專利名稱：來自環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及β-半乳糖苷酶。具體而言，涉及從環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)中分離出的新型β _半乳糖苷酶及其基因以及其用途等。本發(fā)明的β _半乳糖苷酶例如可用作低乳糖牛奶的制造、作為腸內(nèi)雙歧桿菌生長(zhǎng)因子的低聚半乳糖的制造、或者乳糖不耐受癥患者用的藥品或補(bǔ)充劑的有效成分。本申請(qǐng)基于2009年6月5日提出的日本國(guó)專利申請(qǐng)第2009-136735號(hào)要求優(yōu)先權(quán)，并將該專利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過參照而援引于此。
背景技術(shù)：
β -半乳糖苷酶(EC3. 2. 1. 23)是水解β _D_半乳糖苷鍵而使D-半乳糖游離的酶， 一般廣泛存在于微生物和動(dòng)植物中。β -半乳糖苷酶的別名也稱為乳糖酶，作為用于制造來自制造乳糖不耐受癥用的低乳糖牛奶、奶酪時(shí)副產(chǎn)的乳清的乳清糖漿的酶，或者作為乳糖不耐受癥患者用的藥品、補(bǔ)充劑的有效成分而使用。另外，半乳糖苷酶還具有轉(zhuǎn)移半乳糖苷鍵的能力，已知有利用該能力制造低聚半乳糖(具有半乳糖殘基的寡糖)的方法。作為用于這些用途的β-半乳糖苷酶，已知米曲霉(Aspergillus oryzae)、乳酸克魯維酵母 (Kluyveromyces lactis)、馬克斯克魯維酵母(K. marxinus)、細(xì)菌環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)等。其中，對(duì)于環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶，由Mozaffer等(非專利文獻(xiàn)1)、 Vetere等(非專利文獻(xiàn)2、、Ito等(非專利文獻(xiàn)3、4)進(jìn)行了研究。根據(jù)非專利文獻(xiàn)1，報(bào)告了分子量為240kDa和160kDa的2種酶的純化。并且報(bào)告了，前者的分解活性高，后者的半乳糖轉(zhuǎn)移活性高，另外前者對(duì)于合成底物對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)的分解活性比對(duì)于乳糖的分解活性高。另一方面，根據(jù)非專利文獻(xiàn)2，報(bào)告了分子量212kDa、 145kDa和86kDa的3種酶的純化。但是，不清楚這些多種酶的相互的蛋白質(zhì)化學(xué)相關(guān)性、分子生物學(xué)(基因的)特性。另外，在非專利文獻(xiàn)3、4中報(bào)告了 67kDa的酶的基因克隆和重組蛋白質(zhì)的性質(zhì)，但該酶是對(duì)β _1，3鍵特異的酶，對(duì)牛奶中的乳糖中的鍵β _1，4鍵沒有作用。因此，是與在牛奶、來自牛奶的乳糖的處理中使用的通常的半乳糖苷酶不同的酶。 另外，基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank)中登錄有2種來自環(huán)狀芽孢桿菌的β _半乳糖苷酶基因(基因數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)(GenBank accession number)L034M和L03425)，但對(duì)于它們，僅報(bào)告了基因序列，不清楚是否編碼實(shí)際具有活性的蛋白質(zhì)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)# # ^lJ i K 1 :Mozaffar, Ζ. ， Nakanishi, K. ， Matsuno, R. ， and Kami kubo, Τ. Agric. Biol. Chem.，48 (12)，3053-3061，1984# 專禾Ij JC 2 :Vetere, A. , and Paoletti, S. Biochem. Biophys. Acta., 1380，223-231 (1998)非專禾Ij 文獻(xiàn) 3 :Ito. Y.，and Sasaki, Τ. Biosci. Biotech. Biochem. ,61(8),
41270-1276(1997)4 :Fujimoto, H. ， Miyasato, M. ， Ito, Y. ， Sasaki, Τ. ， and Ajisaka, K. Glycoconjugate Journal,15，1550160(1998)非專利文獻(xiàn) 5 =Saito, and Miura. Biochim. Biophys. Acta, 72，619—629 (1963)

發(fā)明內(nèi)容
像這樣，報(bào)告了作為來自環(huán)狀芽孢桿菌的半乳糖苷酶的多種酶，但由于不清楚它們相互的蛋白質(zhì)化學(xué)相關(guān)性、分子生物學(xué)(基因的)特性，因此，在低乳糖牛奶的制造、 低聚半乳糖的制造等制造產(chǎn)業(yè)上的各種用途的酶劑方面存在限制。本發(fā)明提供來自環(huán)狀芽孢桿菌的新型半乳糖苷酶。本發(fā)明人等在研究環(huán)狀芽孢桿菌產(chǎn)生的半乳糖苷酶的過程中，發(fā)現(xiàn)了目前為止沒有報(bào)告的分子量為195kDa(利用SDS-PAGE測(cè)得，在質(zhì)量分析中為189. 3kDa)的酶(本說明書中稱為“ β-Gall”)，而且成功地克隆了編碼該酶的基因(以下稱為“本基因”)。并且，明確了本基因的堿基序列和由其推定的氨基酸序列是與目前為止報(bào)告的來自環(huán)狀芽孢桿菌的3種半乳糖苷酶(氨基酸序列參照非專利文獻(xiàn)3，基因數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)L034M和L0342O大不相同的新型堿基序列和氨基酸序列。另外，本發(fā)明人等還發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀芽孢桿菌對(duì)合成底物2-硝基苯基-β -D-吡喃半乳糖苷O-nitrophenyl β -D-Galactopyranoside =ONPG)的分解活性低，即產(chǎn)生3種半乳糖基轉(zhuǎn)移活性高的酶(在本說明書中稱為“ β _Gal2”、“ β -Gal3”、“ β _Gal4”)。進(jìn)而，還發(fā)現(xiàn)這3種β-半乳糖苷酶是由本基因(編碼β-Gall的基因)派生而產(chǎn)生。此外，通過將本基因和本基因的片段導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗?，還確立了這些半乳糖苷酶蛋白質(zhì)組的制造方法。本發(fā)明基于以上成果而完成，以下示出本發(fā)明。