位于荷蘭Oosterstraat1，3742SKBAARN的荷蘭微生物菌種保藏中心(CBS)，登記號為CBS 730. 95。在當前的保存期終止后，樣本將根據(jù)協(xié)議保存，以便在超過專利保護期限后仍可獲得菌株。黑果白絲菌ALK04237于1995年10月11日保存于位于荷蘭Oosterstraat I, 3740AG BAARN的荷蘭微生物菌種保藏中心(CBS)，登記號為CBS 685.95。在當前的保存期終止后，樣本將根據(jù)協(xié)議保存，以便在超過專利保護期限后仍可獲得菌株。包含質(zhì)粒pALK2582的大腸桿菌菌株RF8175于2009年9月9日保存于位于德國Inhoffenstrasse 7B, D_38124Braunschweig的德國微生物菌種保藏中心(DSMZ),登記號為 DSM 22946。包含質(zhì)粒pALK2581的大腸桿菌菌株RF8174于2009年9月9日保存于位于德國Inhoffenstrasse 7B, D_38124Braunschweig的德國微生物菌種保藏中心(DSMZ),登記號為 DSM 22945。包含質(zhì)粒pALK2904的大腸桿菌菌株RF8214于2009年9月9日保存于位于德國Inhoffenstrasse 7B, D_38124Braunschweig的德國微生物菌種保藏中心(DSMZ),登記號為 DSM 22947。包含質(zhì)粒pAL 3006的大腸桿菌菌株RF8333于2009年12月10日保放于位于德國Inhoffenstrasse 7B, D_38124Braunschweig的德國微生物菌種保藏中心(DSMZ),登記號為 DSM 23185。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種利用CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶多肽或含有所述多肽的酶組合物來處理纖維素材料的方法。本發(fā)明還提供了一種真菌CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶多肽或含有所述CBHII/Cel6A多肽的酶組合物，所述多肽顯示出廣泛的底物特異性，并且能夠在廣泛的PH值和溫度范圍內(nèi)穩(wěn)定。其在中溫和高溫下均具有良好的性能。特別是，CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶多肽在高達70°C的條件下、優(yōu)選在40_60°C的溫度范圍內(nèi)至少能夠穩(wěn)定21小時。多肽和含有所述多肽的酶組合物在要求高效水解纖維素是其主要成分之一的復合纖維素或木質(zhì)纖維素材料的不同應(yīng)用中都很理想。多肽和酶組合物例如可以用于水解纖維素材料，以便從高分子原料中制備糖單體，然后再通過微生物發(fā)酵以生產(chǎn)生物燃料。因此，本發(fā)明提供了用于生物燃料和其他實際應(yīng)用的替代性的CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶。真菌CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶可以在高產(chǎn)真菌宿主中生產(chǎn)，可以有或沒有下游加工，例如發(fā)酵液和菌絲的分離很容易進行，或者在發(fā)酵生物機體中制備。本發(fā)明所用的用語“纖維素”或“纖維素材料”指含有纖維素作為主要組分的任何材料。纖維素是高等植物的主要結(jié)構(gòu)組分。它為植物細胞提供高抗張強度，幫助它們抵抗機械應(yīng)力和滲透壓。纖維素是一種由通過β-1，4-糖苷鍵相連的葡萄糖殘基的直鏈構(gòu)成的β-1，4-葡聚糖。纖維二糖是纖維素的最小重復單元。纖維素材料的例子包括源自如棉、亞麻、大麻、黃麻的織物纖維，以及諸如莫代爾、粘膠、萊賽爾的人造纖維素纖維。用語“纖維素”或“纖維素材料”也指含有纖維素作為主要組分的“木質(zhì)纖維素”或“木質(zhì)纖維材料”。在細胞壁中，纖維素被包裹在不同走向的薄層中，其嵌入半纖維素、果膠質(zhì)和/或苯酚丙醇單元的聚合物如木質(zhì)素的基質(zhì)中，以形成“木質(zhì)纖維材料”或“木質(zhì)纖維素”。木質(zhì)纖維素的物理特性是硬而密，并且無法透過。含木質(zhì)纖維素的材料例如包括植物材料,如木材(包括硬木和軟木)、硬木和軟木碎片、木漿、木屑，以及林業(yè)和木材工業(yè)廢棄物；草本作物、農(nóng)業(yè)生物質(zhì)(如谷類秸桿、糖用甜菜制漿、玉米纖維、玉米秸桿和玉米棒)、谷物β -葡聚糖、甘蔗渣、莖、葉、皮、殼等等；廢品，如市政固體垃圾、報紙和廢棄辦公紙張、廢纖維、造紙污泥、諸如谷物的磨粉廢棄物；專用的能源作物(如柳樹、楊樹、柳枝稷或利甘草等)。纖維素和木質(zhì)纖維素材料在本質(zhì)上可以被包括會產(chǎn)生能夠水解糖類聚合物的酶的細菌和真菌的各種生物機體降解。降解通常需要多種酶發(fā)生作用，其通常按順序地或同時地發(fā)生作用。