專利名稱：使用多羥基鏈烷酸酯合酶突變體制備乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠使用乳酰輔酶A(Iactyl-CoA)作為底物合成乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的多種多羥基鏈烷酸酯合酶的突變體。而且，本發(fā)明還涉及一種使用多羥基鏈烷酸酯合酶的突變體制備乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的方法，所述多羥基鏈烷酸酯合酶的突變體具有提高的合成乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的活性。
背景技術(shù)：
聚乳酸酯(PLA)是一種源自乳酸酯的常見(jiàn)生物可降解的聚合物，其非常適合作為用于醫(yī)學(xué)用途或一般用途的聚合物。目前，PLA由微生物發(fā)酵制得的乳酸酯的聚合來(lái)制備， 但是，這種乳酸酯的直接聚合只能制備具有低分子量(1000 5000道爾頓)的PLA。有一種使用鏈偶聯(lián)劑由乳酸酯的直接聚合制得的低分子量PLA聚合得到高分子量PLA的方法， 以合成具有至少100，000道爾頓的PLA。但是，上述方法的缺點(diǎn)在于，加入有機(jī)溶劑和鏈偶聯(lián)劑使工藝更復(fù)雜，并且有機(jī)溶劑和鏈偶聯(lián)劑還難以去除。作為目前商業(yè)化的制備高分子量PLA的方法，有一種在將乳酸酯轉(zhuǎn)化為丙交酯之后通過(guò)該丙交酯環(huán)的開(kāi)環(huán)縮合反應(yīng)來(lái)合成PLA的方法。當(dāng)通過(guò)化學(xué)合成由乳酸酯合成PLA時(shí)，可以容易地制得PLA均聚物，但是，具有多種單體組成的PLA共聚物的合成是困難的，且具有非常低的工業(yè)效率。同時(shí)，多羥基鏈烷酸酯(PHA)是一種在碳源過(guò)量但如磷、氮、鎂和氧等其它營(yíng)養(yǎng)物缺乏時(shí)，在微生物中作為能量或碳源儲(chǔ)存物質(zhì)積聚的聚酯。由于PHA與來(lái)源于常規(guī)石油的合成聚合物具有相似的物理性能，所以PHA被公認(rèn)作為常規(guī)合成塑料的替代材料。為了在微生物中制備PHA，需要將微生物的代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為PHA單體的酶和利用 PHA單體合成PHA聚合物的PHA合酶。另外，為了使用微生物合成PLA和PLA共聚物，需要該相同的體系，并且除了能夠提供羥酰輔酶A的酶之外還需要一種能夠另外提供乳酰輔酶 A的酶，所述羥酰輔酶A是原始PHA合酶的底物。即，這說(shuō)明為了使用微生物有效地制備PLA和PLA共聚物，通過(guò)表達(dá)活化的類型而不抑制細(xì)胞生長(zhǎng)來(lái)引入能夠平穩(wěn)地提供乳酰輔酶A的單體供給酶，以及能夠有效地識(shí)別乳酰輔酶A作為底物的PHA合酶是非常重要的。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明人研究了與來(lái)源于假單胞菌(Pseudomonas sp. ) 6-19、已經(jīng)被用于常規(guī)體系的多羥基鏈烷酸酯合酶具有高度氨基酸序列同源性的多羥基鏈烷酸酯合酶。于是， 本發(fā)明人證明，乳酸酯聚合物和其共聚物可以通過(guò)如下方法高效率地制得在具有高度同源性的合酶中從四個(gè)典型的假單胞菌O^eudomonas)菌株克隆多羥基鏈烷酸酯合酶，然后制備改變能夠影響乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的合成活性的氨基酸序列的突變體。因此，基于上述事實(shí)完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種能夠利用多種多羥基鏈烷酸酯合酶的突變體產(chǎn)生乳酸酯聚合物或其共聚物的重組微生物和一種使用該重組微生物制備乳酸酯聚合物或其共聚物的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種使用乳酰輔酶A作為底物合成乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的多羥基鏈烷酸酯合酶的突變體，其中所述突變體具有在以SEQ ID NO 2, 4、6或8表示的多羥基鏈烷酸酯合酶的氨基酸序列中包含選自以下的至少一種突變的氨基酸序列a)E130D 和 Q481K ；b)E130D、S325T 和 Q481K ；c)E130D、S477F 和 Q481K ；d)E130D、S325T、S477F 和 Q481K ；和e)E130D、S325T、S477G 和 Q481K。