專利名稱：在得自對(duì)象的生物學(xué)樣品中評(píng)價(jià)癌癥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于評(píng)價(jià)和診斷癌癥的方法。具體地，本發(fā)明涉及一種通過測(cè)定某種基因的表達(dá)水平來(lái)評(píng)價(jià)和診斷鼻咽癌(NPC)的方法。本發(fā)明還涉及用于醫(yī)藥的多肽、抗體和核酸以及用于進(jìn)行本發(fā)明的方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
鼻咽癌(NPC)是一種南中國(guó)和東南亞常見的癌癥，其中每年診斷出超過50000個(gè)新病例。在馬來(lái)西亞，NPC是第6常見的癌癥，并且是男性中第3常見的癌癥。NPC是高度放射敏感且化學(xué)敏感的；伴有化療的放療增加了存活率。經(jīng)改進(jìn)的復(fù)發(fā)早期檢測(cè)和施用合適的手術(shù)搶救方法進(jìn)一步促成了治療結(jié)果的改善。然而，NPC的存活者健康相關(guān)的生活質(zhì)量受到損害。經(jīng)歷該疾病而存活的患者存在幾種晚期并發(fā)癥，其中許多源自鼻咽和頸節(jié)附近的劑量限制性器官的放射效果。在更晚期的病例使用化療增加了副作用，其包括與順鉬有關(guān)的細(xì)胞毒性。因此，需要治療NPC的替代方法。
與其他頭頸癌不同，在NPC中，在所有病例中均檢測(cè)到克隆的EB病毒(EBV)基因組。EBV的潛在蛋白表達(dá)受限于EBNAl核抗原和潛在的膜蛋白(LMP1、LMP2A、LMP2B)。然而，EBV對(duì)NPC發(fā)展的貢獻(xiàn)尚知之甚少。在揭示EBV如何促成這種疾病的發(fā)病機(jī)理的嘗試中，我們首先利用微陣列分析比較了 EBV陽(yáng)性NPC腫瘤中細(xì)胞基因表達(dá)與來(lái)自非癌癥對(duì)照的樣品的細(xì)胞基因表達(dá)，并且鑒定了許多可能與NPC的發(fā)病機(jī)理有關(guān)的基因。
因此，需要這樣的方法，其用于輔助評(píng)價(jià)患者發(fā)展癌癥的風(fēng)險(xiǎn)、或者癌癥進(jìn)展的嚴(yán)重性可能性或似然性、或者輔助選擇患者的癌癥治療方案、或者輔助評(píng)價(jià)癌癥治療方案，特別是用于NPC的方法。
發(fā)明概述
本發(fā)明的第一方面涉及一種在得自對(duì)象的生物學(xué)樣品中評(píng)價(jià)鼻咽癌(NPC)的方法，所述方法包括以下步驟(a)測(cè)定所述生物學(xué)樣品中預(yù)定基因的表達(dá)水平；和(b) 將所述基因測(cè)定的表達(dá)水平與參照物中的水平比較，其中所述預(yù)定基因?yàn)樗倪B接框 1 (Four-jointed Box 1，F(xiàn)JX1)，并且其中表達(dá)水平的差異可以指示鼻咽癌細(xì)胞的存在。
具體地，所述參照物為正?；蚍菒盒约?xì)胞或組織。
在本發(fā)明中，表達(dá)水平可以是FJXl在得自所述對(duì)象的所述生物學(xué)樣品中的RNA表達(dá)水平。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法還包括測(cè)定所述樣品中的FJXl的RNA水平的步驟。
可以利用本領(lǐng)域公知的任何合適方法測(cè)定FJXl水平。
優(yōu)選地，本發(fā)明中測(cè)定的FJXl的RNA水平為FJXlmRNA。
更優(yōu)選地，F(xiàn)JXl的RNA水平通過使用包含以下序列的至少兩種寡核苷酸引物或者互補(bǔ)鏈中它們的同源物來(lái)測(cè)定
SEQ ID NO. 1 :5，CCCGCAAAGGTGTCTAAAAACT3，；禾口
SEQ ID NO. 2 5' TGCTGGCACAGTAAAGAATCCT3，。
或者，可以利用本領(lǐng)域公知的微陣列分析方法或者定量實(shí)時(shí)PCR來(lái)測(cè)定FJXlmRNA 水平。
應(yīng)當(dāng)理解檢測(cè)細(xì)胞中與正常(非惡性或非癌性)細(xì)胞的水平相比提高的FJXlmRNA 水平的存在可以輔助評(píng)價(jià)患者發(fā)展鼻咽癌(NPC)的風(fēng)險(xiǎn)。生物學(xué)樣品中與正常(非惡性或非癌性)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的表達(dá)水平相比提高的FJXlmRNA表達(dá)水平可以是NPC的指示。檢測(cè)提高的水平還可以提示所述對(duì)象會(huì)受益于特定形式的治療，如用本文所公開的癌癥疫苗治療。
在本發(fā)明中，表達(dá)水平還可以是得自所述對(duì)象的所述生物學(xué)樣品中FJXl的蛋白表達(dá)水平。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述方法還包括所述生物學(xué)樣品中的FJXl多肽或蛋白水平的檢測(cè)與測(cè)定。
本發(fā)明的方法還包括對(duì)所述生物學(xué)樣品中的FJXl多肽的測(cè)量與檢測(cè)，以及它們與參照物樣品的比較。應(yīng)當(dāng)理解檢測(cè)生物學(xué)樣品中與正常(非惡性或非癌性)細(xì)胞的水平相比提高的FJXl多肽水平的存在可以輔助評(píng)價(jià)患者發(fā)展鼻咽癌(NPC)的風(fēng)險(xiǎn)。生物學(xué)樣品中與正常(非惡性或非癌性)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的水平相比提高的FJXl多肽水平可以是NPC 的指示。
可以通過利用本領(lǐng)域公知的任何合適的蛋白定量方法來(lái)測(cè)定FJXl的多肽或蛋白水平。特別地，優(yōu)選使用抗體，并且利用包括定量蛋白印跡、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)或定量免疫組織化學(xué)在內(nèi)的方法測(cè)定FJXl的量。
如上所述，樣品中與已知的正常組織參照物樣品相比提高的FJXl多肽水平是致瘤樣品的暗示。
在本發(fā)明的另一方面，其還提供了在對(duì)象中檢測(cè)癌癥的方法，所述方法包括向所述對(duì)象給予抗FJXl抗體，并且提供了所述抗體在制備用于治療鼻咽癌(NPC)的藥物中的用途。
本發(fā)明的另一方面提供了在患者中治療鼻咽癌(NPC)的方法，所述方法包括向所述患者給予有效量的FJXl多肽、調(diào)節(jié)FJXl基因活性的分子、針對(duì)FJXl的抗體或結(jié)合至 FJXl的分子。
本發(fā)明的另一方面描述了上述FJXl多肽、調(diào)節(jié)FJXl基因活性的分子、針對(duì)FJXl 的抗體和結(jié)合至FJXl的分子在制備用于治療鼻咽癌(NPC)的藥物中的用途。
本發(fā)明的另一方面提供了用于測(cè)定FJXl基因的表達(dá)水平的試劑盒，其包含至少一對(duì)寡核苷酸引物對(duì)，所述寡核苷酸引物對(duì)包含本文所公開的SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 的序列。
現(xiàn)在上述方法和用途會(huì)在以下公開和所附權(quán)利要求中更詳細(xì)地解釋。


為了提供更好的理解，現(xiàn)在會(huì)參考附圖描述本發(fā)明，其中
圖 1 (a)示出了 FJXl 的 mRNA 序列；
圖1 (b)示出了 FJXl的氨基酸序列；
圖2示出了基因FJXl的定量PCR分析。與正常鼻咽的兩個(gè)活檢相比，定量PCR顯示在14個(gè)NPC腫瘤中FJXlmRNA上調(diào)。
圖3示出了 FJXl蛋白的免疫組織化學(xué)分析，其中證實(shí)了 NPC中FJXl蛋白表達(dá)的上調(diào)。在NPC腫瘤細(xì)胞(白色箭頭)中檢測(cè)到FJXl表達(dá)，但是在周圍非惡性細(xì)胞(黑色箭頭)中未檢測(cè)到。
圖4示出了利用多組織cDNA操作盤(Multiple Tissue cDNA Panel)分析的FJXl 的表達(dá)。除了卵巢、胰、胎盤和小腸之外，F(xiàn)JXl表達(dá)在所分析的大部分正常人器官中幾乎檢測(cè)不到。1，心；2，腦；3，胎盤；4，肺；5，肝；6，骨骼?。?，腎；8，胰；9，脾；10，胸腺；11，前列腺；12，睪丸；13，卵巢；14，小腸；15，結(jié)腸；16，外周血白細(xì)胞；+ve, PCR反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明描述了通過測(cè)定基因四連接框1 (FJXl)的表達(dá)水平來(lái)評(píng)價(jià)鼻咽癌(NPC)的方法。
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，其提供了在得自對(duì)象的生物學(xué)樣品中評(píng)價(jià)鼻咽癌(NPC) 的方法，所述方法包括以下步驟(a)測(cè)定所述生物學(xué)樣品中預(yù)定基因的表達(dá)水平；和 (b)將所述基因測(cè)定的表達(dá)水平與參照物中的水平比較，其中所述預(yù)定基因?yàn)樗倪B接框 1 (FJXl)，并且其中表達(dá)水平的差異可以指示鼻咽癌細(xì)胞的存在。
“FJX1”指基因或RNA產(chǎn)物或蛋白產(chǎn)物，上下文會(huì)使其明確。
根據(jù)本發(fā)明的方法，預(yù)定基因的所述表達(dá)水平可以理解為在得自所述對(duì)象的生物學(xué)樣品中FJXl的RNA表達(dá)水平。
優(yōu)選地，所述方法還包括測(cè)定樣品中FJXl的RNA水平?？梢酝ㄟ^使用至少兩條寡核苷酸弓I物來(lái)測(cè)定FJXl的RNA水平，例如，所述引物選自
SEQ ID NO. 1 :5，CCCGCAAAGGTGTCTAAAAACT3，；禾口
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或者互補(bǔ)鏈中它們的同源物。