纖維素到葡萄糖的生物轉(zhuǎn)化一般需要三種主要類型的水解酶(I)內(nèi)切葡聚糖酶(EG)，其主要是在纖維素的非晶區(qū)域內(nèi)切割內(nèi)部β-1，4-糖苷鍵；(2)外切葡聚糖酶或纖維二糖水解酶(CBH)，其從晶狀纖維素聚合物鏈的還原或非還原端切割二糖、纖維二糖；(3) β -I, 4-葡萄糖苷酶(BG)，其將纖維二糖和其它短纖維寡糖水解成葡萄糖。葡萄糖和纖維二糖用作水解反應(yīng)的終產(chǎn)品抑制劑。“纖維素酶”或“纖維素分解酶”是一種具有“纖維素酶活性”或“纖維素分解酶活性”的酶，這意味著它能夠水解纖維素材料。一種研究最多的纖維素酶體系是絲狀真菌里氏木霉，其已知至少有2種CBH,8種EG和5種BG。“木質(zhì)纖維素水解酶”是具有“木質(zhì)纖維素酶活性”或“木質(zhì)纖維素水解活性”的酶，這意味著它們能夠?qū)⒛举|(zhì)纖維素材料如纖維素、半纖維素或其衍生物水解成分子量較小的糖類?！?β -葡聚糖”是混聯(lián)(I — 3)，(I — 4) - β -D-葡聚糖。它們通常存在于例如谷物中。本發(fā)明所用的用語“ β -葡聚糖酶”指能夠至少部分地切割β -葡聚糖中的連接鍵的酶。本發(fā)明所用的用語“纖維二糖水解酶”或“CBH”指能夠從還原或非還原端切割諸如纖維素類的聚合物的1，4-β-D-糖苷鍵并主要產(chǎn)生纖維二糖的酶。它們也被稱為外切葡聚糖酶，或1，4- β -D-葡聚糖纖維二糖水解酶，或纖維素1，4- β -纖維二糖糖苷酶。CBH具有由諸如催化域和N-或C-端纖維素結(jié)合域(CBD)類的非重復域所構(gòu)成的模塊式結(jié)構(gòu)。還有一些本身缺乏CBD的纖維二糖水解酶。CBH可能還具有其他具有未知功能的域。不同的域通常通過甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸或蘇氨酸中所富含的O-糖基化連接橋或鉸鏈肽連接在一起。本發(fā)明所涉及“纖維二糖水解酶II”或“CBHII纖維二糖水解酶”或“CBHII/Cel6A 纖維二糖水解酶”或“CBHII/Cel6A纖維素酶”或“CBHII/Cel6A多肽”或“CBHII/Cel6A酶”意指按照國際生物化學和分子生物學聯(lián)盟(IUBMB 見http://www. iubmb. orR)歸類為EC3. 2. I. 91的一種1，4-β -D-葡聚糖纖維二糖水解酶的酶?；谄浣Y(jié)構(gòu)的相似性，本發(fā)明的纖維二糖水解酶II或CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶可以歸入具有類似的氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)的糖基水解酶家族 6 (GH6)中(Henrissat, 1991 ；Henrissat 和 Bairoch, 1993、1996 ；Henrissat 等人，1998 :也見 http: IIwm. cazy. org/farn/GH. html )。因為在序列和折疊相似性之間具有直接的關(guān)系，這一分類被認為比其專有的底物特異性更能反映出酶的結(jié)構(gòu)特點，有助于揭示酶之間的進化關(guān)系，并提供一種方便的工具來獲取機理信息。本發(fā)明所用的用語“纖維二糖水解酶活性”或“CBH活性”指對纖維素、纖維三糖、纖維四糖或主要從聚合物鏈的還原端或非還原端釋放纖維二糖的任何以β_1，4-鏈接的葡萄糖聚合物中的1，4-β-D-糖苷鍵具有水解活性。糖苷鍵的酶解是一種立體選擇性過程，其中異頭中心(Cl碳)的構(gòu)型既可反轉(zhuǎn)也可保持。這兩種構(gòu)型包含一對位于待切割鍵的任一側(cè)的羧酸殘基。反轉(zhuǎn)酶采用單置換機制，而保持酶涉及雙置換反應(yīng)(Sinnott，1990 ；Withers和Aebersold, 1995)。水解的立體化學進程通常由質(zhì)子NMR測定,其中α-和β-異頭質(zhì)子呈現(xiàn)出不同的化學位移(Withers等人，1986)。本發(fā)明中所用的用語“纖維二糖水解酶II活性”或“CBHII/Cel6A活性”指對纖維素、纖維三糖、纖維四糖或主要從聚合物鏈的還原端或非還原端釋放纖維二糖的任何以 β -I, 4-鏈接的葡萄糖聚合物中的1，4-β -D-糖苷鍵具有水解活性。CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶的反應(yīng)機理是構(gòu)型反轉(zhuǎn)型。分析纖維素酶活性的方法已在文獻有記載，例如可參考Ghose (1987)，Tomme等人(1988)和van Tilbeurgh等人(1988)?？偟睦w維素酶活性通常以過濾紙降解活性(FPU)來測量。纖維二糖水解酶活性可以使用小分子、可溶性纖維糊精和其顯色苷、如4-甲基傘形酮-β-D-苷進行分析。CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶可以基于水解反應(yīng)的結(jié)果來識別；CBHII/Cel6A酶不能切割小分子顯色低聚糖的葡萄糖苷鍵(van Tilbeurgh等人，1988)。