此外，本發(fā)明提供一種編碼多羥基鏈烷酸酯合酶的突變體的基因，一種含有該基因的用于合成乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的重組載體，一種用該重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體和一種包括對(duì)該轉(zhuǎn)化體進(jìn)行培養(yǎng)的制備乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的方法。有益效果根據(jù)本發(fā)明的所有多羥基鏈烷酸酯合酶通過(guò)影響合成乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的活性的氨基酸序列突變可以具有合成乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的活性，然后當(dāng)使用合酶的突變體時(shí)，可以分別產(chǎn)生具有不同特征的乳酸酯共聚物。


圖1顯示構(gòu)建重組表達(dá)載體的過(guò)程的圖，該重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的具有與來(lái)源于假單胞菌MBEL 6-19的多羥基鏈烷酸酯合酶高度氨基酸序列同源性的II型多羥基鏈烷酸酯合酶、來(lái)源于丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶突變體 (Pct540Cp)和具有提高合成乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的活性、來(lái)自所述重組表達(dá)載體的多羥基鏈烷酸酯合酶的突變體；和圖2顯示以下的氨基酸序列的多重比對(duì)來(lái)源于用于本發(fā)明的假單胞菌MBEL 6-19的多羥基鏈烷酸酯合酶、來(lái)源于綠針假單胞菌O^seudomonaschlororaphis)的多羥基鏈烷酸酯合酶、來(lái)源于惡臭假單胞菌O^seudomonasputidEOKTM^的多羥基鏈烷酸酯合酶、來(lái)源于食樹(shù)脂假單胞菌O^seudomonasresinovorans)的多羥基鏈烷酸酯合酶和來(lái)源于綠膿假單胞菌G^seudomonasaeruginosEOPAOl的多羥基鏈烷酸酯合酶，其中被推測(cè)為催化殘基的氨基酸殘基(Cyd96、Asp451和His479)以“*”標(biāo)記，使底物特異性改變?yōu)槿轷］o酶 A的氨基酸殘基(Glul30、Ser325、kr477和Gln481)分別以氨基酸序列中的編號(hào)標(biāo)記。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過(guò)同時(shí)包含乳酰輔酶A供給酶基因和來(lái)源于綠針假單胞菌的多羥基鏈烷酸酯合酶基因(SEQ ID NO :1)、來(lái)源于惡臭假單胞菌KTM40的多羥基鏈烷酸酯合酶基因 (SEQ ID NO :3)、來(lái)源于食樹(shù)脂假單胞菌的羥基鏈烷酸酯合酶基因(SEQ ID NO :5)或來(lái)源于綠膿假單胞菌PAOl的多羥基鏈烷酸酯合酶基因(SEQ ID NO :7)，提供一種具有產(chǎn)生乳酸酯聚合物及其共聚物的能力的重組微生物。本發(fā)明提供一種使用乳酰輔酶A作為底物合成乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的多羥基鏈烷酸酯合酶的突變體，其中所述突變體具有在以SEQ ID N0:2、4、6或8表示的多羥基鏈烷酸酯合酶的氨基酸序列中包含選自以下的至少一種的氨基酸序列a)E130D 和 Q481K ；b) E130D、S325T 和 Q481K ；c)E130D、S477F 和 Q481K ；d)E130D、S325T、S477F 和 Q481K ；和e) E130D、S325T、S477G 和 Q481K。E130D突變是指第130個(gè)氨基酸谷氨酸被天門冬氨酸置換；S325T突變是指第325 個(gè)氨基酸絲氨酸被蘇氨酸置換；S477F突變是指第477個(gè)氨基酸絲氨酸被苯丙氨酸置換； Q481K突變是指第481個(gè)氨基酸谷氨酰胺被賴氨酸置換；S477G突變是指第477個(gè)氨基酸絲氨酸被甘氨酸置換。由于氨基酸序列中的上述突變，利用多羥基鏈烷酸酯合酶的突變體產(chǎn)生乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的活性可以新形成或提高。