更優(yōu)選地，本發(fā)明中測(cè)定的FJXl的RNA水平為FJXlmRNA。所述mRNA序列如圖1 所示。樣品中與正常(非惡性或非癌性)組織樣品中發(fā)現(xiàn)的相比增加的FJXlmRNA可以是鼻咽癌的指示。
可以通過利用特異性寡核苷酸引物和諸如聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的核酸擴(kuò)增技術(shù)測(cè)定FJXl的RNA水平?？梢岳帽绢I(lǐng)域公知的方法合成寡核苷酸引物，例如利用固相亞磷酰胺化學(xué)。優(yōu)選地，所述寡核苷酸引物長(zhǎng)度為至少20個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地，長(zhǎng)度為至少25 個(gè)核苷酸，并且甚至更優(yōu)選地長(zhǎng)度為至少四個(gè)核苷酸。
PCR擴(kuò)增的合適條件包括在合適的IX擴(kuò)增緩沖液中擴(kuò)增10X擴(kuò)增緩沖液為 500mM KCI ；IOOmM Tris. Cl (在室溫下 pH 8.3) ； 15mM MgCl2 ；0. 明膠。特別優(yōu)選適合用于聚合酶鏈反應(yīng)的單鏈DNA引物。
應(yīng)當(dāng)理解可以利用本領(lǐng)域公知的方法通過反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)來(lái)鑒定 FJXlmRNA。
優(yōu)選適合用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR;Saiki et al (1988) Science 239,487-491)的引物。合適的PCR引物可以具有以下特性眾所周知寡核苷酸5'端的序列必須匹配待擴(kuò)增的靶序列。
通常PCR引物不含有任何長(zhǎng)于2個(gè)堿基的互相互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，特別是在其3'端，因?yàn)榇颂卣骺梢源龠M(jìn)稱為“引物二聚體”的假產(chǎn)物的形成。當(dāng)兩條引物的3'端雜交時(shí)，它們形成“引導(dǎo)模板(primed template) ”復(fù)合物，并且引物延伸導(dǎo)致稱為“引物二聚體”的短雙鏈體產(chǎn)物。
引物中應(yīng)當(dāng)避免內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)。對(duì)于對(duì)稱PCR，通常對(duì)兩條引物均推薦40-60% G+C含量，沒有長(zhǎng)段的任何一種堿基。與DNA探針雜交研究聯(lián)用的經(jīng)典解鏈溫度計(jì)算預(yù)測(cè)給定引物應(yīng)當(dāng)在特定溫度退火或者72°C延伸溫度會(huì)過早解離引物/模板雜化物。實(shí)際上，在 PCR過程中雜交比一般簡(jiǎn)單Tm計(jì)算所預(yù)測(cè)的更高效。
最佳退火溫度可以憑經(jīng)驗(yàn)來(lái)確定，并且可以高于預(yù)測(cè)。Taq DNA聚合酶在37_55°C 區(qū)間具有活性，因此引物延伸在退火步驟會(huì)發(fā)生，并且會(huì)使雜化物穩(wěn)定。在常規(guī)(對(duì)稱)PCR 中引物濃度相等，并且典型地范圍在0. 1-至1-內(nèi)。
在本發(fā)明的方法中可以使用任何核酸擴(kuò)增方案，包括聚合酶鏈反應(yīng)、QB復(fù)制酶和連接酶鏈反應(yīng)。而且，可以如 Compton(1991)Nature 350，91-92 和 AIDS(1993)，Vol 7 (Supp 1 2)所述那樣使用也稱為3SR的NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增)，可以如Walker et al (1992) Nucl. Acids Res. 20，1691-1696 所述那樣使用 S108 或 SDA (鏈置換擴(kuò)增)。因?yàn)槠浜?jiǎn)單，所以特別優(yōu)選聚合酶鏈反應(yīng)。
當(dāng)在PCR中使用本發(fā)明的一對(duì)合適的核酸時(shí)，通過凝膠電泳和溴化乙錠染色可以很方便地檢測(cè)產(chǎn)物。作為利用DNA的瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色檢測(cè)DNA擴(kuò)增的替代，使用能夠雜交至擴(kuò)增的DNA的標(biāo)記的寡核苷酸作為探針是很方便的。當(dāng)通過PCR 擴(kuò)增時(shí)，寡核苷酸探針雜交至兩條引物所界定的引物間(interprimer)序列。寡核苷酸探針優(yōu)選長(zhǎng)度為10和50個(gè)核苷酸之間，更優(yōu)選長(zhǎng)度為15和30個(gè)核苷酸之間?？梢岳脴?biāo)準(zhǔn)技術(shù)用諸如％p、33P和35S的放射性核素標(biāo)記探針，或者可以用熒光染料標(biāo)記。當(dāng)熒光標(biāo)記寡核苷酸探針時(shí)，可以在溶液中檢測(cè)擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物(參見例如Balaguer et al (1991) “ Quantification of DNA sequences obtained by polymerase chain reaction using a bioluminescence adsorbent “ Anal. Biochem. 195，105-110 禾口 DiCesare et al (1993)“ A high-sensitivity electrochemiluminescence-based detection system for automated PCR product quantitation" Bio Techniques 15，152-157)。
還可以利用具有熒光團(tuán)-猝滅劑對(duì)或連接至固相支持物或具有生物素標(biāo)簽的探針檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，或者可以利用捕獲探針與檢測(cè)探針的組合檢測(cè)它們。
熒光團(tuán)-猝滅劑對(duì)特別適合PCR反應(yīng)(例如RT-PCR)的定量測(cè)量。使用合適的探針的熒光偏振也可以用于檢測(cè)PCR產(chǎn)物。
包括了其他檢測(cè)mRNA水平的方法。
用于測(cè)定FJXlmRNA的相對(duì)量的方法包括原位雜交(In Situ Hybridization Protocols. Methods in Molecular Biology Volume 33. Edited by K H A Choo. 1994, Humana Press Inc(Totowa, NJ, USA)pp 480p 禾口 In Situ Hybridization :A Practical Approach. Edited by D G Wilkinson. 1992, Oxford University Press, Oxford,pp 163)、 原位擴(kuò)增、RNA印跡、核酸酶保護(hù)、探針陣列和基于擴(kuò)增的系統(tǒng)；可以在檢測(cè)和定量之前或期間擴(kuò)增mRNA。其中每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)均測(cè)量產(chǎn)物的‘實(shí)時(shí)’擴(kuò)增方法可以特別有用(例如實(shí)時(shí)PCR Hid et al (1996)Genome Research 6,986-994, Gibson et al (1996)Genome Research 6,995-1001 ；實(shí)時(shí) NASBA Oehlenschlager et al(1996 Nov 12)PNAS(USA)93 (23)， 12811-6。引物應(yīng)當(dāng)設(shè)計(jì)為優(yōu)先從mRNA模板而不是從DNA擴(kuò)增，或者設(shè)計(jì)為產(chǎn)生這樣的產(chǎn)物，其中mRNA或DNA模板來(lái)源可以通過大小或通過探針來(lái)區(qū)分。NASBA可以特別有用，因?yàn)樵摲椒梢越?jīng)過安排從而僅將RNA識(shí)別為初始底物。
檢測(cè)mRNA在任何上下文中包括檢測(cè)mRNA，或者檢測(cè)有含有mRNA的細(xì)胞存在(例如，通過原位雜交，或者在得自裂解細(xì)胞的樣品中)。檢測(cè)mRNA的存在或某些細(xì)胞的存在 (普遍或在特定部位)是有用的，某些細(xì)胞的存在可以通過它們的FJXlmRNA表達(dá)來(lái)檢測(cè)。 如本文所述，F(xiàn)JXlmRNA的存在與不存在可以是有用的標(biāo)志，或者FJXlmRNA的低水平與高水平可以是有用的標(biāo)志，或者特定的量化水平可以與特定的疾病狀態(tài)有關(guān)。應(yīng)當(dāng)理解存在關(guān)于利用FJXl多肽作為標(biāo)志的相似可能性。
根據(jù)本發(fā)明的方法，預(yù)定基因的所述表達(dá)水平可以理解為在得自所述對(duì)象的生物學(xué)樣品中FJXl的蛋白表達(dá)水平。
為了進(jìn)一步改進(jìn)對(duì)鼻咽癌(NPC)的評(píng)價(jià)，本發(fā)明的方法還包括測(cè)定樣品中FJXl的蛋白水平。
本發(fā)明的方法還包括對(duì)測(cè)試樣品中的FJXl多肽的測(cè)量和檢測(cè)以及參照物樣品中它們的比較。應(yīng)當(dāng)理解檢測(cè)細(xì)胞中與諸如正常(非惡性或非癌性)細(xì)胞的參照物樣品中存在的水平相比提高的FJXl多肽水平的存在可以輔助評(píng)價(jià)患者發(fā)展鼻咽癌(NPC)的風(fēng)險(xiǎn)。樣品中與正常(非惡性或非癌性)組織樣品中發(fā)現(xiàn)的相比增加的FJXl多肽可以是NPC的指7J\ ο