[1] 一種來自環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶，其分子量為195kDa(利用 SDS-PAGE 測(cè)得)。[2] 一種來自環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶，其由[1]所述的β-半乳糖苷酶的片段構(gòu)成。[3] 一種β -半乳糖苷酶，由序列號(hào)7的氨基酸序列、或顯示β -半乳糖苷酶活性的其片段構(gòu)成。[4]根據(jù)[3]所述的β -半乳糖苷酶，其中，所述片段含有序列號(hào)7的氨基酸序列中從N末端到WSIGNEIY(序列號(hào)18)的區(qū)域。[5]根據(jù)[3]所述的β -半乳糖苷酶，其中，所述片段含有序列號(hào)8 10中的任意序列號(hào)的氨基酸序列。[6]根據(jù)[3]所述的β-半乳糖苷酶，其中，利用含有序列號(hào)5的序列的DNA進(jìn)行編碼。[7] 一種β-半乳糖苷酶基因，其由選自以下(a) (e)中的任意DNA構(gòu)成(a)編碼序列號(hào)6或7的氨基酸序列的DNA ；(b)含有序列號(hào)5的序列的DNA ；(c)在嚴(yán)格條件下對(duì)與序列號(hào)5的序列互補(bǔ)的序列進(jìn)行雜交的DNA ；(d)作為序列號(hào)5的序列的DNA序列簡(jiǎn)并體的DNA ；
(e)由以序列號(hào)5的序列為基準(zhǔn)并含有1個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、插入、附加或逆位的序列構(gòu)成的且編碼具有β -半乳糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。[8]根據(jù)[7]所述的半乳糖苷酶基因，其中，具有半乳糖苷酶活性的蛋白質(zhì)由序列號(hào)7的氨基酸序列中發(fā)生小于60%、優(yōu)選小于45%、進(jìn)一步優(yōu)選小于25%的變化的序列或其片段構(gòu)成。[9]根據(jù)[8]所述的β -半乳糖苷酶基因，其中，所述變化為保守性氨基酸取代。[10] 一種β -半乳糖苷酶，由[7] [9]中任一項(xiàng)所述的β -半乳糖苷酶基因編碼。[11] 一種重組載體，其含有[7] [9]中任一項(xiàng)所述的β-半乳糖苷酶基因。[12]根據(jù)[11]所述的重組載體，其為表達(dá)載體。[13] 一種轉(zhuǎn)化體，其導(dǎo)入有[7] [9]中任一項(xiàng)所述的β -半乳糖苷酶基因。[14] 一種轉(zhuǎn)化體，其導(dǎo)入有[11]或[12]所述的重組載體。[15]根據(jù)[1 或[14]所述的轉(zhuǎn)化體，其為細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或真菌細(xì)胞。[16] 一種β-半乳糖苷酶的制造方法，其包括以下步驟⑴和(2)(1)將[13] [15]中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體在能產(chǎn)生由所述半乳糖苷酶基因編碼的蛋白質(zhì)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的步驟；(2)將產(chǎn)生的所述蛋白質(zhì)進(jìn)行回收的步驟。[17] 一種酶劑，將[1] [6]和[10]中任一項(xiàng)所述的β _半乳糖苷酶作為有效成分。[18]根據(jù)[17]所述的酶劑，其中，所述有效成分是選自含有序列號(hào)7的氨基酸序列的半乳糖苷酶、含有序列號(hào)8的氨基酸序列的半乳糖苷酶、含有序列號(hào)9的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶和含有序列號(hào)10的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶中的一種以上的半乳糖苷酶。[19] 一種[1] [6]和[10]中任一項(xiàng)所述的β _半乳糖苷酶或者[17]或[18] 所述的酶劑的使用，用于制造選自低乳糖牛奶、作為腸內(nèi)雙歧桿菌生長(zhǎng)因子的低聚半乳糖、 乳糖不耐受癥患者用藥品或補(bǔ)充劑中的制品。[20]使用[1] [6]和[10]中任一項(xiàng)所述的β-半乳糖苷酶或者[17]或[18] 所述的酶劑而得到的低乳糖牛奶、作為腸內(nèi)雙歧桿菌生長(zhǎng)因子的低聚半乳糖、乳糖不耐受癥患者用藥品或補(bǔ)充劑。


圖1是來自環(huán)狀芽孢桿菌的β -半乳糖苷酶粗酶溶液的羥基磷灰石色譜的洗脫圖形。280nm的吸光度表示蛋白質(zhì)，420nm的吸光度表示用ONPG法測(cè)定的β -半乳糖苷酶活性。圖2是所得組分1 (參照?qǐng)D1)的利用親和色譜法得到的洗脫圖形。280nm的吸光度表示蛋白質(zhì)濃度，420nm的吸光度表示用ONPG法測(cè)定的β-半乳糖苷酶活性。圖3是所得組分2 (參照?qǐng)D1)的利用親和色譜法得到的洗脫圖形。280nm的吸光度表示蛋白質(zhì)濃度，420nm的吸光度表示用ONPG法測(cè)定的β-半乳糖苷酶活性。圖4是4種純化的β -半乳糖苷酶β -GalK泳道3)、β -Gal2 (泳道4)、3-Gal3(泳道5)和i3_Gal4(泳道6)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果。向泳道2提供粗酶粉末。左端表示使用的分子量標(biāo)記(泳道1和7)的分子量。圖5是大腸桿菌轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞破碎物離心上清液的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果。泳道1為β-Gall、泳道2為3-Gal2、泳道3為3_Gal3、泳道4為β _Gal4。泳道 5和6是大腸桿菌載體轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞破碎物的離心上清液。箭頭表示表達(dá)的半乳糖苷酶蛋白質(zhì)。左端表示使用的分子量標(biāo)記(泳道Μ)的分子量。