SEQ ID NO :2、4、6和8的氨基酸序列分別是指來(lái)源于綠針假單胞菌的多羥基鏈烷酸酯合酶的氨基酸序列、來(lái)源于惡臭假單胞菌KTM40的多羥基鏈烷酸酯合酶的氨基酸序列、來(lái)源于食樹(shù)脂假單胞菌的羥基鏈烷酸酯合酶的氨基酸序列和來(lái)源于綠膿假單胞菌PAOl 的多羥基鏈烷酸酯合酶的氨基酸序列。本發(fā)明人證明當(dāng)使用來(lái)源于上述四種假單胞菌菌株的PHA合酶的突變體時(shí)，使用乳酰輔酶A作為底物可以以高效率產(chǎn)生乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物。因此，基于上述事實(shí)完成了本發(fā)明。另外，本發(fā)明提供編碼多羥基鏈烷酸酯合酶的突變體的基因。此外，本發(fā)明提供一種包含這些基因的用于合成乳酸酯聚合物或共聚物的重組載體。而且，對(duì)于本發(fā)明，所述重組載體還包括SEQ ID NO :77的來(lái)源于丙酸梭菌 (pctCp)的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因。所述丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶是一種分別將乳酸酯和3-羥基丁酸酯轉(zhuǎn)化為乳酰輔酶A和3-羥基丁酸酯輔酶A的酶。優(yōu)選地，所述丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因可以包括丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的突變基因，該突變基因包含選自以下的至少一種突變a)在SEQ ID NO 77堿基序列中的A1200G突變；b)在 SEQ ID NO :77 堿基序列中的 T78C、T669C、A1125G 和 T1158C 突變；c)在SEQ ID NO 78氨基酸序列中的Gly335Asp突變和在SEQ ID NO 77堿基序列中的A1200G突變；d)在SEQ ID NO :78氨基酸序列中的Ala243Thr突變和在SEQ ID NO 77堿基序列中的A1200G突變；e)在SEQ ID NO 78氨基酸序列中的Asp65Gly突變和在SEQ ID NO 77堿基序列中的 T669C、A1125G 和 T1158C 突變；f)在SEQ ID NO :78氨基酸序列中的Asp257Asn突變和在SEQ ID NO 77堿基序列中的A1200G突變；g)在SEQ ID NO 78氨基酸序列中的Asp65Asn突變和在SEQ ID NO 77堿基序列中的 T699C、A1125G 和 T1158C 突變；ti)在SEQ ID NO :78氨基酸序列中的Thrl99Ile突變和在SEQ ID NO 77堿基序列中的T699C、A1125G和T1159C突變；和i)在SEQ ID N0:78氨基酸序列中的Vall93Ala突變和在SEQ ID NO 77堿基序列中的T78C、T699C和T1158C突變。在SEQ ID NO 77堿基序列中，A1200G突變是指第1200個(gè)堿基腺嘌呤被鳥(niǎo)嘌呤置換的突變；T78C突變是指第78個(gè)堿基胸腺嘧啶被胞嘧啶置換的突變；T669C突變是指第 669個(gè)堿基胸腺嘧啶被胞嘧啶置換的突變；A1125G突變是指第1125個(gè)堿基腺嘌呤被鳥(niǎo)嘌呤置換的突變；T1158C突變是指第1158個(gè)堿基胸腺嘧啶被胞嘧啶置換的突變。在SEQ ID NO 78氨基酸序列中，Gly335Asp突變是指第335個(gè)氨基酸甘氨酸被天門冬氨酸置換的突變；Ald43Thr突變是指第243個(gè)氨基酸丙氨酸被蘇氨酸置換的突變；Asp65Gly突變是指第65個(gè)氨基酸天門冬氨酸被甘氨酸置換的突變；Asp257Asn突變是指第257個(gè)氨基酸天門冬氨酸被天門冬酰胺置換的突變；Asp65Asn突變是指第65個(gè)氨基酸天門冬氨酸被天門冬酰胺置換的突變；Thrl99Ile突變是指第199個(gè)氨基酸蘇氨酸被異亮氨酸置換的突變； Vall93Ala突變是指第193個(gè)氨基酸纈氨酸被丙氨酸置換的突變。優(yōu)選地，丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的突變基因可以是包括SEQ ID NO 78氨基酸序列中的 Vall93Ala突變和SEQ ID NO :77堿基序列中的T78C、T699C和T1158C突變的丙酰輔酶A 轉(zhuǎn)移酶(pet 540Cp)的突變基因。此外，本發(fā)明提供一種用所述重組載體中的任何一個(gè)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體，通過(guò)使用上述重組載體中的任何一個(gè)對(duì)沒(méi)有丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化而得到的轉(zhuǎn)化體包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)?？