含有來(lái)源于患者的RNA和/或蛋白的樣品方便地是組織的樣品，其中懷疑有鼻咽癌(NPC)或者其中可以或已經(jīng)發(fā)現(xiàn)癌癥。這些方法可以用于任何癌癥，但是它們特別適合用于NPC。所述樣品還可以是血液、血清或淋巴結(jié)，這可以特別有利于確定癌癥是否已擴(kuò)散。 或者，所述樣品可以是手術(shù)得自患者的組織樣品。優(yōu)選地，所述組織為上皮組織。
包括檢測(cè)FJXl多肽在內(nèi)的本發(fā)明的方法對(duì)于歷史樣品特別有用，如含有腫瘤樣品的石蠟包埋切片的歷史樣品。
可以任何合適的方式測(cè)定FJXl多肽的量。
優(yōu)選通過利用選擇性結(jié)合至FJXl多肽的分子來(lái)測(cè)定FJXl多肽的量。合適地，選擇性結(jié)合至FJXl的分子為抗體。所述抗體還可以結(jié)合至FJXl多肽的天然變體或片段。
多肽的“變體”包括插入、缺失和取代，保守或非保守的，其中這樣的變化基本上不改變所述FJXl的活性。
多核苷酸和多肽的變體和變異包括天然變體，包括等位變體和天然存在的突變形式。
"FJX1的片段”包括任何片段，其保持活性，或者其以某些其他方式有用，例如，用于產(chǎn)生抗體或結(jié)合測(cè)定。
用于本發(fā)明的方法的抗體可以是單克隆或多克隆的。
可以利用任何合適的蛋白定量方法測(cè)定FJXl的蛋白水平。特別地，優(yōu)選使用抗體，并且利用包括定量蛋白印跡、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)或定量免疫組織化學(xué)在內(nèi)的方法測(cè)定FJXl的量。
如上文所述，樣品中與已知正常組織參照物樣品相比提高的FJXl水平是致瘤樣品的提示。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，抗體會(huì)從溶液免疫沉淀FJXl蛋白以及在聚丙烯酰胺凝膠的蛋白印跡或免疫印跡上與FJXl蛋白反應(yīng)。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，利用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，抗體會(huì)檢測(cè)石蠟或冰凍組織切片中的FJXl蛋白。
關(guān)于檢測(cè)FJXl的方法的優(yōu)選實(shí)施方案包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、免疫放射分析(IRMA)和免疫酶測(cè)定(IEMA)，包括利用單克隆和/或多克隆抗體的夾心法。
示例性?shī)A心法如David等人在美國(guó)專利第4，376，110號(hào)和第4，486，530號(hào)中所述，援引加入本文。
用于檢測(cè)的方法還包括免疫熒光?？梢允褂米詣?dòng)或半自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)。已知定量免疫測(cè)定的幾種形式。這類系統(tǒng)可以包括一種以上結(jié)合抗原的抗體；標(biāo)記或未標(biāo)記的抗原(除樣品中含有的任何抗原之外)；以及各種檢測(cè)系統(tǒng)，包括放射性同位素、比色法、熒光測(cè)定、化學(xué)發(fā)光和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光；可以包括或不包括酶催化。免疫測(cè)定可以是同質(zhì)系統(tǒng)， 其中不發(fā)生結(jié)合與未結(jié)合的試劑的分離，或者是包括分離步驟的異質(zhì)系統(tǒng)。
這類測(cè)定通常被稱為例如酶聯(lián)發(fā)光免疫測(cè)定(ELLIA)、熒光酶免疫測(cè)定(FEIA)、 熒光免疫測(cè)定(FIA)、酶免疫測(cè)定(EIA)、發(fā)光免疫測(cè)定(LIA)、乳膠光度免疫測(cè)定(LPIA)。
培養(yǎng)生物學(xué)樣品(例如樣品細(xì)胞)和分離蛋白的方法是本領(lǐng)域公知的?？梢允斋@和裂解細(xì)胞，并且可以利用抗體檢測(cè)上清中所述蛋白的存在。這樣的抗體在癌癥診斷中是有用的。適當(dāng)?shù)?，將本發(fā)明的抗體可檢測(cè)地標(biāo)記，例如可以這樣的方式標(biāo)記它們，其中可以直接或間接檢測(cè)它們。方便地，可以用放射性部分或有色部分或熒光部分標(biāo)記抗體，或者可以將它們連接至酶。通常，所述酶可以將無(wú)色(或無(wú)熒光)底物轉(zhuǎn)換為有色(或熒光)產(chǎn)物?？梢杂蒙锼?或鏈親和素)標(biāo)記抗體，然后利用鏈親和素(或生物素)間接檢測(cè)，所述鏈親和素(或生物素)已用放射性部分或有色部分或熒光部分等標(biāo)記，或者可以將它們連接至上文所述類型的酶。
抗“FJX1”抗體或者其片段或衍生物，如人源化抗體或kFv片段或dAb或保留抗原結(jié)合特異性的其他片段可以有利于成像，如患者體內(nèi)腫瘤的成像，利用例如放免液閃法。 方便地，用允許檢測(cè)的部分標(biāo)記所述抗體或者其片段或衍生物。
合適地，所述標(biāo)記為放射性部分，并且優(yōu)選地，其含有99mTc，或者锝的其他合適的放射性核素，或者釔、銦、碘等的合適的放射性核素，所有都是本領(lǐng)域公知的。
優(yōu)選地，所述抗體為單克隆抗體或其片段。
可以治療性使用抗FJXl抗體或者其片段或衍生物。例如，未綴合的抗體或者其片段或衍生物可以用于誘導(dǎo)抗獨(dú)特型反應(yīng)。
或者，可以將抗體或者其片段或衍生物綴合至直接或間接細(xì)胞毒性的部分。直接細(xì)胞毒性物質(zhì)包括，例如，放射性同位素和毒素，如蓖麻毒蛋白；間接細(xì)胞毒性物質(zhì)包括，例如，可以將相對(duì)無(wú)毒的前體藥物轉(zhuǎn)換為細(xì)胞毒性藥物的酶。
特別優(yōu)選基于FJXl的氨基酸序列(如圖1(b)所示)制備肽，這允許制備特異性抗體。
優(yōu)選地，參照物為正常細(xì)胞或組織，更優(yōu)選正?；蚍菒盒约?xì)胞或組織。與之比較測(cè)定的基因表達(dá)水平的參照物可以是正常(健康)組織，如正常上皮細(xì)胞，或者任何其他參照物組織。參照物組織可以是包含正常組織水平的非癌性組織。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠基于組織樣品的外觀和組織學(xué)確定該樣品組織是正常(健康)的或癌性的。參照物組織可以來(lái)自采集生物學(xué)樣品的對(duì)象或者來(lái)自任何其他適當(dāng)來(lái)源，例如，未患有NPC的對(duì)象?；蛘?，細(xì)胞系可以用于外源表達(dá)FJXl，例如人NPC細(xì)胞系。
術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)樣品，，可以是采集自或直接來(lái)自人或動(dòng)物或培養(yǎng)之后的任何生物學(xué)物質(zhì)。生物學(xué)樣品可以是例如體液、血液、血清、淋巴結(jié)、活檢、菌落、液體培養(yǎng)物等。
優(yōu)選地，生物學(xué)樣品選自口腔粘膜組織、鼻咽組織、鼻咽拭子和漱口水。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了在患者中檢測(cè)鼻咽癌(NPC)的方法，所述方法包括向所述患者給予用可檢測(cè)的標(biāo)記所標(biāo)記的抗FJXl抗體或者其片段或衍生物，允許標(biāo)記的抗體定位至癌癥并成像癌癥。
本發(fā)明的另一方面提供了選擇性雜交至FJXlmRNA的核酸在制備用于診斷鼻咽癌 (NPC)的試劑中的用途。本發(fā)明的另一方面提供了選擇性雜交至FJXlmRNA的核酸在診斷鼻咽癌(NPC)的方法中的用途。
本發(fā)明的另一方面提供了選擇性結(jié)合至FJXl多肽或者其天然片段或變體的分子在制備用于診斷或成像癌癥的試劑中的用途。
在本發(fā)明的另一方面，提供了治療鼻咽癌(NPC)的方法，所述方法包括向患者給予有效量的FJXl多肽或者其變體或融合或片段、或者有效量的編碼FJXl多肽或者其變體或片段或融合的核酸，其中所述多肽的量或所述核酸的量在所述患者體內(nèi)可以有效地引起抗癌細(xì)胞免疫應(yīng)答。
所述肽或編碼肽的核酸組成腫瘤或癌癥疫苗?？梢詫⑵渲苯咏o予患者，進(jìn)入所影響的器官或全身性；或者先體外后體內(nèi)將其施用于來(lái)源于患者的細(xì)胞或人細(xì)胞系，隨后將所述來(lái)源于患者的細(xì)胞或人細(xì)胞系給予患者；或者其在體外用于從來(lái)源于患者的免疫細(xì)胞選擇亞群，然后將所述亞群重新給予患者。如果在體外將所述核酸給予細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以是有用的，以便共表達(dá)免疫刺激細(xì)胞因子，如白介素-2。FJXl多肽或肽片段可以是基本上純的，或者與諸如Detox的免疫刺激佐劑組合，或者與免疫刺激細(xì)胞因子聯(lián)用，或者用合適的遞送系統(tǒng)給予，例如脂質(zhì)體。
還可以將FJXl多肽或肽片段綴合至合適的癌癥，如鎮(zhèn)眼帽貝血藍(lán)蛋白(KLH)或甘露聚糖(參見 WO 95/18145 和 Longenecker et al (1993) Ann. NYAcad. Sci. 690，276-291)。 所述肽還可以標(biāo)記，或者是融合蛋白。所述核酸可以是基本上純的，或者包含在合適的載體或遞送系統(tǒng)中。合適的載體和遞送系統(tǒng)包括病毒，如基于腺病毒、牛痘病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、腺伴隨病毒或含有一種以上病毒的元件的雜種的系統(tǒng)。如DNA遞送領(lǐng)域所公知的， 非病毒遞送系統(tǒng)包括陽(yáng)離子脂質(zhì)和陽(yáng)離子聚合物。還可以使用物理遞送，如通過“基因槍”。 所述肽或核酸編碼的肽可以是融合蛋白，例如與β 2-微球蛋白。