具體實(shí)施例方式(用語(yǔ))在本發(fā)明中，“編碼氨基酸序列的DNA”是指將其進(jìn)行表達(dá)時(shí)可以得到具有該氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，即，具有與該氨基酸序列對(duì)應(yīng)的堿基序列的DNA。因此還可以考慮密碼子的簡(jiǎn)并。在本說明書中，用語(yǔ)“分離”可以與“純化”交換使用。對(duì)本發(fā)明的酶(β-半乳糖苷酶)使用時(shí)的“分離”是指當(dāng)本發(fā)明的酶來自天然材料時(shí)，在該天然材料中實(shí)質(zhì)上不含有該酶以外的成分的(特別是實(shí)質(zhì)上不含有污染蛋白質(zhì))狀態(tài)。具體而言，例如在本發(fā)明的分離的酶中，污染蛋白質(zhì)的含量以重量換算計(jì)為總體的約小于20%、優(yōu)選約小于10%、進(jìn)一步優(yōu)選約小于5%、更進(jìn)一步優(yōu)選約小于1 %。另一方面，本發(fā)明的酶是利用基因工程方法制備的酶時(shí)，用語(yǔ)“分離”是指實(shí)質(zhì)上不含有來自所使用的宿主細(xì)胞的其它成分、培養(yǎng)液等的狀態(tài)。具體而言，例如在本發(fā)明的分離的酶中污染成分的含量以重量換算計(jì)為總體的約小于20%、優(yōu)選約小于10%、進(jìn)一步優(yōu)選約小于5%、更進(jìn)一步優(yōu)選約小于1%。應(yīng)予說明，在沒有明確表示與其不同的意思的情況下，在本說明書中只是記載為“β-半乳糖苷酶” 時(shí)，意味著“分離狀態(tài)的半乳糖苷酶”。對(duì)于代替半乳糖苷酶而使用的用語(yǔ)“本酶” 也同樣。對(duì)DNA使用時(shí)的“分離”是指在原本天然存在的DNA的情況下，典型地從天然狀態(tài)下共存的其它核酸中分離的狀態(tài)。但是，可以含有天然狀態(tài)下鄰接的核酸序列(例如啟動(dòng)子區(qū)域的序列、終止子序列等)等一部分其它核酸成分。例如對(duì)于基因組DNA的情況的“分離”狀態(tài)，優(yōu)選實(shí)質(zhì)上不含有天然狀態(tài)下共存的其它DNA成分。另一方面，對(duì)于利用cDNA分子等基因工程方法來制備的DNA的情況的“分離”狀態(tài)，優(yōu)選實(shí)質(zhì)上不含有細(xì)胞成分、培養(yǎng)液等。同樣地，對(duì)于利用化學(xué)合成制備的DNA的情況的“分離”狀態(tài)，優(yōu)選實(shí)質(zhì)上不含有dNTP 等前體(原材料)、合成過程中使用的化學(xué)物質(zhì)等。應(yīng)予說明，在沒有明確表示與其不同的意思的情況下，在本說明書中只是記載為“DNA”時(shí)，意味著分離狀態(tài)的DNA。β -半乳糖苷酶一般顯示乳糖分解活性(作用于β -1，4鍵來分解乳糖的活性)和半乳糖基轉(zhuǎn)移活性(轉(zhuǎn)移半乳糖的活性)。因此，本發(fā)明中的“β_半乳糖苷酶活性”包括該兩種活性。乳糖分解活性可以利用實(shí)施例所示的乳糖法而測(cè)定。另外的半乳糖基轉(zhuǎn)移活性可以將利用實(shí)施例所示的ONPG法得到的活性值與利用該乳糖法得到的活性值的比作為指標(biāo)來表示。已知[利用實(shí)施例所示的ONPG法得到的活性值/利用該乳糖法得到的活性值]的值越小，則轉(zhuǎn)移活性越高(非專利文獻(xiàn)1)。本發(fā)明中的“分子量”在沒有特別說明的情況下是指用SDS-PAGE (SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)測(cè)定的分子量。
(β-半乳糖苷酶)本發(fā)明的第1方式提供本發(fā)明人等在分離和賦予特征上取得成功的來自環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶。本發(fā)明的β-半乳糖苷酶在一個(gè)方式中，其分子量為195kDa(利用SDS-PAGE測(cè)得)。本發(fā)明人等在分離純化本β-半乳糖苷酶的過程中發(fā)現(xiàn)另外產(chǎn)生分子量為135kDa的β -半乳糖苷酶(β -Gal2)、86kDa的β -半乳糖苷酶(β -Gal3)和160kDa 的β -半乳糖苷酶(β "Gal4)(均利用SDS-PAGE測(cè)得)，并且發(fā)現(xiàn)這3種β -半乳糖苷酶均由一個(gè)基因派生。另一方面，確認(rèn)了實(shí)際上缺失了一半以上C末端區(qū)域的基因表達(dá)具有活性的半乳糖苷酶。基于這些發(fā)現(xiàn)，作為本發(fā)明的另一方式，提供由上述半乳糖苷酶 (分子量為195kDa的來自環(huán)狀芽孢桿菌的半乳糖苷酶)的片段(以下稱為“本片段”) 構(gòu)成的半乳糖苷酶。只要顯示半乳糖苷酶活性，則本片段的長(zhǎng)度沒有特別的限定， 但含有作為基準(zhǔn)的蛋白質(zhì)的例如5 98%、優(yōu)選為40 95%、最優(yōu)選為55 75%的蛋白質(zhì)。另外，優(yōu)選含有作為基準(zhǔn)的蛋白質(zhì)的N末端區(qū)域。本片段的具體例是本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)的分子量為135kDa的β -半乳糖苷酶(β -Gal2)、86kDa的β -半乳糖苷酶(β -Gal3)和 160kDa的β -半乳糖苷酶(β -Gal4)。本片段也可以通過蛋白酶處理而得到。例如，通過將純化的上述β-半乳糖苷酶 (分子量為195kDa的來自環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶)提供給蛋白酶處理從而得到本片段。或者，也可以通過將含有上述半乳糖苷酶的環(huán)狀芽孢桿菌的培養(yǎng)液用蛋白酶處理從而得到本片段。使用的蛋白酶沒有特別的限制。例如，可以使用市售的蛋白酶劑、環(huán)狀芽孢桿菌產(chǎn)生的內(nèi)源性蛋白酶。本發(fā)明的β -半乳糖苷酶在一個(gè)方式中含有序列號(hào)7的氨基酸序列。該氨基酸序列是從序列號(hào)6的氨基酸序列中除去信號(hào)肽部分而得到的氨基酸序列。應(yīng)予說明，序列號(hào)6 的氨基酸序列是從由環(huán)狀芽孢桿菌克隆得到的基因的堿基序列(序列號(hào)5)推定而得的氨基酸序列。具有序列號(hào)7的氨基酸序列的本發(fā)明的半乳糖苷酶從氨基酸數(shù)的不同和相同性低的程度(10 12%)來講，是與目前為止報(bào)告的3種來自環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶明顯不同的新型酶。本發(fā)明的另一方式是由序列號(hào)7的氨基酸序列的片段構(gòu)成的半乳糖苷酶。在這里，片段優(yōu)選含有序列號(hào)7的氨基酸序列中從N末端至WSIGNEIY(序列號(hào)18)的區(qū)域。該部分序列(WSIGNEIY)是推定的活性區(qū)域。作為片段的具體例，可以舉出具有序列號(hào)8 10 中任一序列號(hào)的氨基酸序列的片段。序列號(hào)8的氨基酸序列對(duì)應(yīng)fel2，序列號(hào)9的氨基酸序列對(duì)應(yīng)Gal3，序列號(hào)10的氨基酸序列對(duì)應(yīng)feil4。一般在某蛋白質(zhì)的氨基酸序列的一部分實(shí)施修飾的情況下，有時(shí)修飾后的蛋白質(zhì)與修飾前的蛋白質(zhì)具有相同的功能。即，有時(shí)氨基酸序列的修飾對(duì)蛋白質(zhì)的功能不帶來實(shí)質(zhì)性的影響，蛋白質(zhì)的功能在修飾前后得以維持?？紤]到該技術(shù)常識(shí)，與本發(fā)明的半乳糖苷酶(由序列號(hào)7 10中的任一氨基酸序列構(gòu)成)進(jìn)行比較的情況下，雖然發(fā)現(xiàn)氨基酸序列的略微的不同但沒有發(fā)現(xiàn)在作為半乳糖苷酶的功能上的實(shí)質(zhì)性差異的酶可以看作與上述β-半乳糖苷酶實(shí)質(zhì)上相同的酶。