梢圆捎贸Ｒ?guī)方法將根據(jù)本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化到適合的宿主細(xì)胞中。細(xì)菌、酵母和真菌等可以用作宿主細(xì)胞，但本發(fā)明不限于此。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，且優(yōu)選是大腸桿菌。適合的原核細(xì)胞的實(shí)例包括大腸桿菌Dffia、大腸桿菌JM101、大腸桿菌K12四4、大腸桿菌W3110、大腸桿菌X1776、大腸桿菌XL-IBlue (Stratagene)和大腸桿菌B等。但是，也可以使用例如FMB101、匪522、匪538和匪539的大腸桿菌菌株以及其它種和屬的原核細(xì)胞。除了上述大腸桿菌之外，農(nóng)桿菌屬菌株，例如農(nóng)桿菌A4，桿菌屬， 例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，腸桿菌屬，例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)或粘質(zhì)沙雷菌(Serratia marcescens)，以及各種假單胞菌屬菌株可以用作宿主細(xì)胞，但本發(fā)明不限于此?？捎糜诒景l(fā)明的用于轉(zhuǎn)化的目標(biāo)植物可以是煙草、番茄、辣椒、豆、水稻和玉米等， 但本發(fā)明不限于此。此外，盡管用于轉(zhuǎn)化的植物是有性繁殖的植物，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解，所述植物可以通過(guò)組織培養(yǎng)等而被無(wú)性地重復(fù)繁殖。另外，本發(fā)明提供一種制備乳酸酯聚合物或其共聚物的方法，該方法包括培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供一種制備乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的方法，其中所述培養(yǎng)在含有羥基鏈烷酸酯的環(huán)境下進(jìn)行，且所制得的共聚物是羥基鏈烷酸酯-Co-3-乳酸酯，該羥基鏈烷酸酯-Co-3-乳酸酯是包含羥基鏈烷酸酯單體單元和乳酸酯單體單元的共聚物。
7
在本發(fā)明中，所述共聚物是指具有兩種類型的單體的二元共聚物，具有三種類型的單體的三元共聚物和具有四種類型的單體的四元共聚物等。在本發(fā)明中，所述羥基鏈烷酸酯可以是選自以下化合物中的至少一種3-羥基丁酸酯、3-羥基戊酸酯、4-羥基丁酸酯、含有6 14個(gè)碳原子的中鏈長(zhǎng)(D)-3-羥基羧酸、
3-羥基丙酸、3-羥基己酸、3-羥基庚酸、3-羥基辛酸、3-羥基壬酸、3-羥基癸酸、3-羥基十一烷酸、3-羥基十二烷酸、3-羥基十四烷酸、3-羥基十六烷酸、4-羥基戊酸、4-羥基己酸、
4-羥基庚酸、4-羥基辛酸、4-羥基癸酸、5-羥基戊酸、5-羥基己酸、6-羥基十二烷酸、3-羥基-4-戊烯酸、3-羥基-4-反式-己烯酸、3-羥基-4-順式-己烯酸、3-羥基-5-己烯酸、 3-羥基-6-反式-辛烯酸、3-羥基-6-順式-辛烯酸、3-羥基-7-辛烯酸、3-羥基-8-壬烯酸、3-羥基-9-癸烯酸、3-羥基-5-順式-十二碳烯酸、3-羥基-6-順式-十二碳烯酸、3-羥基-5-順式-十四碳烯酸、3-羥基-7-順式-十四碳烯酸、3-羥基-5，8-順式-順式-十四碳烯酸、3-羥基-4-甲基戊酸、3-羥基-4-甲基己酸、3-羥基-5-甲基己酸、3-羥基-6-甲基已酸、3-羥基-4-甲基辛酸、3-羥基-5-甲基辛酸、3-羥基-6-甲基辛酸、3-羥基-7-甲基辛酸、3-羥基-6-甲基壬酸、3-羥基-7-甲基壬酸、3-羥基-8-甲基壬酸、3-羥基-7-甲基癸酸、3-羥基-9-甲基癸酸、3-羥基-7-甲基-6-辛烯酸、蘋果酸、3-羥基琥珀酸甲酯、3-羥基己二酸甲酯、3-羥基辛二酸甲酯、3-羥基壬二酸甲酯、3-羥基癸二酸甲酯、3-羥基辛二酸乙酯、3-羥基癸二酸乙酯、3-羥基庚二酸丙酯、3-羥基癸二酸芐酯、3-羥基-8-乙酰氧基辛酸、3-羥基-9-乙酰氧基壬酸、苯氧基-3-羥基丁酸、苯氧基-3-羥基戊酸、苯氧基-3-羥基庚酸、苯氧基-3-羥基辛酸、對(duì)氰基苯氧基-3-羥基丁酸、對(duì)氰基苯氧基-3-羥基戊酸、對(duì)氰基苯氧基-3-羥基己酸、對(duì)硝基苯氧基-3-羥基己酸、3-羥基-5-苯基戊酸、3-羥基-5-環(huán)己基丁酸、3，12-二羥基十二烷酸、3，8_ 二羥基-5-順式-十四碳烯酸、3-羥基-4，5-環(huán)氧癸酸、3-羥基-6，7-環(huán)氧十二烷酸、3-羥基-8，9-環(huán)氧-5，6-順式-十四烷酸、7-氰基-3-羥基庚酸、9-氰基-3-羥基庚酸、3-羥基-7-氟庚酸、3-羥基-9-氟壬酸、3-羥基-6-氯己酸、3-羥基-8-氯辛酸、3-羥基-6-溴己酸、3-羥基-8-溴辛酸、3-羥基-11-溴十一烷酸、 3-羥基-2- 丁烯酸、6-羥基-3-十二碳烯酸、3-羥基-2-甲基丁酸、3-羥基-2-甲基戊酸和3-羥基2，6-二甲基-5-庚烯酸。