用于癌癥疫苗的肽片段可以是FJXl多肽的任何合適長(zhǎng)度的片段。特別地，其可以是合適的9肽或者合適的7肽或8肽。更長(zhǎng)的肽也可以是合適的，但是優(yōu)選9肽。還可以使用來(lái)源于FJXl多肽的多個(gè)表位。術(shù)語(yǔ)肽包括肽模擬物。其還包括糖肽。
適當(dāng)?shù)?，給予患者的任何核酸或肽是無(wú)菌和無(wú)熱原的?？梢约∪鈨?nèi)或皮內(nèi)或皮下給予裸DNA。可以肌肉內(nèi)、皮內(nèi)或皮下給予所述肽。
以產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答的方式給予癌癥疫苗是特別有用的，所述細(xì)胞免疫應(yīng)答導(dǎo)致 NK細(xì)胞或細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)殺死細(xì)胞毒性腫瘤細(xì)胞。激活T輔助細(xì)胞的給藥策略特別有用。刺激體液應(yīng)答也是有用的。共給予某些細(xì)胞因子以促進(jìn)這樣的應(yīng)答可以是有用的，例如白介素-2、白介素-12、白介素-6或白介素-10。此外，聯(lián)合接種疫苗與增加腫瘤細(xì)胞表面呈遞的MHC的策略可以是有用的，例如，如Nouri et al (1992) Eur. J. Cancer 28A, 1110-1115 和 kliger et al (1997) Scand. J. Immunol. 46，625-632 所述通過共給予干擾素-Y或視黃酸。還可以期望修飾抗原(FJX1多肽或其部分)以增強(qiáng)其呈遞至免疫系統(tǒng)。
將疫苗靶向諸如抗原呈遞細(xì)胞的特定細(xì)胞群體也可以是有用的，通過注射部位、 使用打靶載體和遞送系統(tǒng)、或者從患者選擇性純化這樣的細(xì)胞群體并先體外后體內(nèi)給予所述肽或核酸(例如可以如 Zhou et al(1995)Blood 86,3295-3301 ；Roth et al (1996) Scand. J. Immunology 43，646-651所述分選樹狀細(xì)胞)。例如，打靶載體可以包含組織或腫瘤特異性啟動(dòng)子，其指導(dǎo)抗原在合適的位置表達(dá)。
給予治療的患者可以患有歸類為過量表達(dá)或異常表達(dá)FJXl的腫瘤。
本發(fā)明的另一方面提供了有效量的FJXl多肽或者其變體或融合或片段、或者有效量的編碼FJXl多肽或者其變體或片段或融合的核酸在制備用于治療鼻咽癌(NPC)的藥物中的用途。
在本發(fā)明的任一方面，提供了鼻咽癌(NPC)疫苗，其包含F(xiàn)JXl多肽或者其變體或片段、或者編碼FJXl多肽或者其片段或變體的核酸。已知用編碼多肽的諸如DNA疫苗的核酸疫苗接種導(dǎo)致T細(xì)胞應(yīng)答。特別地，可以引起MHC I類和II類介導(dǎo)的相互作用。
據(jù)信通過腫瘤特異性蛋白的片段的胞質(zhì)降解獲得、從頭表達(dá)的肽產(chǎn)物進(jìn)入呈遞途徑，在感染的細(xì)胞中模擬例如病毒蛋白的呈遞。據(jù)信在這個(gè)新的上下文中作為新抗原或替代抗原呈遞是打破免疫耐受的方法，并且可以導(dǎo)致腫瘤特異性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。
方便地，核酸疫苗可以包括任何合適的核酸遞送方法。優(yōu)選為DNA的核酸可以是裸的(即基本上沒有其他待給予的組分)，或者其可以在脂質(zhì)體中或作為病毒載體遞送系統(tǒng)的部分來(lái)遞送。
據(jù)信樹狀細(xì)胞吸收所述核酸并表達(dá)所編碼的多肽可以是引發(fā)免疫應(yīng)答的機(jī)制。
優(yōu)選將諸如DNA疫苗的疫苗給入肌肉。還優(yōu)選在皮膚上給予疫苗。
優(yōu)選與佐劑一起給予核酸疫苗，如BCG或明礬。其他合適的佐劑包括來(lái)源于皂苷的 Aquila' s QS21 刺激子(Aquila Biotech，Worcester，MA，USA)、分枝桿菌提取物和合成的細(xì)菌細(xì)胞壁模擬物，并且還可以使用專用佐劑，如另一皂苷來(lái)源的佐劑Ribi' s Detox. Quil A(Superfos, Denmark)ο
諸如Freimd' s的其他佐劑也可以是有用的。給予綴合至鎮(zhèn)眼帽貝血藍(lán)蛋白的 FJXl抗原也可以是有用的，優(yōu)選還與佐劑一起。
多核苷酸介導(dǎo)的癌癥的免疫治療如Conry et al (1996) Seminars in Oncology 23,135-147 ；Condon et al (1996)Nature Medicine 2,1122-1127 ；Gong et al(1997) Nature Medicine 3,558-561 ；Zhai et al(1996)J.Immunol. 156,700-710 ；Graham et al (1996)Int J. Cancer 65，664—670 ；禾口 Burchell et al(1996)pp 309—313 In =Breast Cancer, Advances in biology and therapeutics, Calvo et al (eds)，John Libbey Eurotext所述，所有均援引加入本文。
FJXl多肽是細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)表達(dá)FJXl多肽的癌癥或腫瘤細(xì)胞的應(yīng)答的適當(dāng)靶標(biāo)。
可以有效地監(jiān)測(cè)對(duì)癌癥疫苗的治療性應(yīng)答。適當(dāng)?shù)?，利用本領(lǐng)域公知的方法監(jiān)測(cè) FJXl特異性抗體和CTL應(yīng)答以評(píng)價(jià)治療性應(yīng)答的療效?？梢允褂昧馨湍讣?xì)胞轉(zhuǎn)化測(cè)定、淋巴因子釋放測(cè)定、CTL應(yīng)答測(cè)定和血清學(xué)測(cè)定。通過熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACQ監(jiān)測(cè)抗原特異性T淋巴細(xì)胞也可以使用，并且如Altman et al (1996) Science 274，94_96和WO 96/26962 所述。
優(yōu)選地，可以將本發(fā)明的核酸可檢測(cè)地標(biāo)記。例如，可以將它們以這樣的方式標(biāo)記，其中可以直接或間接檢測(cè)它們。方便地，用放射性部分或有色部分或熒光部分或一些其他合適的可檢測(cè)的部分，如地高辛配基(digoxygenin)以及發(fā)光或化學(xué)發(fā)光部分標(biāo)記所述核酸?？梢詫⒍嗪塑账徇B接至酶，或者可以將它們連接至生物素(或鏈親和素)，并且如對(duì)于本發(fā)明的抗體所述以相似的方式檢測(cè)。還優(yōu)選可以將本發(fā)明的核酸結(jié)合至固相支持體 (包括陣列、微珠、磁珠、樣品容器等)。
本發(fā)明的核酸還可以包含“標(biāo)簽”核苷酸序列，其中標(biāo)簽序列隨后可以被另一核酸探針識(shí)別。合適的標(biāo)記或標(biāo)簽還可以用于利用本領(lǐng)域公知的方法選擇性捕獲雜交(或非雜交)的多核苷酸。
在本發(fā)明的另一方面，提供了在患者中治療癌癥的方法，所述方法包括向所述患者給予調(diào)節(jié)FJXl基因或其產(chǎn)物活性的分子。
“調(diào)節(jié)FJXl基因或其產(chǎn)物活性”指激活、抑制、延遲、阻抑或干擾一種或多種；FJXl 活性；FJXl的RNA剪接或翻譯后加工；FJXl的磷酸化；包括mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)在內(nèi)的 FJXl的表達(dá)水平；或者FJXl的亞細(xì)胞定位。優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”指抑制FJXl的表達(dá)水平。
“治療癌癥”或“防治癌癥”包括治療、預(yù)防或改善癌癥的癥狀，并且還包括預(yù)防癌癥的復(fù)發(fā)。
優(yōu)選地，調(diào)節(jié)FJXl基因或其產(chǎn)物活性的分子為FJXl反義物質(zhì)、SiRNA或抗體。
“反義物質(zhì)”包括結(jié)合至FJXlmRNA并優(yōu)選抑制其翻譯的物質(zhì)；還包括結(jié)合至FJXl 基因并抑制其翻譯的物質(zhì)?？梢詤⒖糉JXl序列設(shè)計(jì)反義物質(zhì)。優(yōu)選地，所述反義物質(zhì)為寡核苷酸。
寡核苷酸被細(xì)胞內(nèi)源性核酸酶降解或失活。為了對(duì)付這個(gè)問題，可以使用修飾的寡核苷酸，例如具有改變的核苷酸間鍵，其中用另一鍵代替天然存在的磷酸二酯鍵。例如， Agrawal et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85，7079-7083 顯示利用寡核苷酸氨基磷酸酯和硫代磷酸酯在HIV-I的組織培養(yǎng)物中增加抑制。Sarin et al (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85，7448-7451證實(shí)利用寡核苷酸甲基膦酸酯增加HIV-1的抑制。Agrawal et al (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86，7790-7794顯示利用核苷酸序列特異性寡核苷酸硫代磷酸酯在早期感染和慢性感染的細(xì)胞培養(yǎng)物中抑制HIV-I復(fù)制。Leither et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87，3430-3434報(bào)道通過寡核苷酸硫代磷酸酯抑制流感病毒的組織培養(yǎng)物復(fù)制。