這里的“氨基酸序列的略微的不同”是指代表性地通過構(gòu)成氨基酸序列的1 數(shù)個(gè)(上限是例如3個(gè)、5個(gè)、7個(gè)、10個(gè))的氨基酸的缺失、 取代、或1 數(shù)個(gè)(上限是例如3個(gè)、5個(gè)、7個(gè)、10個(gè))的氨基酸的附加、插入、或它們的組合從而在氨基酸序列中發(fā)生變異(變化)的情況。“實(shí)質(zhì)上相同的酶”的氨基酸序列與作為基準(zhǔn)的上述半乳糖苷酶的氨基酸序列的同一性(％)優(yōu)選為90%以上、更優(yōu)選為95% 以上、進(jìn)一步優(yōu)選為98%以上、最優(yōu)選為99%以上。應(yīng)予說明，氨基酸序列的不同也可以發(fā)生在多個(gè)位置?！鞍被嵝蛄械穆晕⒌牟煌眱?yōu)選由保守性氨基酸取代而產(chǎn)生。這里的“保守性氨基酸取代”是指將某一氨基酸殘基替換為具有相同性質(zhì)的側(cè)鏈的氨基酸殘基。氨基酸殘基根據(jù)其側(cè)鏈而被分為堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、 谷氨酸)、非電荷極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯基丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β支鏈側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)、芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、組氨酸)之類的幾個(gè)家族。保守性氨基酸取代優(yōu)選為同一家族內(nèi)的氨基酸殘基間的取代。在這里，二個(gè)氨基酸序列的同一性(％ )例如可以用以下的程序確定。首先，為了能夠進(jìn)行最佳的比較，將二個(gè)序列進(jìn)行排列(例如可以在第一序列中導(dǎo)入間隙(< W 1 )而使得與第二序列的對(duì)齊最佳化)。第一序列的特定位置的分子(氨基酸殘基)與第二序列中對(duì)應(yīng)的位置的分子相同時(shí)，可以說該位置的分子相同。序列同一性是該二個(gè)序列共通的同一位置的數(shù)目的函數(shù)(即，同一性(％)=同一位置的數(shù)/位置的總數(shù)X100)，優(yōu)選將對(duì)齊的最佳化所需的間隙的數(shù)目和尺寸也考慮進(jìn)來。二個(gè)序列的比較和同一性的確定可以利用數(shù)學(xué)算法來實(shí)現(xiàn)。作為可以用于序列比較的數(shù)學(xué)算法的具體例，有記載于Karlin 和 Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264-68,并在 Karlin 和 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873-77中改良的算法，但不限于此。這樣的算法被合并到 Altschul 等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403-10 中記載的 NBLAST 程序和 XBLAST 程序(版本 2. 0)中。例如，在XBLAST程序中如果以score = 50、wordlength = 3進(jìn)行BLAST多肽檢索，則可以得到同一性高的氨基酸序列。為了得到用于比較的間隙對(duì)齊，可以利用Altschul 等(1997) Amino Acids Research 25(17) :3389-3402 中記載的 Gapped BLAST。利用 BLAST 和Gapped BLAST時(shí)，可以使用對(duì)應(yīng)的程序(例如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。詳細(xì)的可以參照例如NCBI的網(wǎng)頁(yè)。作為可以用于序列比較的其它數(shù)學(xué)算法的例子，有Myers和 Miller (1988)Comput Appl Biosci. 4 :11-17中記載的算法。這樣的算法被合并到例如 GENESTREAM網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器(IGH Montpellier，法國(guó))或ISREC服務(wù)器中可使用的ALIGN程序中。在氨基酸序列的比較中利用ALIGN程序時(shí)，例如，可使用PAM120殘基質(zhì)量表，使間隙長(zhǎng)罰分(￥ \ 7 長(zhǎng) f Hr ^ ) = 12、間隙罰分(￥ \ 7 《f A于4 ) = 4?？梢允褂?GCG軟件包的GAP程序，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，使間隙權(quán)重=12、10、8、6或 4、間隙長(zhǎng)權(quán)重=2、3或4來確定二個(gè)氨基酸序列的同一性。(β-半乳糖苷酶基因)本發(fā)明的第2方式涉及半乳糖苷酶基因。在一個(gè)方式中本發(fā)明的基因含有編碼序列號(hào)6或7的氨基酸序列的DNA。該方式的具體例是由序列號(hào)5的堿基序列構(gòu)成的 DNA。然而，一般在編碼某蛋白質(zhì)的DNA的一部分實(shí)施修飾的情況下，有時(shí)修飾后的DNA 所編碼的蛋白質(zhì)與修飾前的DNA所編碼的蛋白質(zhì)具有相同的功能。S卩，有時(shí)DNA序列的修飾對(duì)編碼的蛋白質(zhì)的功能沒有帶來實(shí)質(zhì)性的影響，編碼的蛋白質(zhì)的功能在修飾前后得以維持。因此，本發(fā)明作為其它方式提供具有與序列號(hào)5的堿基序列等價(jià)的堿基序列、編碼具有 β -半乳糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的DNA(以下也稱為“等價(jià)DNA”)。這里的“等價(jià)的堿基序列” 是指與序列號(hào)5所示的核酸一部分不同、但其編碼的蛋白質(zhì)的功能(在這里為半乳糖苷酶活性)不會(huì)因該不同而受到實(shí)質(zhì)性影響的堿基序列。作為等價(jià)DNA的具體例，是在嚴(yán)格條件下對(duì)與序列號(hào)5的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列進(jìn)行雜交的DNA。這里的“嚴(yán)格條件”是指形成所謂的特異性雜交、不形成非特異性雜交的條件。這樣的嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，可以參照例如Molecular Cloning (Third Edition, Cold Spring H arbor Laboratory Press, New York)、Current protocols in molecular biolog y (edited by Frederick M. Ausubel et al.