對(duì)于本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“載體”是指一種能夠在宿主內(nèi)表達(dá)DNA的DNA構(gòu)建體，該DNA構(gòu)建體包含可操作地連接至適合的控制序列的DNA序列。載體可以是質(zhì)粒、噬菌?；蛘咧皇菨撛诘幕蚪M插入物。當(dāng)載體被轉(zhuǎn)化到適合的宿主中時(shí)，它可以被復(fù)制或起作用而不管宿主基因組，或者在一些情況中，它可以被整合到基因組本身中。質(zhì)粒是最常被用作載體的類型，所以本發(fā)明中質(zhì)粒和載體有時(shí)可替換地使用。然而，本發(fā)明還包括其它類型的載體，該載體具有與本領(lǐng)域已知或?qū)⒁赖墓δ芟嗤墓δ?。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)控制序列”是指對(duì)可操作地連接的編碼序列在特定宿主生物體中的表達(dá)必要的DNA序列。所述控制序列包括用于進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、用于控制轉(zhuǎn)錄的任何操縱子序列、用于編碼適合的mRNA核糖體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列和用于控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止的序列。例如，適合于原核細(xì)胞的控制序列包括啟動(dòng)子、任何操縱子序列和核糖體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在真核細(xì)胞中，所述控制序列包括啟動(dòng)子、多腺苷酸化信號(hào)和增強(qiáng)子。啟動(dòng)子是對(duì)基因在質(zhì)粒中的表達(dá)具有最大影響的因素。因此，SRa啟動(dòng)子或源自巨噬細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子等優(yōu)選用作高表達(dá)啟動(dòng)子。
為了表達(dá)本發(fā)明的DNA序列，各種表達(dá)控制序列中的任一種可以用作載體?？捎玫谋磉_(dá)控制序列的實(shí)例包括，例如，SV40或腺病毒的早期啟動(dòng)子和后期啟動(dòng)子、Iac系統(tǒng)、 trp系統(tǒng)、TAC或TRC系統(tǒng)、T3和T7啟動(dòng)子、噬菌體λ的主要操縱子和啟動(dòng)子區(qū)域、fd編碼蛋白的控制區(qū)域、3-磷酸甘油酸酯激酶的啟動(dòng)子或其它二醇降解酶的啟動(dòng)子、磷酸酶的啟動(dòng)子(例如Wio5)、酵母α-交配體系的啟動(dòng)子、已知用于控制原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒的基因表達(dá)的用于誘導(dǎo)和構(gòu)建的其它序列、以及上述的各種組合。當(dāng)核酸與其它核酸序列以功能關(guān)系排列時(shí)，核酸被可操作地連接。當(dāng)適當(dāng)?shù)姆肿?(例如轉(zhuǎn)錄激活蛋白)與控制序列連接時(shí)，基因和控制序列可以以允許基因表達(dá)的方式連接。例如，當(dāng)表達(dá)參與多肽分泌的前體蛋白時(shí)，前體序列或分泌前導(dǎo)區(qū)的DNA與多肽的DNA 可操作地連接；當(dāng)影響序列的轉(zhuǎn)錄時(shí)，啟動(dòng)子或增強(qiáng)子與編碼序列可操作地連接；當(dāng)影響序列的轉(zhuǎn)錄時(shí)，核糖體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與編碼序列可操作地連接；或者當(dāng)要易于翻譯時(shí)，核糖體結(jié)合結(jié)構(gòu)域與編碼序列可操作地連接。一般而言，“可操作地連接”是指被連接的DNA序列的接觸，或者分泌前導(dǎo)區(qū)是接觸的并且存在于前導(dǎo)閱讀框中。但是，增強(qiáng)子不必接觸。當(dāng)不存在結(jié)構(gòu)域時(shí)，根據(jù)常規(guī)方法的合成寡核苷酸接頭或連接體如上述來(lái)使用。