纖維二糖水解酶活性還可以基于諸如Avicel Ph 101類的微晶纖維素來分析，例如實施例3中所用。水解后形成的可溶性還原糖可以通過利用纖維二糖標準曲線的對羥基苯甲酸酰阱(PAHBAH)法(Lever, 1972)、Somogyi-Nelson 法(Somogyi, 1952)、喊性鐵氰化物法(Robyt和 Whelan，1972),2, 2’ -雙辛可寧酸鹽法(Waffenschmidt 和 Jaenicke，1987)或二硝基水楊酸(DNS)法(Miller，1959)來測量。其他纖維素底物例如包括Solka floe纖維素或磷酸溶脹纖維素(Karlsson等人,2001)。纖維二糖水解酶II還可以用蛋白質(zhì)印跡或酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測法利用多克隆或單克隆抗體針對純化CBHII/Cel6A蛋白進行識別。用語“CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶”意指纖維二糖水解酶II酶，其屬于糖基水解酶家族6的成員，兼具水解反應(yīng)的保守折疊和立體化學結(jié)構(gòu)。本發(fā)明上下文中的用語“中溫”或“常規(guī)溫度”指纖維素水解中的常用溫度，其對應(yīng)于這些過程中的酶的最佳溫度或熱穩(wěn)定性。因此，該用語指30-45°C的溫度范圍。術(shù)語“升溫”或“高溫”指45_70°C的溫度范圍。在短時間的水解過程中，酶在高達80°C下仍然可以有效地作用。在這種高溫的范圍內(nèi)仍然具有活性或穩(wěn)定性的酶也稱為“耐熱”或“嗜熱”酶。能夠產(chǎn)生CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶多肽或CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶活性的微生物菌株可基于不同的底物進行篩選。首先，將所選的菌株在合適的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。在制得足夠量的目標纖維二糖水解酶后，將這種酶分離或純化，對其特性進行更完全地表征?；蛘撸瑢⒏鞣N生物機體中的編碼纖維二糖水解酶或CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶的基因分離，并且由基因編碼的氨基酸序列與在實施例I中所分離并表征的CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶的氨基酸序列進行比較。所制備的纖維二糖水解酶、特別是CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶能夠通過使用常規(guī)的酶化學方法如鹽制備、超濾、離子交換色譜、親和層析、凝膠過濾及疏水色譜法進行純化。純化過程可以通過蛋白質(zhì)測定、酶活性分析以及通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行監(jiān)測。可以對不同的溫度和pH值以及分子質(zhì)量及等電點的條件下的純化酶的酶活性和穩(wěn)定性進行測定?；蛘?，本發(fā)明的CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶的特性可以通過在重組宿主中制備酶、以及純化和表征重組CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶的酶來進行識別。此外，含有本發(fā)明的CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶作為主要酶組分之一的重組酶制劑的特性可依照實施例3中所述的方法進行表征。純化后的CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶的分子量可以通過質(zhì)譜法或根據(jù) Laemmli (1970)基于SDS-PAGE測量。所述分子量也可以利用ExPASy服務(wù)器處的pi/MW工JlChttp: //expasy. org/tools/pi tool, html ；Gasteiger 等人,2003)從酶的氨基酸序列中預(yù)測。CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶的酶的溫度依賴性或熱穩(wěn)定性可以在合適的緩沖液中在不同的溫度下通過如實施例3所述地使用例如Avicel纖維素作為底物來測定，或通過使用文獻中已描述的其它底物和緩沖體系來測定。PH依賴性和pH穩(wěn)定性可以在合適的緩沖液中在不同的PH值下通過以下基于纖維素底物的活性進行測定。pi (等電點)可通過在由聚丙烯酰胺、淀粉或瓊脂糖制成的固定化pH梯度凝膠上的等電聚焦來確定，或者通過從氨基酸序列中估算P〗、例如采用ExPASy服務(wù)器處的pi/MW工具(http: //expasy. otr/tools/pi tool, html ；Gasteiger 等人，2003)來測定。