據(jù)證實(shí)具有人工鍵的寡核苷酸在體內(nèi)抗降解。例如，Shaw et al (1991) in Nucleic Acids Res. 19,747-750報(bào)道當(dāng)在3'端被某些加帽結(jié)構(gòu)封閉時(shí)，其他方面未修飾的寡核苷酸在體內(nèi)變得更抗核酸酶，并且未加帽的寡核苷酸硫代磷酸酯在體內(nèi)不降解。
Agrawal and Tang (1990) Tetrahedron Letters 31，7541-7544 提供了合成寡核苷硫代磷酸酯的H-磷酸酯法的詳述，其教學(xué)援引加入本文。本領(lǐng)域已知寡核苷甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯、橋聯(lián)氨基磷酸酯和橋硫代磷酸酯的合成。參見，例如，Agrawal and Goodchild(1987)Tetrahedron Letters 28,3539 ；Nielsen et al (1988) Tetrahedron Letters 29,2911 ；Jager et al(1988)Biochemistry 27, 7237 ；Uznanski et al (1987)Tetrahedron Letters 28,3401 ；Bannwarth(1988)Helv. Chim. Acta. 71,1517 ； Crosstick and Vyle (1989)Tetrahedron Letters 30,4693 ；Agrawal et al(1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87，1401-1405，其教學(xué)援引加入本文。用于合成或生產(chǎn)的其他方法也是可能的。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸為脫氧核糖核酸(DNA)，雖然也可以合成和應(yīng)用核糖核酸(RNA)序列。
在本發(fā)明中有用的寡核苷酸優(yōu)選設(shè)計(jì)為抗內(nèi)源性核酸降解酶的降解。寡核苷酸的體內(nèi)降解產(chǎn)生減少長(zhǎng)度的寡核苷酸分解產(chǎn)物。相對(duì)于其全長(zhǎng)對(duì)應(yīng)物，這類分解產(chǎn)物可能更多參與非特異性雜交，并且可能更少有效。因此，期望使用在體內(nèi)抗降解并且能夠到達(dá)靶細(xì)胞的寡核苷酸。可以通過用一種或多種內(nèi)部人工核苷酸間鍵取代天然磷酸二酯鍵，例如通過用硫代替鍵中的磷酸來(lái)使目前的寡核苷酸在體內(nèi)更抗降解。可以使用的鍵的實(shí)例包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、砜、硫酸、羰游基、二硫代磷酸酯、各種氨基磷酸酯、磷酸酯、橋聯(lián)硫代磷酸酯和橋聯(lián)氨基磷酸酯。這類實(shí)例是說明性而不是限制性的，因?yàn)楸绢I(lǐng)域已知其他核苷酸間鍵。參見，例如，Cohen，(1990)Trends in Biotechnology。具有取代磷酸二酯核苷酸間鍵的這些鍵的一種或多種的寡核苷酸的合成是本領(lǐng)域公知的，包括制備具有混合的核苷酸間鍵的寡核苷酸的合成途徑。
可以通過在5'或3末端核苷酸上“加帽”或包含相似基團(tuán)來(lái)使寡核苷酸抗內(nèi)源性酶的延伸。用于加帽的試劑可商購(gòu)，如來(lái)自Applied BioSystems Inc, Foster City, CA 的 Amino-Link II。加帽的方法如 Shaw et al (1991) Nucleic Acids Res. 19，747-750 和 Agrawal et al (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (17)，7595-7599 所述，其教學(xué)援引加入本文。
使寡核苷酸抗核酸酶攻擊的另一方法是如Tang et al (1993)Nucl. Acids Res.21，2729-2735所述使它們“自穩(wěn)定”，其援引加入本文。自穩(wěn)定的寡核苷酸在其3'端具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，并且表現(xiàn)出提高的抗蛇毒磷酸二酯酶、DNA聚合酶I和胎牛血清降解。寡核苷酸的自穩(wěn)定區(qū)不干擾與互補(bǔ)核酸雜交，并且小鼠中的藥物動(dòng)力學(xué)和穩(wěn)定性研究已證實(shí)了自穩(wěn)定的寡核苷酸相對(duì)于其線性對(duì)應(yīng)物增加的體內(nèi)持久性。
根據(jù)本發(fā)明，通過限制反義化合物對(duì)其體內(nèi)預(yù)期位點(diǎn)的可得性來(lái)提高反義寡核苷酸堿基配對(duì)特征固有的結(jié)合特異性，允許使用較低劑量并最小化全身效應(yīng)。
因此，局部應(yīng)用寡核苷酸以達(dá)到期望效果。在期望位點(diǎn)的寡核苷酸的濃度比全身性給予寡核苷酸的高很多，并且可以利用顯著較低的總量達(dá)到治療效果。
局部高濃度的寡核苷酸增加靶細(xì)胞的侵入并有效阻斷靶核酸序列的翻譯。
可以通過任何適合藥物的定位給予的方法將寡核苷酸遞送至所述位點(diǎn)。例如，可以將寡核苷酸的溶液直接注射至所述部位，或者可以利用輸液泵通過輸液來(lái)遞送。還可以將寡核苷酸并入植入裝置，當(dāng)放置在期望部位時(shí)其允許將寡核苷酸釋放入周圍位點(diǎn)。
最優(yōu)選通過水凝膠材料給予寡核苷酸。水凝膠是非炎性和生物可降解的。現(xiàn)在已知很多這樣的材料，包括由天然和合成聚合物制成的材料。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法利用水凝膠，其在低于體溫下為液體，但是在達(dá)到或接近體溫下凝膠以形成保持形狀的半固體水凝膠。優(yōu)選的水凝膠為環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷重復(fù)單元的聚合物。聚合物的特性取決于聚合物的分子量以及聚合物中聚環(huán)氧乙烷和聚環(huán)氧丙烷的相對(duì)百分率。優(yōu)選的水凝膠含有約10至約80重量％環(huán)氧乙烷和約20至約90重量％環(huán)氧丙烷。特別優(yōu)選的水凝膠含有約 70%聚環(huán)氧乙烷和30%聚環(huán)氧丙烷?？梢允褂玫乃z可從例如BASF Corp. ,Parsippany, NJ獲得，商品名為PluronicR。
在這個(gè)實(shí)施方案中，將水凝膠冷卻至液體狀態(tài)，并且將寡核苷酸混合入該液體至約Img寡核苷酸每克水凝膠的濃度。然后將所得的混合物施用至待治療的表面，例如在手術(shù)期間通過噴灑或涂抹或者利用導(dǎo)管或內(nèi)窺鏡術(shù)。當(dāng)該聚合物變暖時(shí)，其固化以形成凝膠， 并且在所述凝膠的確切組成所確定的時(shí)間內(nèi)擴(kuò)散出所述凝膠進(jìn)入周圍細(xì)胞。
可以通過可商購(gòu)或科學(xué)文獻(xiàn)所述的其他植入物給予寡核苷酸，包括脂質(zhì)體、微膠囊和植入裝置。例如，由生物可降解材料或非生物可降解材料制成的植入物可以用于局部遞送寡核苷酸，所述生物可降解材料如聚酐、聚原酸酯、聚乳酸和聚乙醇酸及其共聚物，膠原，以及蛋白聚合物，所述非生物可降解材料如乙烯乙酸乙烯酯(EVAc)、聚乙酸乙烯酯、乙烯乙烯醇及其衍生物。利用熔解或溶劑蒸發(fā)技術(shù)，當(dāng)其聚合或固化時(shí)將寡核苷酸并入所述材料，或者將寡核苷酸與所述材料機(jī)械混合。在一實(shí)施方案中，將寡核苷酸混合入或施用至植入裝置的包衣，如葡聚糖包被的硅珠、支架或?qū)Ч堋?br> 寡核苷酸的劑量取決于寡核苷酸的大小和給予寡核苷酸的目的。通常，基于待治療的組織的表面面積計(jì)算范圍。寡核苷酸的有效劑量有點(diǎn)取決于寡核苷酸的長(zhǎng)度和化學(xué)組成，但是一般在約30-3000ug/平方厘米組織表面面積的范圍內(nèi)。
為了治療和預(yù)防目的，可以將寡核苷酸全身性給予患者?？梢酝ㄟ^任何有效方法給予寡核苷酸，例如，腸胃外(例如靜脈、皮下、肌肉內(nèi))或者通過口服、鼻或允許寡核苷酸進(jìn)入患者血流并循環(huán)的其他方式。優(yōu)選除局部給予的寡核苷酸之外給予全身性給予的寡核苷酸，但是在局部給藥不存在的情況下全身性給予的寡核苷酸也具有效用。為了這個(gè)目的， 約0. 1至約10克每次給予成人的范圍內(nèi)的劑量一般是有效的。
從上文所述應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明考慮使用多核苷酸或抗體檢測(cè)表達(dá)FJXl的細(xì)胞。
本發(fā)明的另一方面提供了調(diào)節(jié)FJXl基因或其產(chǎn)物活性的分子在制備用于防治癌癥的藥物中的用途。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了在患者體內(nèi)防治癌癥的方法，所述方法包括向所述患者給予針對(duì)FJXl的抗體。
隨著抗體技術(shù)的進(jìn)步，應(yīng)當(dāng)理解可以不必免疫動(dòng)物以產(chǎn)生抗體?？梢允褂煤铣上到y(tǒng)，如噬菌體展示文庫(kù)。使用這類系統(tǒng)包括在本發(fā)明的方法之內(nèi)。
可以制備會(huì)結(jié)合至FJXl抗原的單克隆抗體?？乖Y(jié)合部分可以是部分抗體(例如 Fab片段)或合成的抗體片段(例如單鏈Fv片段[ScFv])?？梢酝ㄟ^已知的技術(shù)制備所選抗原的合適的單克隆抗體，例如"Monoclonal Antibodies :A manual of techniques"， H Zola(CRC Press,1988)禾口 “ Monoclonal Hybridoma Antibodies :Techniques and Applications" ,JGR Hurrell (CRC Press, 1982)所公開的技術(shù)。
Neuberger et al(1988,8th International Biotechnology Symposium Part 2, 792-799)討論了嵌合(Chimaeric)抗體。