用于本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”通常是指插入有異源DNA片段的作為常規(guī)重組載體的雙鏈DNA片段。此處，異源DNA是指異質(zhì)DNA，其在宿主細(xì)胞中未被天然發(fā)現(xiàn)。表達(dá)載體在宿主細(xì)胞內(nèi)，可以被復(fù)制而不管宿主染色體DNA，并且可以產(chǎn)生載體和插入在該載體中的(異源)DNA的幾個(gè)拷貝。如本領(lǐng)域中已知的，為了提高轉(zhuǎn)化基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平，將有關(guān)基因與在所選擇的表達(dá)宿主中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)控制序列可操作地連接。優(yōu)選地，所述表達(dá)控制序列和有關(guān)基因包括在包含細(xì)菌選擇標(biāo)記和復(fù)制起點(diǎn)的一個(gè)表達(dá)載體中。當(dāng)表達(dá)宿主是真核細(xì)胞時(shí)，該表達(dá)載體在真核表達(dá)宿主中應(yīng)該進(jìn)一步包括有用的表達(dá)標(biāo)記。在本發(fā)明中，所述重組載體可以是包括質(zhì)粒載體、噬菌體載體、粘粒載體或酵母人工染色體(YAC)載體的多種載體。質(zhì)粒載體優(yōu)選用于本發(fā)明的目的?？梢杂糜谒瞿康牡牡湫唾|(zhì)粒載體具有包含如下的結(jié)構(gòu)(a)使得復(fù)制能有效進(jìn)行，以在每個(gè)宿主細(xì)胞中包含幾百個(gè)質(zhì)粒載體的復(fù)制起點(diǎn)，(b)使得能夠篩選質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化了的宿主細(xì)胞的抗生素抗性基因，和(c)其中可插入外源DNA片段的限制性內(nèi)切酶的限制性位點(diǎn)。即使沒(méi)有合適的限制性內(nèi)切酶的限制性位點(diǎn)，當(dāng)根據(jù)常規(guī)方法使用連接體或合成的寡核苷酸接頭時(shí)，載體和外源DNA也可以容易地連接。此外，原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以使用上述Sambrook等人的1. 82章中描述的氯化鈣法容易地實(shí)現(xiàn)。任選地，電穿孔法(Neumann et al.，EMBO J.，1 :841(1982))也可以用于細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。用于制備包含轉(zhuǎn)化酶的基因和本發(fā)明的合酶的基因的植物的植物轉(zhuǎn)染可以通過(guò)使用農(nóng)桿菌和病毒載體等的常規(guī)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，用包含本發(fā)明的基因的重組載體對(duì)農(nóng)桿菌屬微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后將經(jīng)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌屬微生物轉(zhuǎn)染到目標(biāo)植物的組織等中，以得到經(jīng)轉(zhuǎn)染的植物。更具體而言，可以通過(guò)以下步驟來(lái)制備經(jīng)轉(zhuǎn)染的植物(a)通過(guò)預(yù)培養(yǎng)目標(biāo)植物的外植體然后與經(jīng)轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)來(lái)轉(zhuǎn)染目標(biāo)植物；(b)通過(guò)在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述經(jīng)轉(zhuǎn)染的外植體而得到愈傷組織；和(c)通過(guò)切下上述得到的愈傷組織然后在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)而長(zhǎng)成芽。