純化的重組CBHII/Cel6A酶以及內(nèi)部多肽的N-端可以根據(jù)Edman降解化學(Edman和Begg，1967)來測序，或者依照實施例I所述的方法或文獻中所介紹的其它方法例如通過使用程序 SignalP V3. O (Nielsen 等人，1997 ；Nielsen 和 Krogh, 1998 ；Bendtsen 等人，2004)從氨基酸序列中預(yù)測分泌信號序列的切割位點來測序。用語“全長”指從編碼DNA序列中翻譯的酶的形式，其以編碼氨基酸序列中的第一個蛋氨酸的ATG起始密碼子起始，并且終止于TGA、TAG或TAA終止密碼子。術(shù)語“成熟”指在去除信號序列(分泌信號肽或前肽)后含有酶活性或催化活性所需必須的氨基酸的酶的形式。對絲狀真菌而言，它是指例如作為信號序列的N-端處理和其他的N-端處理以及翻譯后的糖基化的結(jié)果而分泌到培養(yǎng)基中的形式。此外，成熟形式是指從融合構(gòu)建體中的載體蛋白中切割下來的酶。許多細菌及真菌纖維二糖水解酶以模塊化酶的方式制備(Srisodsuk等人，1993 ；Suurnakki等人，2000)。除了表達纖維素分解活性的催化或核心域外，這些酶還可能含有一個或多個纖維素結(jié)合域(CBD)，也稱為糖類結(jié)合域/模塊(CBD/CBM)，其可位于催化域的N-端或C-端。CBD具有糖類結(jié)合活性，它們調(diào)控纖維素酶與晶狀纖維之間的連接，但對于酶對可溶性底物的纖維素酶水解活性的影響很小或基本沒有影響。這兩個域通常通過一種靈活的和高度糖基化的連接橋或鉸鏈域連接，這一點從SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQID NO: 15和SEQ ID NO: 16的氨基酸序列中可以明顯看出。本發(fā)明所用的用語“片段”意指SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID N0:15 或SEQ ID NO: 16的全長多肽的N-端和/或C-端缺少一個或多個氨基酸殘基的多肽，例如多肽的成熟形式或多肽的其他酶活性部分。該片段仍然具有全長CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶所必要的催化活性或纖維二糖水解酶活性，以及基本上類似的特性如溫度和PH值依賴性和穩(wěn)定性及底物特異性。本發(fā)明所披露的SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID: 15和SEQ ID NO: 16中的多肽本身包含N-端CBD和連接橋。這些固有的連接橋或CBD區(qū)域例如可由來自木霉屬或毛殼菌的CBD取代。本發(fā)明的CBHII /Ce 16A酶在實際應(yīng)用中也可以沒有信號序列和/或CBD，或者信號序列和/或CBD也可以來自上述微生物或不同微生物的不同酶，或者以合成或重組的方式并入到上述酶的催化域中。本發(fā)明中所用的用語“一致性”意指在具有大約相同氨基酸數(shù)量的相應(yīng)序列區(qū)域內(nèi)相互比較的兩個氨基酸序列之間的一致性。例如，兩個氨基酸序列的全長或成熟序列可以比較一致性。此外，兩個氨基酸序列中的缺乏N-端CBD的 全長或成熟序列可以比較一致性。因此，例如包括CBD和/或信號序列的CBHII/Cel6A序列與缺乏這些元素的序列的比較不在本發(fā)明的范圍內(nèi)。全長序列的一致性可通過例如使用ClustalW比對法(例如見 WWW, ebi. ac. uk/Tools/Clustalw)米用如下矩陣進行測量BL0SUM, Gap open: 10, Gapextension:0. 5,或者使用Clone Manager程序(版本9)(美國Cary的科學和教育軟件),其包括功能“比較兩個序列/全球/比較作為氨基酸的序列/BL0SUM62打分矩陣”，如實施例I所述。待比較的兩個分子的氨基酸序列可能在一個或多個位置上不同，但這不會改變該分子的生物學功能或結(jié)構(gòu)。這種“變異體”可能會因為不同的宿主生物基體或突變體而在氨基酸序列中自然出現(xiàn)，例如作為同一株、種或?qū)賰?nèi)的等位基因變異體，或者它們可通過特異性變異實現(xiàn)。它們可能包括氨基酸序列中的一個或多個位置上的氨基酸的取代、刪除、合并或插入，但它們實質(zhì)上仍然以與SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID N0:15或SEQ IDNO: 16所定義的酶本質(zhì)上類似的方式發(fā)生作用，即它們含有具有纖維素分解活性的變異體。本發(fā)明涉及一種用于處理纖維素材料的方法，包括用CBHII/Cel6A多肽或含有所述多肽的酶組合物或者以綜合生物過程的方式來處理木質(zhì)纖維材料，該纖維素材料可以采用產(chǎn)生所述多肽的發(fā)酵微生物進行處理，其中CBHII/Cel6A多肽呈現(xiàn)出纖維二糖水解活性，并且含有與SEQ ID NO: 12的全長多肽至少具有76%—致性，與SEQ ID NO: 14的全長多肽至少具有76% —致性，與SEQ ID NO: 15的全長多肽至少具有95% —致性，或者與SEQ IDNO: 16的全長多肽至少具有91% —致性的氨基酸序列，或者是具有類似特性的其片段或變異體。