可以已知的方法將適當(dāng)制備的非人抗體“人源化”，例如通過將小鼠抗體的⑶R區(qū)插入人抗體的框架。
最初由早期蛋白酶消化實(shí)驗(yàn)所認(rèn)識(shí)的事實(shí)，抗體的可變重(Vh)和可變輕結(jié)構(gòu)域參與抗原識(shí)別。嚙齒類動(dòng)物抗體的“人源化”發(fā)現(xiàn)了進(jìn)一步的證據(jù)?？梢詫X類動(dòng)物來(lái)源的可變結(jié)構(gòu)域融合至人來(lái)源的恒定結(jié)構(gòu)域，從而所得的抗體保留了嚙齒類動(dòng)物親本抗體的抗原特異性(Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,6851-6855)。
從包括全部含有一個(gè)或多個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的抗體片段的細(xì)菌表達(dá)的實(shí)驗(yàn)已知抗原特異性是由可變結(jié)構(gòu)域所賦予的，并且獨(dú)立于恒定結(jié)構(gòu)域。這些分子包括Fab樣分子(Better et al (1988)Science 240,1041) ；Fv 分子(Skerra et al (1988)Science 240,1038)；其中通過柔性寡肽連接V1^Pt伙伴結(jié)構(gòu)域的單鏈Fv(ScFv)分子(Bird et al (1988)Science 242,423 ；Huston et al (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,5879)以及包含分離的V結(jié)構(gòu)域的單域抗體(dAb) (Ward et al (1989)Nature 341,544)。保留其特異性結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段的合成所涉及的技術(shù)的全面綜述可見Winter & Milstein (1991) Nature 349，293-299。
"ScFv分子表示這樣的分子，其中通過柔性寡肽連接Vh和\伙伴結(jié)構(gòu)域。
Fab、Fv, ScFv和dAb抗體片段均可以從例如大腸桿菌(E. coli)制備和表達(dá)和分泌，因此允許很容易生產(chǎn)大量所述片段。
全抗體和F(ab' )2片段是“二價(jià)”的?！岸r(jià)”表示所述抗體和F(ab' ) 2具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。相比之下，F(xiàn)ab、Fv, ScFv和dAb片段是單價(jià)的，僅具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)ο
可以用直接或間接細(xì)胞毒性物質(zhì)標(biāo)記抗體。先前已將各種這類物質(zhì)連接至抗體和靶位點(diǎn)遞送劑，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易制備。特別地，優(yōu)選細(xì)胞毒性物質(zhì)對(duì)新生血管中的細(xì)胞或與新生血管靠近并相關(guān)的細(xì)胞直接或間接有毒。
“直接細(xì)胞毒性”表示物質(zhì)本身是細(xì)胞毒性的。“間接細(xì)胞毒性”表示物質(zhì)雖然本身沒有細(xì)胞毒性，但是可以誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，例如通過其對(duì)另一分子作用或者通過對(duì)其的進(jìn)一步作用。
在一實(shí)施方案中，所述細(xì)胞毒性物質(zhì)為細(xì)胞毒性化療物質(zhì)。細(xì)胞毒性化療物質(zhì)是本領(lǐng)域公知的。
細(xì)胞毒性化療物質(zhì)，如抗癌物質(zhì)，包括烷化劑，包括氮芥，如氮芥(HN2)、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、美法侖(L-溶肉瘤素)和苯丁酸氮芥；乙烯亞胺和甲基蜜胺，如六甲蜜胺、 塞替派；烷基磺酸鹽，如白消安；亞硝基脲，如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀 (甲基-CCNU)和鏈佐星(鏈脲佐菌素)；以及三氮烯，如達(dá)卡巴嗪(decartazine) (DTIC ； 二甲基三氮烯咪唑-羧酰胺)；抗代謝藥，包括葉酸類似物，如甲氨蝶呤(methotrexate) (甲氨蝶呤(amethopterin))；嘧啶類似物，如氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶；5-FU)、氟尿苷(氟脫氧尿苷；FUdR)和阿糖胞苷(cytarabine)(阿糖胞苷(cytosine arabinoside))；以及嘌呤類似物和相關(guān)抑制劑，如巰嘌呤(6-巰嘌呤；6-MP)、巰鳥嘌呤(6-巰鳥嘌呤；TG)和噴司他丁(2-脫氧考福霉素)。天然產(chǎn)物包括長(zhǎng)春花生物堿，如長(zhǎng)春堿(VLB)和長(zhǎng)春新堿； 表鬼臼毒素，如依托泊苷和替尼泊苷；抗生素，如放線菌素DWactinomycin)(放線菌素 D(actinomycin D))、柔紅霉素(道諾霉素；紅比霉素)、多柔比星、博來(lái)霉素、普卡霉素(光神霉素)和絲裂霉素(絲裂霉素C)；酶，如L-天冬酰胺酶；以及生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，如干擾素 alphenome.不同種類的物質(zhì)包括鉬配位化合物，如順鉬(cis_DDP)和卡鉬；蒽二酮，如米托蒽醌和蒽環(huán)霉素；取代脲，如羥基脲；甲基胼衍生物，如丙卡巴胼(N-甲基胼，MIH)；以及腎上腺皮質(zhì)抑制劑，如米托坦(ο，PN-DDD)和氨魯米特；紫杉醇及類似物/衍生物；以及激素激動(dòng)劑/拮抗劑，如氟他胺和他莫昔芬。
連接至抗體的細(xì)胞毒性物質(zhì)的實(shí)例為碳二亞胺綴合(Bauminger & Wilchek(1980)Methods Enzymo 1. 70，151-159 ；援引加入本文)，可以用于將包括多柔比星在內(nèi)的各種物質(zhì)綴合至抗體或肽。
碳二亞胺包括具有通式R-N = C = N-RN的一組化合物，其中R和RN可以是脂肪族或芳香族的，并且碳二亞胺用于肽鍵的合成。制備過程簡(jiǎn)單、相對(duì)快速，并且在溫和條件下進(jìn)行。碳二亞胺化合物攻擊羧基以將它們改變?yōu)橛坞x氨基的反應(yīng)位點(diǎn)。
水溶性碳二亞胺1-乙基-3-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)特別有利于將功能劑綴合至結(jié)合劑，并且可以用于將多柔比星綴合至腫瘤歸巢肽。多柔比星與結(jié)合部分的綴合需要氨基和羧基的存在，所述氨基由多柔比星提供，所述羧基由諸如抗體或肽的結(jié)合部分提供。
除了將碳二亞胺用于肽鍵的直接形成，EDC還可以用于制備活性酯，如N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯。然后僅結(jié)合至氨基的NHS酯可以用于誘導(dǎo)與多柔比星的單個(gè)氨基形成酰胺鍵。EDC和NHS的聯(lián)合使用通常用于綴合以增加綴合物形成的產(chǎn)量(Bauminger & ffilchek, supra,1980)。
還可以使用將功能劑綴合至結(jié)合劑的其他方法。例如，可以使用高碘酸鈉氧化然后還原烷基化適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)物，如可以戊二醛交聯(lián)。然而，應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，無(wú)論選擇哪個(gè)方法產(chǎn)生本發(fā)明的綴合物，必須確定結(jié)合部分保持其靶向能力并且功能部分保持其相關(guān)功能。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，所述細(xì)胞毒性部分為細(xì)胞毒性肽或多肽部分，包括導(dǎo)致細(xì)胞死亡的任何部分。細(xì)胞毒性肽和多肽部分是本領(lǐng)域公知的，并且包括，例如， 蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、假單胞菌O^eudomonas)外毒素、組織因子等。用于將它們連接至抗體的方法也是本領(lǐng)域已知的。蓖麻毒蛋白作為細(xì)胞毒性物質(zhì)的用途如Burrows & Thorpe (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90,8996-9000 所述，援引加入本文，而導(dǎo)致局部凝血和腫瘤梗塞的組織因子的用途如Ran et al (1998)Cancer Res. 58，4646-4653和 Huang et al (1997)Science 275，547—550 所述。Tsai et al (1995)Dis. Colon Rectum 38，1067-1074描述了綴合至單克隆抗體的相思豆毒蛋白A鏈，并且援引加入本文。WO 96/06641描述了作為細(xì)胞毒性物質(zhì)的其他核糖體失活蛋白。假單胞菌外毒素也可以用作細(xì)胞毒性多肽劑(參見，例如，Aiello et al (1995)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92， 10457-10461 ；援引加入本文)。
某些細(xì)胞因子也可以用作細(xì)胞毒性物質(zhì)，如TNFI和IL-2。