，1987)來設(shè)定。作為嚴(yán)格條件，例如可以舉出以下條件使用雜交液(50%甲酰胺、10 XSSC (0. 15M NaCl，15mM檸檬酸鈉，ρΗ 7· 0)、5XDenhardt溶液、SDS、10%硫酸葡聚糖、10 μ g/ml的變性鮭魚精子DNA、 50mM磷酸緩沖液(pH7. 5))在約42°C 約50°C下進(jìn)行溫育，然后使用0. 1XSSC、0. 1% SDS 在約65°C 約70°C中進(jìn)行清洗。作為進(jìn)一步優(yōu)選的嚴(yán)格條件，例如可以舉出如下條件作為雜交液使用50%甲酰胺、5XSSC(0. 15M NaCl，15mM檸檬酸鈉，ρΗ 7. 0)、1 XDenhardt溶液、305、10%硫酸葡聚糖、101^/1111的變性鮭魚精子DNA、50mM磷酸緩沖液(pH7. 5))。作為等價(jià)DNA的其它具體例，可以舉出由以序列號(hào)5所示的堿基序列為基準(zhǔn)并包括1個(gè)或多個(gè)(優(yōu)選為1 數(shù)個(gè))堿基的取代、缺失、插入、附加、或逆位的堿基序列構(gòu)成且編碼具有半乳糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。堿基的取代、缺失等可以發(fā)生在多個(gè)部位。這里的“多個(gè)”是指根據(jù)該DNA編碼的蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基的位置、種類而不同，例如2 40個(gè)堿基、優(yōu)選為2 20個(gè)堿基、更優(yōu)選為2 10個(gè)堿基。以上的等價(jià)DNA例如可以利用限制性內(nèi)切酶處理、核酸外切酶或DNA連接酶等的處理、定位突變導(dǎo)入法(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)或隨機(jī)突變導(dǎo)入法(Molecular Cloning, Third Edition, Chapter 13， Cold Spring Harbor Laborat ory Press,New York)的變異導(dǎo)入等,通過修飾具有序列號(hào) 5所示的堿基序列的DNA使其包括堿基的取代、缺失、插入、附加和/或逆位從而得到。另外，也可以通過紫外線照射等其它方法而得到等價(jià)DNA。作為等價(jià)DNA的其它的例子，可以舉出將以SNP (單核苷酸多態(tài)性)為代表的多態(tài)性作為起因而發(fā)現(xiàn)如上述的堿基不同的DNA。在這里，如后述的實(shí)施例所示，由作為序列號(hào)7的氨基酸序列(Gall)的片段的序列號(hào)8 10的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)(Gal2、(ia13和顯示了高β -半乳糖苷酶活性?；谠撌聦?shí)，本發(fā)明的一個(gè)方式提供編碼由在序列號(hào)7所示的氨基酸序列中發(fā)生小于 60%、優(yōu)選小于45%、進(jìn)一步優(yōu)選小于25%的變化的序列或其片段構(gòu)成的蛋白質(zhì)的β-半乳糖苷酶基因。本發(fā)明的基因可以通過參考本說明書或附加的序列表所示的序列信息，使用標(biāo)準(zhǔn)的基因工程方法、分子生物學(xué)方法、生物化學(xué)方法等而制備成分離的狀態(tài)。具體而言，可以由適當(dāng)?shù)沫h(huán)狀芽孢桿菌的基因組DNA庫(kù)或eDNA庫(kù)、或者環(huán)狀芽孢桿菌的菌體內(nèi)提取液，適當(dāng)使用對(duì)本發(fā)明的基因能特異性地進(jìn)行雜交的寡聚核苷酸探針 引物而制備。寡聚核苷酸探針·引物可以利用市售的自動(dòng)化DNA合成裝置等而容易地合成。應(yīng)予說明，對(duì)于為了制備本發(fā)明的基因而使用的庫(kù)的制作方法，例如可以參照Molecular Cloning, Third Edition,
10Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York。例如，如果是具有序列號(hào)5的堿基序列的基因，則可以利用將該堿基序列或其互補(bǔ)序列的整體或一部分作為探針的雜交法來進(jìn)行分離。另外，可以利用使用了設(shè)計(jì)成能夠?qū)υ搲A基序列的一部分特異性地進(jìn)行雜交的合成寡聚核苷酸引物的核酸擴(kuò)增反應(yīng)(例如 PCR)來進(jìn)行擴(kuò)增和分離。另外，可以基于序列號(hào)6所示的氨基酸序列、序列號(hào)5的堿基序列的信息，通過化學(xué)合成而得到作為目標(biāo)的基因(參考文獻(xiàn)Gene，60 (1)，115-127 (1987))。(重組載體)本發(fā)明的另一個(gè)方式涉及含有本發(fā)明的半乳糖苷酶基因的重組載體。在本說明書中用語(yǔ)“載體”是指能夠?qū)⒉迦肫渲械暮怂岱肿虞斔椭良?xì)胞等靶內(nèi)的核酸性分子，其種類、形態(tài)沒有特別的限定。因此，本發(fā)明的載體可以采取質(zhì)粒載體、粘粒載體、噬菌體載體、 病毒載體(腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、單純皰疹病毒載體等)的形態(tài)。可以根據(jù)使用目的(克隆、蛋白質(zhì)的表達(dá))，另外考慮宿主細(xì)胞的種類來選擇適當(dāng)?shù)妮d體。如果舉出載體的具體例子，有以大腸桿菌為宿主的載體(Μ13噬菌體或其修飾體、 λ噬菌體或其修飾體、pBR322或其修飾體(pB325、pAT153、pUC8等)等)、以酵母為宿主的載體(pY^^eCl、pMFa、pYES2等、以昆蟲細(xì)胞作為宿主的載體(pAc、pVL等)，以哺乳類細(xì)胞作為宿主的載體(pCDM8、pMT2PC等)等。本發(fā)明的重組載體優(yōu)選為表達(dá)載體?！氨磉_(dá)載體”是指可以將插入其中的核酸導(dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞(宿主細(xì)胞)內(nèi)，并且能夠在該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的載體。表達(dá)載體通常含有對(duì)插入的核酸的表達(dá)所必要的啟動(dòng)子序列、促進(jìn)表達(dá)的增強(qiáng)子序列等。還可以使用含有選擇標(biāo)記的表達(dá)載體。使用該表達(dá)載體時(shí)，可以利用選擇標(biāo)記來確認(rèn)表達(dá)載體導(dǎo)入的有無(及其程度)。本發(fā)明的基因向載體的插入、選擇標(biāo)記基因的插入(必要時(shí))、啟動(dòng)子的插入 (必要時(shí))等可以利用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)(例如可以參照Molecular Cloning, Third Edition, 1. 