所述酶能夠在中到高溫條件下水解纖維素材料，包括木質(zhì)纖維素。所述方法包括以下步驟i)制備本發(fā)明的CBHII/Cel6A多肽或含有所述多肽的酶組合物或產(chǎn)生所述多肽的發(fā)酵微生物；ii)將纖維素材料與本發(fā)明的CBHII/Cel6A多肽或含有所述多肽的酶組合物或產(chǎn)生所述多肽的發(fā)酵微生物反應(yīng)；以及iii)獲得部分或完全水解的纖維素材料，包括水解的木質(zhì)纖維材料。用于處理或水解纖維素材料的CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶的酶“可以得自于”任何一種包括植物在內(nèi)的生物機體。CBHII/Ce16A酶優(yōu)選源于例如細菌或真菌類的微生物。細菌可以例如選自芽孢桿菌、固氮螺菌屬、鏈霉菌和假單胞菌屬。更為優(yōu)選的是，酶源自真菌(包括絲狀真菌和酵母菌)，例如源自基因，其選自裂殖酵母、克魯維酵母菌屬、畢赤酵母屬、酵母屬、假絲酵母和耶氏酵母，或絲狀真菌毛殼菌、枝頂孢酶、曲霉、短梗霉、葡萄孢菌、毛殼菌屬、金孢霉屬、隱球菌、金錢菌屬、木蹄層孔菌、鐮刀酶、腐殖霉屬、肉座菌屬、香菇屬、稻痕菌、白絲菌、毛霉菌、毀絲霉屬、團絲核菌、厭氣性真菌(Neocallimastix)、粗糙脈孢、擬青霉、青霉、黃孢原毛平革菌、射脈菌屬、側(cè)耳菌屬、糞殼菌、多孔菌、密孔菌屬、絲核菌屬、裂褶菌、小柱孢屬、籃狀菌、嗜熱子囊菌、梭孢殼菌屬、白腐菌或木霉屬。CBHII/Cel6A酶優(yōu)選源自嗜熱枝頂孢霉、黑果白絲菌、嗜熱毛殼菌或埃默森籃狀菌。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例，酶可以得自于作為CBS 116240保藏的且目前被歸類為嗜熱枝頂孢霉的絲狀真菌株ALK04245、作為CBS 685. 95保藏的黑果白絲菌株ALK04237、埃默森籃狀菌株DSM 2432 (申請人的菌種保藏編號為RF8069)或作為CBS730. 95保藏的嗜熱毛殼菌株ALK04237。本發(fā)明的CBHII/Ce16A纖維二糖水解酶被標記為At_ALK04245_Cel6A、Ma_ALK04237_Cel6A、Ct_ALK04265_Cel6A 和 Te_RF8069_Cel6A，CBHII/Ce16A 纖維二糖水解酶源于嗜熱枝頂孢霉CBS 116240株、黑果白絲菌CBS 685. 95株、嗜熱毛殼菌CBS 730. 95株或埃默森籃狀菌株DSM 2432株以及糖苷水解酶家族6的成員。表I :本發(fā)明的CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶
權(quán)利要求
1.一種采用CBHII/Cel6A多肽或含有所述多肽的酶制劑來處理纖維素材料的方法，其中所述CBHII/Cel6A多肽具有纖維二糖水解酶活性，并且含有與SEQ ID NO: 12的全長多肽具有至少76%的一致性，與SEQ ID NO: 14的全長多肽具有至少76%的一致性，與SEQ IDNO: 15的全長多肽具有至少95%的一致性，或者與SEQ ID NO: 16的全長多肽具有至少91%的一致性的氨基酸序列，或者是具有類似特性的所述氨基酸序列的片段或變異體，所述方法包括以下步驟 i)制備所述CBHII/Cel6A多肽或者含有所述多肽的酶制劑或者產(chǎn)生所述多肽的發(fā)酵微生物； )使纖維素材料與所述CBHII/Cel6A多肽或者含有所述多肽的酶制劑或者產(chǎn)生所述多肽的發(fā)酵微生物反應(yīng)；以及 iii)獲得部分或完全水解的纖維素材料。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述CBHII/Cel6A多肽源自于枝頂孢霉屬、黑果屬、毛殼菌屬或籃狀菌屬，更優(yōu)選地源自于嗜熱枝頂孢霉、黑果白絲菌、嗜熱毛殼菌或埃默森籃狀菌，最優(yōu)選地源自于保藏菌株嗜熱枝頂孢霉CBS 116240、黑果白絲菌CBS685. 95、嗜熱毛殼菌CBS 730. 95或埃默森籃狀菌DSM 2432。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述CBHII/Cel6A多肽具有SEQIDNO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 或 SEQ ID NO: 16 的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求I到3中任意一項所述的方法，其特征在于所述CBHII/Cel6A多肽能夠在中溫到高溫下水解纖維素材料。