如果以足夠劑量遞送，某些放射性原子也可以是細(xì)胞毒性的。因此，所述細(xì)胞毒性物質(zhì)還包括放射性原子，使用中其將足量的放射性遞送至靶位點(diǎn)，從而是細(xì)胞毒性的。合適的放射性原子包括磷-32、碘-125、碘-131、銦-111、錸-186、錸-188或釔-90，或者發(fā)射足夠能量以破壞相鄰細(xì)胞、細(xì)胞器或核酸的任何其他放射性核素。優(yōu)選地，本發(fā)明的化合物中的放射性原子的放射性核素和密度是這樣的，將超過4000cGy (優(yōu)選至少6000、8000或IOOOOcGy)的劑量遞送至靶位點(diǎn)，并且優(yōu)選至靶位點(diǎn)處的細(xì)胞和它們的細(xì)胞器，優(yōu)選細(xì)胞核。
可以已知的方法將放射性原子連接至結(jié)合劑。例如可以將EDTA或另一螯合劑連接至結(jié)合部分并用于連接111L或’?？梢杂?25I或131I標(biāo)記酪氨酸殘基。
所述細(xì)胞毒性物質(zhì)可以是合適的間接細(xì)胞毒性多肽。在一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述間接細(xì)胞毒性多肽是具有酶促活性并可以將相對(duì)無(wú)毒的前體藥物轉(zhuǎn)換為細(xì)胞毒性藥物的多肽。當(dāng)靶向部分為抗體時(shí)，這種類型的系統(tǒng)常被稱為ADEPT(抗體導(dǎo)向酶前體藥物療法)。該系統(tǒng)需要靶向部分將酶促部分定位至患者體內(nèi)的期望部位(即表達(dá)15-整聯(lián)蛋白的部位，如與腫瘤相關(guān)的新血管組織)，并且在酶定位于該部位所允許的時(shí)間之后， 給予是該酶的底物的前體藥物，催化的終產(chǎn)物為細(xì)胞毒性化合物。該方法的目的是最大化在期望部位的藥物濃度并最小化正常組織中的藥物濃度(參見knter，P. D. et al (1988) Anti-tumour effects of antibody-alkaline phosphatase conjugates in combination with etoposide phosphate Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,4842-4846 ；Bagshawe (1987) Br. J. Cancer 56，531-2;禾口 Bagshawe，K. D. et al (1988). A cytotoxic agent can be generated selectively at cancer sites Br. J. Cancer. 58,700-703.)
所述細(xì)胞毒性物質(zhì)可以是輻射敏化劑。輻射敏化劑包括氟嘧啶、胸苷類似物、 羥基脲、吉西他濱、氟達(dá)拉濱、煙酰胺、鹵代嘧啶、3-氨基苯甲酰胺、3-氨基苯并二酰胺 (3-aminobenzodiamide)、依他硝唑(etanixadole)、哌莫硝唑和米索硝唑(參見，例如， McGinn et al (1996)J. Natl. Cancer Inst. 88,1193-11203 ；Shewach & Lawrence(1996) Invest. New Drugs 14,257-263 ；Horsman(1995)Acta Oncol. 34,571-587 ；Shenoy & Singh(1992)Clin. Invest. 10,533—551 ；Mitchell et al (1989) Int. J. Radiat. Biol. 56， 827-836 ；Iliakis & Kurtzman(1989)Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16,1235-1241 ； Brown (1989)Int.J.Radiat. Oncol. Biol. Phys. 16,987-993 ；Brown(1985)Cancer 55, 2222-2228)。
而且，將基因遞送至細(xì)胞可以使它們輻射敏感，例如遞送p53基因或細(xì)胞周期蛋白 D(Lang et al(1998)J. Neurosurg. 89,125-132 ；Coco Martin et al (1999)Cancer Res.59，1134-1140)
本發(fā)明的另一方面提供了在患者中治療癌癥的方法，所述方法包括向所述患者給予結(jié)合至FJXl的分子。在本發(fā)明中，所述分子一旦被給予至所述換則即結(jié)合至FJXl。
本發(fā)明的另一方面提供了針對(duì)FJXl的抗體在準(zhǔn)備用于防治癌癥的藥物中的用途。
本發(fā)明的其他方面提供了用于醫(yī)藥的結(jié)合至本發(fā)明的FJXl的多肽、抗體、核酸和分子。在本發(fā)明中，所述分子一旦被給予至所述換則即結(jié)合至FJXl。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種試劑盒，其用于輔助評(píng)價(jià)患者發(fā)展癌癥的風(fēng)險(xiǎn)、或者癌癥進(jìn)展的嚴(yán)重性可能性或似然性、或者輔助選擇患者的癌癥治療方案、或者輔助評(píng)價(jià)癌癥治療方案，所述試劑盒包含至少一種用于測(cè)定選自FJXl的至少一種基因的表達(dá)水平的量的試劑，以及含有使用所述試劑盒的說明的包裝說明書。
優(yōu)選地，用于檢測(cè)的試劑為一種或多種寡核苷酸引物。更優(yōu)選地，所述一種或多種寡核苷酸引物包含任一種核苷酸序列、基本上由任一種核苷酸序列組成或者由任一種核苷酸序列組成。
優(yōu)選地，所述試劑盒為陣列或芯片。
隨著微陣列技術(shù)的出現(xiàn)，現(xiàn)在可以同時(shí)研究數(shù)千個(gè)基因的基因表達(dá)，以便亞分類癌癥、比較進(jìn)展的不同階段的疾病的遺傳變化或者鑒定可以用作預(yù)后指標(biāo)的基因(Golub et al, 1999 ；van' t Veer et al，2002)。
在本發(fā)明中，測(cè)定了 NPC的基因表達(dá)譜，并且鑒定了在推動(dòng)NPC發(fā)展中可能重要的基因。NPC和非惡性對(duì)照樣品之間顯著改變的基因表達(dá)模式不同，從而證實(shí)NPC發(fā)展與特定基因的激活/失活有關(guān)。
現(xiàn)在會(huì)參考以下非限制性實(shí)施例描述本發(fā)明。
本文所提到的所有參考文獻(xiàn)援弓I加入本文。
實(shí)施例
現(xiàn)在會(huì)利用以下實(shí)施例更詳細(xì)地解釋本發(fā)明，所述實(shí)施例是本發(fā)明的一些實(shí)施方案。實(shí)施例僅為了說明，并且本發(fā)明不以任何方式受限于這些實(shí)施例。
材料和方法
組織樣品
將來(lái)自患有組織學(xué)證實(shí)的未分化的NPC的25名患者的速凍鼻咽活檢包括在微陣列分析之內(nèi)。對(duì)照獲得自3名患者，全部EB病毒編碼的RNA(EBER)陰性并且無(wú)惡性證據(jù)(正常鼻咽上皮細(xì)胞)，來(lái)自Tung Shin Hospital, Kuala Lumpur，Malaysia。使用另外的30個(gè)石蠟包埋NPC組織樣品和10個(gè)非惡性鼻咽的活檢，這些包括Nilai Cancer Institute, Negeri Sembilan, Malaysia的合作者提供的樣品。人組織樣品的工作由I\mg Shin Hospital 批準(zhǔn)。
微陣列分析
利用TRIzol試劑anvitrogen，USA)從活檢樣品提取RNA，并且通過RNeasy Mini 試劑盒(Qiagen, UK)純化。利用標(biāo)準(zhǔn) Affymetrix 方案(Affymetrix, USA)將 cDNA 合成、 體外轉(zhuǎn)錄、標(biāo)記并雜交至 Affymetrix HG-U133A GeneChip。利用 Affymetrix GenChip 操作軟件(GCOS)用默認(rèn)設(shè)置分析微陣列芯片的掃描圖像，除了將靶信號(hào)設(shè)置為100。利用默認(rèn)設(shè)置的GCOS變化算法鑒定NPC和正常對(duì)照樣品之間差異表達(dá)的基因。如果與所有正常樣品比較時(shí)稱為“增加”或“減少”，則考慮NPC樣品中的基因是差異表達(dá)的。原始數(shù)據(jù)可從 GEO (http //www. ncbi. nih. gov/geo/)獲得，系列登錄號(hào) GSE 13597。
為了驗(yàn)證微陣列分析的結(jié)果，對(duì)提取的RNA進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR(qPCR)。此外，利用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察所關(guān)注的蛋白的表達(dá)。
定量實(shí)時(shí)PCR
利用寡(dT)引物和Superscript II (Invitrogen, USA) Hlyg 總 RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。利用ABI STOR綠色PCR試劑盒(Applied Biosystems, USA)按照制造商的方案進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，三個(gè)重復(fù)。簡(jiǎn)單地說，反應(yīng)混合物含有IOOng cDNA、lyM基因特異性引物和25μ 1 2x STOR綠色PCR預(yù)混液。熱循環(huán)條件為50°C 2分鐘、95°C 10分鐘并且在95°C 15秒40 個(gè)循環(huán)，然后60°C 1分鐘。包括非模板對(duì)照以評(píng)價(jià)反應(yīng)的總體特異性。平行的，在相同反應(yīng)中擴(kuò)增GAPDH以作為內(nèi)參用于歸一化。用于FJX1的引物為5，CCCGCAAAGGTGTCTAAAAACT3， 和 5， TGCTGGCACAGTAAAGAATCCT3，，而 GAPDH 引物為 5， AAGGTGAAGGTCGGAGT3，和5’ GAAGATGGTGATGGGATTTC3’。利用比較閾值循環(huán)法(Δ Δ Ct)測(cè)量正常和腫瘤樣品之間基因表達(dá)的倍數(shù)變化。與對(duì)照相比，當(dāng)通過雙尾T測(cè)試的ρ值低于0.01時(shí)，認(rèn)為NPC中FJXl 表達(dá)顯著上調(diào)。