84, Cold Spring Harbor Laboratory PFess,New York，利用了限制性內(nèi)切酶禾口 DNA連接酶的公知方法)來進(jìn)行。(轉(zhuǎn)化體)本發(fā)明進(jìn)一步涉及導(dǎo)入有本發(fā)明的基因的宿主細(xì)胞(轉(zhuǎn)化體)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體中，本發(fā)明的基因作為外來性的分子而存在。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體優(yōu)選通過使用了上述本發(fā)明的載體的轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化而制備。轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化可以通過磷酸鈣共沉淀法、電穿孔(Potter， H. et al. , Proc. Natl. Aca d. Sci. U. S. Α. 81，7161-7165 (1984))、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(Feigner, P.L.et al. , Pro c. Natl. Acad. ki. U. S. A. 84，7413-7417 (1984))、顯微注射(Graessman η, Μ. &Graessmann, Α. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 73, 366-370 (1976))、Hanahan 方法 (Hanahan, D.，J. Mol. Biol. 166，557-580 (1983))、乙酸鋰法(Schiestl, R. H. et al. , Curr. Genet. 16，339-346 (1989))、原生質(zhì)體-聚乙二醇法(Yelton, M. M. et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. 81，1470-1474(1984))等來實(shí)施。宿主細(xì)胞只要是能夠表達(dá)本發(fā)明的半乳糖苷酶，就沒有特別的限定，例如可以從枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌(Bacillus likemiformis)、環(huán)狀芽孢桿菌等芽孢桿菌屬細(xì)菌，乳球菌、乳酸菌、鏈球菌、明串珠菌、雙歧桿菌等乳酸菌，大腸桿菌、鏈霉菌等其它細(xì)菌、酵母菌、克魯維酵母、念珠菌、圓酵母(Torula)、球似酵母等酵母，米曲霉、黑曲霉等曲霉菌屬、青霉菌屬、木霉菌屬、鐮刀菌屬等絲狀真菌(真菌)等中進(jìn)行選擇。( β -半乳糖苷酶的制造方法)本發(fā)明的另一個(gè)方式提供半乳糖苷酶的制造方法。本發(fā)明的制造方法的一個(gè)方式中，利用上述轉(zhuǎn)化體制造半乳糖苷酶。在該方式的制造方法中，首先，在能產(chǎn)生由導(dǎo)入到其中的基因編碼的蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化體(步驟(1))。關(guān)于各種載體宿主系的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)條件是公知的，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員就能夠容易地設(shè)定適合的培養(yǎng)條件。培養(yǎng)法和培養(yǎng)條件只要是能夠產(chǎn)生作為目標(biāo)蛋白質(zhì)的β -半乳糖苷酶的培養(yǎng)法和培養(yǎng)條件，就沒有特別的限定。即，將產(chǎn)生半乳糖苷酶作為條件，可以適當(dāng)設(shè)定適合所使用的微生物的培養(yǎng)的方法、培養(yǎng)條件。作為培養(yǎng)法，液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)均可，優(yōu)選利用液體培養(yǎng)。以液體培養(yǎng)為例子，說明其培養(yǎng)條件。作為培養(yǎng)基，只要是所使用的轉(zhuǎn)化體能夠進(jìn)行生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，就可以是任意培養(yǎng)基。例如，可以使用添加有葡萄糖、蔗糖、龍膽二糖、可溶性淀粉、甘油、糊精、糖蜜、有機(jī)酸等碳源、進(jìn)而硫酸銨、碳酸銨、磷酸銨、乙酸銨、或者蛋白胨、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、糠、肉提取物等氮源、進(jìn)而鉀鹽、鎂鹽、鈉鹽、磷酸鹽、錳鹽、鐵鹽、鋅鹽等無機(jī)鹽的培養(yǎng)基。為了促進(jìn)所使用的轉(zhuǎn)化體的生長(zhǎng)，還可以在培養(yǎng)基中添加維生素、氨基酸等。在有氧條件下培養(yǎng)，條件為培養(yǎng)基的PH調(diào)節(jié)到例如約3 10、優(yōu)選為約7 8左右，培養(yǎng)溫度通常為約10 50°C、優(yōu)選為約20 37°C左右，1 7天、優(yōu)選3 4天左右。作為培養(yǎng)法，可以采用例如振蕩培養(yǎng)法、利用發(fā)酵罐的有氧深部培養(yǎng)法。培養(yǎng)步驟之后，回收產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(β_半乳糖苷酶)(步驟O))。從培養(yǎng)液中進(jìn)行回收時(shí)，例如通過將培養(yǎng)上清液進(jìn)行過濾、離心處理等而除去不溶物后，通過將利用超濾膜的濃縮、硫酸銨沉淀等鹽析、透析、離子交換樹脂等各種色譜等適當(dāng)組合來進(jìn)行分離、純化，從而可以得到本酶。另外，從菌體內(nèi)進(jìn)行回收時(shí)，例如可以通過采用加壓處理、超聲波處理等將菌體進(jìn)行破碎后，與上述同樣地進(jìn)行分離、純化從而得到目標(biāo)蛋白質(zhì)。應(yīng)予說明，也可以通過過濾、離心處理等預(yù)先從培養(yǎng)液中回收菌體后，進(jìn)行上述一系列的工序(菌體的破碎、分離、純化)。β -半乳糖苷酶的純化度沒有特別的限定。另外，最終形態(tài)可以是液體狀，也可以是固體狀(包括粉末狀)。(酶劑)本發(fā)明的半乳糖苷酶例如可以酶劑的方式提供。酶劑除了有效成分(本發(fā)明的半乳糖苷酶)以外，還可以含有賦形劑、緩沖劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、保存劑、防腐劑、生理鹽水等。作為賦形劑，可以使用乳糖、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖等。