5.根據(jù)權(quán)利要求I到4中任意一項所述的方法，其特征在于所述纖維素材料用酶組合物來處理，所述酶組合物包括一種或多種所述CBHII/Cel6A多肽以及至少一種能夠水解所述纖維素材料的其它的酶，所述其它的酶選自纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、β -葡萄糖苷酶、β -葡聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、β -木糖苷酶、甘露聚糖酶、β -甘露糖苷酶、α -葡萄糖苷酸酶、乙?；揪厶酋ッ?、α -阿拉伯呋喃糖苷酶、α _半乳糖苷酶、果膠酶、內(nèi)切a -L-阿拉伯糖酶和外切a -L-阿拉伯糖酶、α -半乳糖苷酶、內(nèi)切半乳糖醛酸酶和外切半乳糖醛酸酶、內(nèi)切果膠裂解酶、果膠酸鹽裂解酶和果膠(甲)酯酶、苯酚酯酶、包括過木質(zhì)素過氧化物酶的木質(zhì)酶、錳過氧化物酶、H2O2-生成酶以及有介體或無介體的漆酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述酶同時地或者按順序地加入到纖維素材料中。
7.根據(jù)權(quán)利要求I到6中任意一項所述的方法，其特征在于所述纖維素材料選自植物材料、農(nóng)業(yè)生物質(zhì)、廢棄產(chǎn)品和專用能源作物。
8.根據(jù)權(quán)利要求I到7中任意一項所述的方法，其特征在于所述CBHII/Cel6A多肽適用于制備生物燃料。
9.根據(jù)權(quán)利要求I到8中任意一項所述的方法，其特征在于所述CBHII/Cel6A多肽源自嗜熱枝頂孢霉CBS 116240，并且具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。
10.一種真菌CBHII/Cel6A多肽，其中所述多肽具有纖維二糖水解酶活性，并且含有與SEQ ID NO: 12的全長多肽具有至少76%的一致性，與SEQ ID NO: 14的全長多肽具有至少76%的一致性，與SEQ ID NO: 15的全長多肽具有至少95%的一致性，或者與SEQ ID NO: 16的全長多肽具有至少的91% —致性的氨基酸序列，或者是具有類似特性的所述氨基酸序列的片段或變異體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽源自于枝頂孢霉屬、黑果屬、毛殼菌屬或籃狀菌屬中獲得，更優(yōu)選地源自于嗜熱枝頂孢霉、黑果白絲菌、嗜熱毛殼菌或埃默森籃狀菌，最優(yōu)選地源自于保藏菌株嗜熱枝頂孢霉CBS116240、黑果白絲菌CBS 685. 95、嗜熱毛殼菌CBS 730. 95或埃默森籃狀菌DSM 2432。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽具有SEQID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 或 SEQ ID NO: 16 的氨基酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求10到12中任意一項所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽能夠在中溫到高溫條件下水解纖維素材料。
14.根據(jù)權(quán)利要求10到13中任意一項所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽由分離純化的核酸分子編碼，所述核酸分子含有多聚核苷酸序列，所述多聚核苷酸序列編碼的多肽，所述多肽含有 SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:15 或 SEQ ID NO: 16的氨基酸序列，或者與SEQ ID NO: 12的全長多肽具有至少76%的一致性、與SEQ ID NO: 14具有至少76%的一致性、與SEQ ID NO: 15具有至少的95% —致性、或者與SEQ ID NO: 16具有至少91%的一致性的氨基酸序列，或者是具有類似特性的其片段或變異體。
15.根據(jù)權(quán)利要求10到14中任意一項所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽由分離純化的核酸分子編碼，所述分離純化的核酸分子包括SEQ ID NO: 11、SEQIDNO: 13、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 10或其子序列所包含的多聚核苷酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求10到15中任意一項所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽由分離純化的核酸分子編碼，所述分離純化的核酸分子在嚴謹?shù)臈l件下雜交到SEQ IDNO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO:7 或 SEQID NO:8 或其子序列所包含的多聚核苷酸序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求10到16中任意一項所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽由包括SEQ ID NO: 11所包含的多聚核苷酸序列的分尚純化的核酸分子編碼。