免疫組織化學(xué)
利用Dakocytomation Envision +Dual Link 系統(tǒng)-過氧化物酶(DAB+)試劑盒 (Dako,USA)根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)。簡(jiǎn)單地說，將來(lái)自微陣列分析所包括的標(biāo)本的石蠟包埋組織的5 μ m切片通過2次二甲苯孵育脫蠟，每次5分鐘，并且在梯度乙醇中再水化，每次3分鐘。為了抗原修復(fù)，在微波爐中用IOmM檸檬酸鈉pH 6. O處理組織切片10分鐘。在室溫下將切片與兔多克隆抗FJXl抗體(1 500 ；AVIVA Systems Biology, USA)孵育，然后與綴合至山羊抗兔抗體的過氧化物酶標(biāo)記的聚合物孵育，每次30分鐘。利用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)作為色原將過氧化物酶反應(yīng)顯影。還進(jìn)行陰性對(duì)照，其中非免疫血清用于代替一抗。當(dāng)腫瘤細(xì)胞中沒有染色或者腫瘤細(xì)胞中的染色強(qiáng)度與周圍非惡性細(xì)胞中所觀察到的相等時(shí)，將腫瘤分級(jí)為FJXl陰性；并且當(dāng)腫瘤細(xì)胞中的染色強(qiáng)度強(qiáng)于周圍非惡性細(xì)胞時(shí)，將腫瘤分級(jí)為FJXl陽(yáng)性。
結(jié)果
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為了鑒定NPC中轉(zhuǎn)錄失調(diào)的基因，利用Affymetrix HG-U133A陣列檢測(cè)了 25個(gè) NPC樣品和3個(gè)無(wú)癌癥對(duì)照樣品的基因表達(dá)譜。每個(gè)NPC腫瘤與所有3個(gè)對(duì)照樣品中基因表達(dá)的成對(duì)比較顯示在5個(gè)或更多個(gè)腫瘤中1963個(gè)基因顯著失調(diào)，其中472個(gè)下調(diào)并且 1491個(gè)上調(diào)。
NPC 中 FJXl 上調(diào)
微陣列分析顯示在14/25 (56% )個(gè)腫瘤中FJXlmRNA顯著上調(diào)。定量實(shí)時(shí)PCR證實(shí)了該結(jié)果，其顯示在所分析的全部14個(gè)NPC組織樣品中FJXlmRNA水平均升高(圖2)。
通過免疫組織化學(xué)在39個(gè)福爾馬林固定的石蠟包埋的原發(fā)NPC和10個(gè)非惡性鼻咽樣品中檢測(cè)FJXl的表達(dá)。在所檢測(cè)的43%腫瘤(39個(gè)中的17個(gè))中檢測(cè)到FJXl過量表達(dá)，并且范圍從弱和病灶(focal)至強(qiáng)和彌散性(圖3)。非惡性對(duì)照一致為陰性。
ιΗ常重要器官中的FJXl表達(dá)
利用包含來(lái)自16個(gè)不同器官的cDNA的多組織cDNA板進(jìn)一步分析正常人器官中的FJXl表達(dá)?？偟膩?lái)說，F(xiàn)JXl在所分析的大部分器官中表現(xiàn)出可以忽略的表達(dá)，除了卵巢、 胰、胎盤和小腸(圖4)，表明靶向FJXl極不可能引起威脅生命的不良事件。
權(quán)利要求
1.一種在得自對(duì)象的生物學(xué)樣品中評(píng)價(jià)癌癥的方法，所述方法包括以下步驟(a)測(cè)定所述生物學(xué)樣品中預(yù)定基因的表達(dá)水平；和(b)將測(cè)定的所述基因表達(dá)水平與參照物中的水平比較，其中所述預(yù)定基因?yàn)樗倪B接框I(FJXl)；并且其中表達(dá)水平的差異可以指示癌細(xì)胞的存在。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法還包括測(cè)定得自所述對(duì)象的所述生物學(xué)樣品中的FJXl的RNA水平的步驟。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述FJXl的RNA水平通過使用包含以下序列的至少兩種寡核苷酸引物或者互補(bǔ)鏈中它們的同源物來(lái)測(cè)定SEQ ID NO. 1 :5’ CCCGCAAAGGTGTCTAAAAACT3，；禾口SEQ ID NO. 2 :5’ TGCTGGCACAGTAAAGAATCCT3，。
4.如權(quán)利要求2和3所述的方法，其中所述RNA為mRNA。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法還包括測(cè)定得自所述對(duì)象的所述生物學(xué)樣品中的FJXl的蛋白表達(dá)水平。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述參照物為正常或非惡性細(xì)胞或組織。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述癌癥為鼻咽癌(NPC)或口腔鱗狀細(xì)胞癌 (OSCC)。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述生物學(xué)樣品可以得自所述對(duì)象的鼻咽組織、鼻咽拭子、口腔粘膜組織、唾液或漱口水。
9.一種在對(duì)象中檢測(cè)癌癥的方法，所述方法包括向所述對(duì)象給予用可檢測(cè)的標(biāo)記所標(biāo)記的抗FJXl抗體或者其片段或衍生物，使得所標(biāo)記的抗體定位至癌細(xì)胞并使癌細(xì)胞成像。
10.抗FJXl抗體或者其片段或衍生物用于檢測(cè)癌癥的用途，其中所述抗FJXl抗體是用可檢測(cè)的標(biāo)記所標(biāo)記的，并且可結(jié)合至癌細(xì)胞。
11.一種在患者中治療癌癥的方法，所述方法包括向所述患者給予有效量的FJXl多肽或者其變體或融合物或片段，其中所述有效量足以在所述患者體內(nèi)引起抗癌細(xì)胞免疫應(yīng)答。
12.FJXl多肽或者其變體或融合物或片段在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。
13.如權(quán)利要求12所述的用途，其中所述癌癥為鼻咽癌(NPC)或口腔鱗狀細(xì)胞癌 (OSCC)。
14.一種癌癥疫苗，其包含F(xiàn)JXl多肽或者其變體或片段。
15.一種在患者中治療癌癥的方法，所述方法包括向所述患者給予調(diào)節(jié)FJXl基因或其產(chǎn)物活性的分子。
16.如權(quán)利要求15所述的在患者中治療癌癥的方法，其中所述產(chǎn)物為RNA或蛋白。
17.如權(quán)利要求15所述的在患者中治療癌癥的方法，其中調(diào)節(jié)FJX1基因或其產(chǎn)物活性的所述分子為FJXl反義物質(zhì)、siRNA或抗體。
18.調(diào)節(jié)FJXl基因或其產(chǎn)物活性的分子在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。
19.一種在患者中治療癌癥的方法，所述方法包括向所述患者給予針對(duì)FJXl的抗體。
20.針對(duì)FJXl的抗體在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。
21.如權(quán)利要求20所述的用途，其中所述抗體是用直接或間接細(xì)胞毒性物質(zhì)標(biāo)記的。
22.如權(quán)利要求21所述的用途，其中所述細(xì)胞毒性物質(zhì)為直接細(xì)胞毒性化療物質(zhì)。
23.如權(quán)利要求21所述的用途，其中所述細(xì)胞毒性物質(zhì)為直接細(xì)胞毒性多肽。
24.如權(quán)利要求21所述的用途，其中所述細(xì)胞毒性物質(zhì)是能夠?qū)⑾鄬?duì)無(wú)毒的前體藥物轉(zhuǎn)換為細(xì)胞毒性藥物的物質(zhì)。
25.如權(quán)利要求21所述的用途，其中所述細(xì)胞毒性物質(zhì)為輻射敏化劑。
26.—種在患者中治療癌癥的方法，所述方法包括向所述患者給予結(jié)合至FJXl的分子。
27.結(jié)合至FJXl的分子在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。
28.一種用于測(cè)定FJXl基因的表達(dá)水平的試劑盒，所述試劑盒含有至少一對(duì)包含SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2序列的寡核苷酸引物對(duì)。
29.如權(quán)利要求觀所述的用于測(cè)定FJXl基因的表達(dá)水平的試劑盒，其中所述試劑盒為陣列或芯片。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過測(cè)定基因四連接框1(FJX1)的表達(dá)水平來(lái)輔助評(píng)價(jià)和診斷癌癥的方法。本發(fā)明的方法可以用于輔助評(píng)價(jià)癌癥，特別是鼻咽癌(NPC)和口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)。本發(fā)明還涉及多肽、抗體和核酸在制備用于治療癌癥的藥物和用于進(jìn)行本發(fā)明的方法的試劑盒中的用途。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102498219SQ201080026796
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2010年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月15日
發(fā)明者葉麗華, 張素芳, 穆哈莫德·曼都·阿邁德札吡迪 申請(qǐng)人:癌癥學(xué)術(shù)基金會(huì)