本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)“外植體”是指來(lái)自于植物的組織切割物的片段，并且包括子葉和胚軸。用于本發(fā)明的方法的外植體可以是子葉和胚軸，并且更優(yōu)選使用對(duì)植物種子進(jìn)行消毒和洗滌后通過(guò)在MS培養(yǎng)基中發(fā)芽而得到的子葉。下文，將參考實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。實(shí)施例僅是用于更具體地說(shuō)明，而本發(fā)明的范圍不限于實(shí)施例。尤其是，以下實(shí)施例只公開(kāi)了使用II型PHA合酶的突變體通過(guò)將3-羥基丁酸酯(3-HB)加入到乳酸酯共聚物的合成中來(lái)合成聚(3-羥基丁酸酯-共-乳酸酯) (P(3HB-co-LA))，但對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，除了 3-HB之外，可以通過(guò)加入多羥基鏈烷酸酯來(lái)制備多羥基鏈烷酸酯和乳酸酯的共聚物。<實(shí)施例1>與來(lái)源于假單胞菌MBEL 6-19的PHA合酶的氨基酸序列具有高度同源性的PHA合酶的基因克隆和研究為了研究與來(lái)源于用于本發(fā)明的假單胞菌MBEL 6-19 (KCTC 11027BP)的多羥基鏈烷酸酯合酶(WiaClPs6_19)具有高度氨基酸序列同源性的多羥基鏈烷酸酯合酶，使用由美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center forBiotechnology Information(NCBI))提供的Basic Local Alignment Search iTool (BLAST)分析，在結(jié)果中顯示相對(duì)高的氨基酸序列同源性的合酶示于表1中。所有的酶包括在II型多羥基鏈烷酸酯合酶的組中，II型多羥基鏈烷酸酯合酶是用于使具有相對(duì)長(zhǎng)的碳鏈的底物聚合的中鏈長(zhǎng)(MCL)-PHA合酶。[表1]顯示與WiaClPs6_19具有氨基酸序列高度同源性的多羥基鏈烷酸酯合酶
權(quán)利要求
1.一種使用乳酰輔酶A作為底物合成乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的多羥基鏈烷酸酯合酶的突變體，其中所述突變體在以SEQ ID N0:2、4、6或8表示的多羥基鏈烷酸酯合酶的氨基酸序列中具有選自以下的至少一種突變a)E130D和 Q481K ；b)E130D、S325T和 Q481K ；c)E130D、S477F和 Q481K ；d)E130D、S325T、S477F和 Q481K ；和e)E130D、S325T、S477G和 Q481K。
2.一種編碼權(quán)利要求1的多羥基鏈烷酸酯合酶的突變體的基因。
3.一種包含權(quán)利要求2的基因的用于合成乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的重組載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組載體，其還包含SEQID NO :77的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因(pet)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其中，所述SEQID NO :77的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因包括丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶突變體基因，該丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶突變體基因包含選自以下的突變a)在SEQID NO 77堿基序列中的A1200G突變；b)在SEQ ID N0:77堿基序列中的T78C、T669C、A1125G和T1158C突變；c)在SEQID N0:78氨基酸序列中的Gly335Asp突變和在SEQ ID N0:77堿基序列中的A1200G突變；d)在SEQID NO :78氨基酸序列中的AlaM3Thr突變和在SEQ ID N0:77堿基序列中的A1200G突變；e)在SEQID NO :78氨基酸序列中的Asp65Gly突變和在SEQ ID N0:77堿基序列中的 T669C、A1125G 和 T1158C 突變；f)在SEQID N0:78氨基酸序列中的Asp257Asn突變和在SEQ ID N0:77堿基序列中的A1200G突變；g)在SEQID NO :78氨基酸序列中的Asp65Asn突變和在SEQ ID NO: 77堿基序列中的 T699C、A1125G 和 T1158C 突變；h)在SEQID NO :78氨基酸序列中的Thrl99Ile突變和在SEQ ID N0:77堿基序列中的 T699C、A1125G 和 T1159C 突變；和i)在SEQID N0:78氨基酸序列中的Vall93Ala突變和在SEQ ID N0:77堿基序列中的 T78C、T699C 和 T1158C 突變。