18.根據(jù)權(quán)利要求10到17中任意一項所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽由位于登記號為DSM 22946的大腸桿菌內(nèi)的質(zhì)粒pALK2582、位于登記號為DSM22945的大腸桿菌內(nèi)的質(zhì)粒PALK2581、位于登記號為DSM 22947的大腸桿菌內(nèi)的質(zhì)粒pALK2904或位于登記號為DSM 23185的大腸桿菌內(nèi)的質(zhì)粒pALK 3006所包含的多聚核苷酸序列編碼。
19.根據(jù)權(quán)利要求10到18中任意一項所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽由含有核酸分子的重組表達載體來制備，所述核酸分子包括可操作地連接到能夠在合適宿主中直接表達編碼核酸分子的CBHII/Cel6A的調(diào)控序列上的根據(jù)權(quán)利要求9到18中任意一項所述的CBHII/Cel6A酶的多聚核苷酸序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求10到19中任意一項所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽來自異源宿主，優(yōu)選來自微生物宿主。
21.根據(jù)權(quán)利要求10到20中任意一項所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽來自木霉屬、曲霉屬、鐮刀霉屬、腐質(zhì)霉屬、金孢霉屬、脈孢菌屬、根霉屬、青霉屬或被孢酶屬。
22.根據(jù)權(quán)利要求10到21中任意一項所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述多肽來自木霉屬或曲霉屬，優(yōu)選來自里氏木霉。
23.根據(jù)權(quán)利要求10到22中任意一項所述的CBHII/Cel6A多肽，其特征在于所述CBHII/Ce16A多肽源自嗜熱枝頂孢霉CBS 116240，并且具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。
24.一種分離純化的核酸分子，含有編碼真菌CBHII/Cel6A多肽的多聚核苷酸序列，其選自 (a)一種核酸分子，其包括編碼多肽的多聚核苷酸序列，所述多肽具有纖維二糖水解酶活性，并含有如 SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15 或 SEQ ID NO: 16 所列的全長氨基酸序列，或者具有類似特性的其片段或變異體。
(b)一種核酸分子，其包括編碼多肽的多聚核苷酸序列，所述多肽具有纖維二糖水解酶活性，并且與SEQ ID NO: 12的全長氨基酸序列具有至少76%的一致性，與SEQ IDNO: 14的全長氨基酸序列具有至少76%的一致性，與SEQ ID NO: 15的全長氨基酸序列具有至少95%的一致性，或者與SEQ ID NO: 16的全長氨基酸序列具有至少91%的一致性，或者是具有類似特性的其片段或變異體。
(c)一種核酸分子，其含有如 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID N0:9 或 SEQ IDNO: 10所列的多聚核苷酸序列的編碼序列； (d)一種核酸分子，其含有DSM 22946、DSM 22945、DSM 22947或DSM 23185所包含的多聚核苷酸序列的編碼序列； (e)一種核酸分子，其編碼序列由于遺傳密碼的降解而與(c) (d)中任意一種核酸分子的編碼序列不同；以及 (f)一種在嚴謹條件下雜交到DSM 22946,DSM 22945,DSM 22947或DSM 23185所包含的核酸分子上的核酸分子，所述核酸分子編碼多肽，所述多肽具有纖維二糖水解酶活性，并且具有與SEQ ID NO: 12的全長氨基酸序列具有至少76%的一致性，與SEQID NO: 14的全長氨基酸序列具有至少76%的一致性，與SEQ ID NO: 15的全長氨基酸序列具有至少95%的一致性，或者與SEQ ID NO: 16的全長氨基酸序列具有至少91%的一致性的氨基酸序列，或者是具有類似特性的其片段或變異體。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的核酸分子，其特征在于編碼核酸分子的所述CBHII/Cel6A116240源自嗜熱枝頂孢霉CBS 116240，并具有SEQ ID N0:11的氨基酸序列。
26.一種重組表達載體，含有操作性鏈接到能夠在合適的宿主中直接表達所述CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶基因并產(chǎn)生所述CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶的調(diào)控序列上的根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的核酸分子。