作為緩沖劑，可以使用磷酸鹽、枸櫞酸鹽、乙酸鹽等。作為穩(wěn)定劑，可以使用丙二醇、抗壞血酸等。作為保存劑， 可以使用苯酚、苯扎氯銨、芐醇、氯丁醇、對(duì)羥基苯甲酸甲酯等。作為防腐劑，可以使用苯扎氯銨、對(duì)羥基苯甲酸、氯丁醇等。在本發(fā)明的酶劑的一個(gè)方式中，作為有效成分，可以使用選自含有序列號(hào)7的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶、含有序列號(hào)8的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶、含有序列號(hào)9 所示的氨基酸序列的半乳糖苷酶和含有序列號(hào)10所示的氨基酸序列的半乳糖苷酶中的一種以上的半乳糖苷酶。作為一個(gè)方式，可以提供全部含有這4種β-半乳糖苷酶的酶劑。(β-半乳糖苷酶的用途)本發(fā)明的另一個(gè)方式提供本發(fā)明的半乳糖苷酶或酶劑的用途。用途的例子是低乳糖牛奶的制造、作為腸內(nèi)雙歧桿菌生長(zhǎng)因子的低聚半乳糖的制造、或者乳糖不耐受癥患者用的藥品、補(bǔ)充劑的制造。可以通過使用本發(fā)明的半乳糖苷酶或酶劑來降低原材料中的乳糖。例如，通過相對(duì)于ImL生牛奶添加IU的β -半乳糖苷酶，在10°C的低溫下放置從而使乳糖分解，可得到低乳糖牛奶。在低聚半乳糖的制造中，例如，在預(yù)先加熱溶解的 40%乳糖液(pH 7.0)中加入100LU的β -半乳糖苷酶，在40°C中放置5小時(shí)，從而生成低聚半乳糖。應(yīng)予說明，低聚半乳糖由fell-(Gal)n-Glc (η通常為0 幻表示(Gal 半乳糖殘基、Glc 葡萄糖殘基)。結(jié)合方式除了 β 1-6、β 1-3、β 1-4、β 1-2以外，還有α 1-3、α 1-6寸。實(shí)施例1.來自環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶的純化(a) β -半乳糖苷酶活性測(cè)定法在以下的純化中，β -半乳糖苷酶活性測(cè)定是以將2-硝基苯基β -D-吡喃半乳糖苷(ONPG)作為底物的方法⑴和將乳糖作為底物的方法(ii)這2種進(jìn)行測(cè)定。均是根據(jù)非專利文獻(xiàn)1記載的方法實(shí)施。另外，蛋白質(zhì)濃度是以^Onm的吸光度表示。i) ONPG 法將含有0. 245% ONPG的IOOmM磷酸緩沖液(pH 6. 0) 1. 98ml在40°C預(yù)熱10分鐘。 向其中添加20 μ 1樣品，在40°C反應(yīng)10分鐘后，加入10%碳酸鈉溶液2. Oml，停止反應(yīng)。測(cè)定反應(yīng)液在420nm處的吸光度，將每1分鐘生成1 μ mol的2-硝基苯酚時(shí)的活性作為IU而算出半乳糖苷酶活性。ii)乳糖法將含有5%乳糖的IOOmM磷酸緩沖液(pH 6. 0) 2ml在40°C預(yù)熱10分鐘。向其中添加50 μ 1樣品，在40°C反應(yīng)15分鐘后，在沸騰浴中煮沸，停止反應(yīng)。對(duì)100 μ 1反應(yīng)液用糖原穩(wěn)定法測(cè)定葡萄糖濃度。即，在反應(yīng)液100 μ 1中加入0. IN氫氧化鈉溶液100 μ 1放置1分鐘，接著添加0. IN乙酸、3ml的乙酸緩沖液(pH 5. 0)。在該溶液中添加葡萄糖氧化酶液(小野藥品工業(yè)公司)500 μ 1，測(cè)定在550nm處的吸光度的增加速度，將每1分鐘生成 Iumol的葡萄糖時(shí)的活性作為IU而算出乳糖分解活性。(b) β -半乳糖苷酶的粗酶粉末的制備將環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans) ATCC31382接種于含有3. 0 %大豆胨、 2. 5%肉提取物、1. 0%酵母提取物、0. 5%乳糖的液體培養(yǎng)基，在30°C振蕩培養(yǎng)3天。將通過離心分離除去菌體而得到的培養(yǎng)上清液提供到超濾膜(AIP-1013D，旭化成公司制)而濃縮 5倍。將得到的濃縮液噴霧干燥，得到了半乳糖苷酶的粗酶粉末。(c) β -半乳糖苷酶的純化將在IOmM磷酸鈉緩沖液(pH 6. 0)中以5. 0%的濃度溶解有所得粗酶粉末的溶液 50ml提供到已用該緩沖液平衡化的羥基磷灰石凝膠柱(CHTTM Ceramic hydroxyapataite, BIO-RAD公司制，內(nèi)徑2. 5cm、長(zhǎng)度25cm)上，用IOmM磷酸鈉緩沖液(pH 6. 0)洗脫未吸附蛋白質(zhì)。然后，利用使磷酸鈉緩沖液濃度以100mM、150mM、200mM、300mM和500mM依次變化的分步洗脫法洗脫酶。本色譜在室溫下進(jìn)行。如圖1所示，在磷酸鈉緩沖液濃度為100mM、 150mM、300-500mM時(shí)，洗脫了顯示β-半乳糖苷酶(ONPG)活性的酶，將各個(gè)組分依次設(shè)為組分1、2、3。組分3含有的酶在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定中是分子量為195kDa的近乎單一的蛋白質(zhì)，稱為β-Gall。接著，將組分1利用親和色譜法進(jìn)行分離純化。首先，將組分1對(duì)50mM乙酸緩沖液(PH 5.8)進(jìn)行透析。使透析的酶液經(jīng)過已用該緩沖液平衡化的親和凝膠柱(對(duì)氨基苯基-1-硫代-β -D-吡喃半乳糖苷-瓊脂(p-Aminobenzyl-1-thio- β -D-galactopyranosi de-agarose)，Sigma公司制，直徑1. 6cm，長(zhǎng)度18cm)，用該緩沖液洗脫未吸附蛋白質(zhì)后，在 4°C用使pH從5. 8變化到3. 5的線性梯度法(50mM乙酸緩沖液(pH 5. 8)/50mM乙酸緩沖液， (pH 3. 5))洗脫。如組分1所示，在清洗組分和在pH 4. 4前后分別洗脫出具有β _半乳糖苷酶活性的酶。它們?cè)赟DS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中顯示了近乎單一的條帶，分子量分別為 135kDa、86kDa。前者稱為 3_Gal2，后者稱為 β -Gal3 另一方面，將組分2與組分1同樣地利用親和色譜法進(jìn)行分離純化。將組分2相對(duì)于50mM乙酸緩沖液(pH 5.8)進(jìn)行透析，并提供到已用該緩沖液進(jìn)行平衡化的上述親和柱上。與圖2的情況相同，在用該緩沖液洗脫未吸附蛋白質(zhì)后，在4°C用使pH從5. 8變化到3. 5 的線性梯度法進(jìn)行洗脫。如圖3所示，在清洗組分和在pH 4.4前后分別洗脫出具有β-半乳糖苷酶活性的酶。它們?cè)赟DS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中顯示近乎單一的條帶，分子量分別為86kDa、160kDa。前者與β -Gal3相同，后者稱為β _Gal4。圖4中表示了粗酶標(biāo)準(zhǔn)品 (泳道2)與純化的β -GalK泳道3)、β -Gal2 (泳道4)、β -Gal3 (泳道5)和β -Ga 14 (泳道6)的10% SDS-PAGE的解析結(jié)果。2.來自環(huán)狀芽孢桿菌的純化β-半乳糖苷酶的各種性質(zhì)研究純化的4種β -半乳糖苷酶的主要性質(zhì)。(a)比活度的測(cè)定在40°C、IOOmM磷酸緩沖液pH 6中測(cè)定使用了 ONPG (終濃度0. )和乳糖(終濃度4. 88%)作為底物時(shí)的活性。將結(jié)果示于表1。應(yīng)予說明，使用了 ONPG作為底物的情況下，將在40°C、pH6的條件下1分鐘生成1 μ mol產(chǎn)物硝基苯酚的酶量定義為IU ；使用了乳糖作為底物的情況下，將在40°C、pH6的條件下1分鐘生成1 μ mol產(chǎn)物葡萄糖的酶量定義為1U。如表1所示，可知與對(duì)乳糖的分解活性相比，對(duì)ONPG的分解活性為β-Gall高， β -Gal2, β -Gal3 禾口 β _Gal4 低。[表1]