6.一種用權(quán)利要求3 5中任一項(xiàng)所述的重組載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。
7.一種制備乳酸酯聚合物或乳酸酯共聚物的方法，該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)化體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述培養(yǎng)在含有羥基鏈烷酸酯的環(huán)境中進(jìn)行，且所述共聚物是羥基鏈烷酸酯-CO-3-乳酸酯。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述羥基鏈烷酸酯是選自以下中的至少一種 3-羥基丁酸酯、3-羥基戊酸酯、4-羥基丁酸酯、含有6 14個(gè)碳原子的中鏈長(zhǎng)(D)-3-羥基羧酸、3-羥基丙酸、3-羥基己酸、3-羥基庚酸、3-羥基辛酸、3-羥基壬酸、3-羥基癸酸、3-羥基十一烷酸、3-羥基十二烷酸、3-羥基十四烷酸、3-羥基十六烷酸、4-羥基戊酸、4-羥基己酸、4-羥基庚酸、4-羥基辛酸、4-羥基癸酸、5-羥基戊酸、5-羥基己酸、6-羥基十二烷酸、 3-羥基-4-戊烯酸、3-羥基-4-反式-己烯酸、3-羥基-4-順式-己烯酸、3-羥基-5-己烯酸、3-羥基-6-反式-辛烯酸、3-羥基-6-順式-辛烯酸、3-羥基-7-辛烯酸、3-羥基-8-壬烯酸、3-羥基-9-癸烯酸、3-羥基-5-順式-十二碳烯酸、3-羥基-6-順式-十二碳烯酸、 3-羥基-5-順式-十四碳烯酸、3-羥基-7-順式-十四碳烯酸、3-羥基-5，8-順式-順式-十四碳烯酸、3-羥基-4-甲基戊酸、3-羥基-4-甲基己酸、3-羥基-5-甲基己酸、3-羥基-6-甲基己酸、3-羥基-4-甲基辛酸、3-羥基-5-甲基辛酸、3-羥基-6-甲基辛酸、3-羥基-7-甲基辛酸、3-羥基-6-甲基壬酸、3-羥基-7-甲基壬酸、3-羥基-8-甲基壬酸、3-羥基-7-甲基癸酸、3-羥基-9-甲基癸酸、3-羥基-7-甲基-6-辛烯酸、蘋果酸、3-羥基琥珀酸甲酯、3-羥基己二酸甲酯、3-羥基辛二酸甲酯、3-羥基壬二酸甲酯、3-羥基癸二酸甲酯、3-羥基辛二酸乙酯、3-羥基癸二酸乙酯、3-羥基庚二酸丙酯、3-羥基癸二酸芐酯、3-羥基-8-乙酰氧基辛酸、3-羥基-9-乙酰氧基壬酸、苯氧基-3-羥基丁酸、苯氧基-3-羥基戊酸、苯氧基-3-羥基庚酸、苯氧基-3-羥基辛酸、對(duì)氰基苯氧基-3-羥基丁酸、對(duì)氰基苯氧基-3-羥基戊酸、對(duì)氰基苯氧基-3-羥基己酸、對(duì)硝基苯氧基-3-羥基己酸、3-羥基-5-苯基戊酸、3-羥基-5-環(huán)己基丁酸、3，12-二羥基十二烷酸、3，8_ 二羥基-5-順式-十四碳烯酸、 3-羥基-4，5-環(huán)氧癸酸、3-羥基-6，7-環(huán)氧十二烷酸、3-羥基-8，9-環(huán)氧-5，6-順式-十四烷酸、7-氰基-3-羥基庚酸、9-氰基-3-羥基庚酸、3-羥基-7-氟庚酸、3-羥基-9-氟壬酸、3-羥基-6-氯己酸、3-羥基-8-氯辛酸、3-羥基-6-溴己酸、3-羥基-8-溴辛酸、3-羥基-11-溴十一烷酸、3-羥基-2- 丁烯酸、6-羥基-3-十二碳烯酸、3-羥基-2-甲基丁酸、 3-羥基-2-甲基戊酸和3-羥基2，6- 二甲基-5-庚烯酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了能夠合成乳酸酯聚合物(PLA)和乳酸酯共聚物(PLA共聚物)的多種多羥基鏈烷酸酯(PHA)合酶的突變體，以及使用所述突變體制備乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的方法。更具體而言，本發(fā)明提供了以SEQ ID NO2、4、6或8表示的多羥基鏈烷酸酯合酶的突變體，以及使用所述合酶的突變體制備乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的方法。以SEQ ID NO2、4、6或8表示的多羥基鏈烷酸酯合酶，通過(guò)影響合成乳酸酯聚合物的活性的氨基酸序列突變可以具有合成乳酸酯聚合物和乳酸酯共聚物的活性，并且通過(guò)使用所述合酶的突變體可以分別產(chǎn)生具有不同特征的乳酸酯聚合物和共聚物。
文檔編號(hào)C12N15/52GK102575234SQ201080038716
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月30日
發(fā)明者姜惠玉, 李相燁, 梁宅鎬, 鄭有景 申請(qǐng)人:Lg化學(xué)株式會(huì)社, 韓國(guó)科學(xué)技術(shù)院