27.—種含有根據(jù)權(quán)利要求26所述的重組表達載體的宿主細胞。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的宿主細胞，其特征在于所述宿主為微生物宿主。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的宿主細胞，其特征在于所述宿主為絲狀真菌。
30.根據(jù)權(quán)利要求27到29中任意一項所述的宿主細胞，其特征在于所述宿主為木霉屬、曲霉屬、鐮刀霉屬、腐質(zhì)霉屬、金孢霉屬、脈孢菌屬、根霉屬、青霉屬或被孢酶屬。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的宿主細胞，其特征在于所述宿主為木霉屬或曲霉屬，優(yōu)選為里氏木霉。
32.根據(jù)權(quán)利要求27到29中任意一項所述的宿主細胞，其特征在于所述宿主為發(fā)酵微生物。
33.一種制造具有纖維二糖水解酶活性的多肽的方法，所述方法包括步驟培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求27到32中任意一項所述的宿主細胞，以及收集所述多肽。
34.一種由根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的核酸序列編碼并且其能夠通過根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法獲得的具有纖維二糖水解酶活性的多肽。
35.一種用于獲得酶制劑的方法，包括步驟培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求27到32中任意一項所述的宿主細胞，以及制備全營養(yǎng)培養(yǎng)肉湯，或者從用過的培養(yǎng)基中分離出所述細胞，以及獲得上清液。
36.一種根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法獲得的酶制劑。
37.一種酶制劑，包括根據(jù)權(quán)利要求10到23中任意一項所述的CBHII/Cel6A酶。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的酶制劑，其特征在于所述CBHII/Cel6A纖維二糖水解酶源自源嗜熱枝頂孢霉，并且具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。
39.根據(jù)權(quán)利要求36到38中任意一項所述的酶制劑，其特征在于所述制劑包括其他的酶，所述其他的酶選自纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶、葡萄糖苷酶、葡聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、α-葡萄糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酯酶、α -阿拉伯呋喃糖苷酶、α -半乳糖苷酶、果膠酶、內(nèi)切a -L-阿拉伯糖酶和外切a-L-阿拉伯糖酶、α-半乳糖苷酶、內(nèi)切半乳糖醛酸酶和外切半乳糖醛酸酶、內(nèi)切果膠裂解酶、果膠酸鹽裂解酶和果膠(甲)酯酶、苯酚酯酶、包括過木質(zhì)素過氧化物酶的木質(zhì)酶、錳過氧化物酶、H2O2-生成酶以及有介體或無介體的漆酶。
40.根據(jù)權(quán)利要求36到39中任意一項所述的酶制劑，其特征在于所述酶制劑以全營養(yǎng)培養(yǎng)肉湯、用過的培養(yǎng)基、液體、粉末或者顆粒的形式存在。
41.根據(jù)權(quán)利要求10到23中任意一項所述的CBHII/Cel6A多肽或者根據(jù)權(quán)利要求36到40中任意一項所述的酶制劑在制備生物燃料、洗滌劑、處理纖維、處理食物或飼料、紙漿和紙、飲料或任何涉及纖維素材料水解或改性的用途中的應(yīng)用。
42.根據(jù)權(quán)利要求10到23中任意一項所述的CBHII/Cel6A多肽或者根據(jù)權(quán)利要求36到40中任意一項所述的酶制劑在制備生物燃料中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從纖維素材料中生產(chǎn)糖類水解物的方法。該方法例如可用于從木質(zhì)纖維材料制備供生產(chǎn)生物乙醇所用的可發(fā)酵糖。本發(fā)明描述了源自嗜熱枝頂孢霉、黑果白絲菌、嗜熱毛殼菌或埃默森籃狀菌這四種絲狀真菌的纖維素酶，通過重組技術(shù)獲得的其酶制劑，以及所述的酶和酶制劑的應(yīng)用。
文檔編號C12N9/42GK102712917SQ201080060251
公開日2012年10月3日 申請日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月30日
發(fā)明者亞里·韋赫曼佩雷, 特瑞·普拉能, 紹利·托伊卡, 金·朗法德 申請人:羅爾公司