酶粗酶β-Gallp-Gal2p-Gal3β-GaW(U/mg)(U/mg)(U/mg)( /mg)(U/mg)比活度16.050.013.417. 610.9(底物；0NPG)比活度35.446.562.072. 645.0(底物；乳糖)分子量-189. 283 kDa134.788 kDa91.027 kDa153.932 kDa(SDS-PAGE)(195 kDa)(135 kDa)(86 kDa)(160 kDa)N末端-GNSVSYDGERRVNFNEN同左同左同左氨基酸序列(SVSYDGERRVNFNEN)
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(b)分子量的確定利用基質(zhì)輔助激光解吸/ 電離(Matrix Assisted Laser Desorption/ Ionization, MALDI)分析計(jì)求出4種β-半乳糖苷酶的分子量。樣品使用了 0. 1 μ 1 IOmg/ ml 芥子酸/0. 1μ 1 0. 7-3mg/ml 酶溶液的混合溶液。結(jié)果，β -Gall 為 189. 283kDa、β -Gal2 為 134. 788kDa、β -Gal3 為 91. 027kDa、β -Gal4 為 153. 932kDa (表 1)。另外，將用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳求出的分子量(圖4)示于表1的括號(hào)內(nèi)。利用質(zhì)量分析計(jì)求得的分子量對(duì)于任何酶均顯示了與由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳求出的分子量近似的結(jié)果。(C) N末端氨基酸序列的確定利用蛋白質(zhì)序列分析儀進(jìn)行4種β-半乳糖苷酶的N末端氨基酸序列的解析。其結(jié)果，明確了 β -Gall中含有2種序列GNSVSYDGERRVNFNEN(序列號(hào)1)和 SVSYDGERRVNFNEN(序列號(hào)17)。但是，可知這2種序列是在N末端有無GN方面的不同，基本上是相同序列。另外0-Gal2、β-Gal3, β _Gal4的N末端氨基酸序列也與β-Gall相同。(d)內(nèi)部氨基酸序列的確定接著，將β -GalU β -Gal2, β -Gal3的純化酶制備成1 ang/ml，向其中加入胰蛋白酶(0.5mg/ml)，在37°C中進(jìn)行溫育。48小時(shí)后提供到8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中。從任意酶中均檢測(cè)出了 70kDa的條帶。將電泳后的凝膠轉(zhuǎn)印到硝基纖維素膜上，用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色。從染色的條帶中切出來自各酶的70kDa的條帶，用蛋白質(zhì)序列分析儀解析氨基酸序列。結(jié)果，來自各酶的70kDa蛋白質(zhì)的N末端5殘基的序列一致。另外，來自 β -Gal3的70kDa蛋白質(zhì)的N末端15殘基的氨基酸序列為EDRADVNIKTKISND (序列號(hào)2)。3.編碼來自環(huán)狀芽孢桿菌的半乳糖苷酶的基因片段的獲取(a)染色體DNA的分離利用齊藤 三浦(非專利文獻(xiàn)幻的方法由環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus c irculans) ATCC31382的菌體制備染色體DNA。(b)利用PCR進(jìn)行DNA探針的制作基于2.中確定的N末端氨基酸序列和內(nèi)部氨基酸序列合成2種寡聚核苷酸(序列號(hào)3、4)而作為PCR引物。使用這些引物，以環(huán)狀芽孢桿菌的染色體DNA作為模板，在以下的條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)。<PCR 反應(yīng)液〉10 X PCR 反應(yīng)緩沖液(TaKaRa 公司)5. 0 μ 1
dNTP 混合液(各 2. 5mM, TaKaRa 公司)8. 0 μ 125mM MgCl25. 0 μ 150μΜ 正義引物 0. 5μ 150μΜ 反義引物 0. 5μ 1蒸餾水四.5μ1染色體DNA 溶液(100 μ g/ml) 1· 0 μ 1LA Taq DNA 聚合酶(TaKaRa 公司)0· 5 μ 1<PCR反應(yīng)條件〉步驟1 變性(95 °C、5分鐘)1循環(huán)
步驟2 變性(95 °C、1分鐘)30循環(huán)退火(52°C、1分鐘)延伸(72°C、1分鐘)步驟3 延伸(720C UO分鐘)1循環(huán)將得到的約0. 6kb的DNA片段克隆到pGEM-Teasy (Promega公司)后，確認(rèn)堿基序列，結(jié)果在緊鄰正義引物之后和緊鄰反義引物之前發(fā)現(xiàn)了編碼上述部分氨基酸序列的堿基序列。將本DNA片段作為用于全長(zhǎng)基因克隆的DNA探針。(c)基因庫(kù)的制作環(huán)狀芽孢桿菌的染色體DNA的Southern雜交解析的結(jié)果，在SpeI分解物中確認(rèn)了與探針DNA進(jìn)行雜交的約8. 21Λ的單條帶。為了克隆該約8. 21Λ的SpeI DNA片段，如下制作基因庫(kù)。進(jìn)行上述(a)制備的染色體DNA的SpeI處理。將50 μ g的染色體DNA、40 μ 1 的10 XM緩沖液、342. 0μ 1的蒸餾水和8. 0μ 1的SpeI混合，在37°C中處理15小時(shí)。將得到的分解物連接到SpeI處理的pBluescript II KS+載體(Stratagene公司)上，得到了基因庫(kù)。(d)基因庫(kù)的篩選利用DIG-High Prime (Roche公司)將上述(b)得到的0. 6kb的DNA片段進(jìn)行標(biāo)記。將其作為DNA探針，將(c)中得到的基因庫(kù)通過菌落雜交而進(jìn)行篩選。由得到的陽(yáng)性菌落得到了質(zhì)粒pBlue-Gall。(e)堿基序列的確定根據(jù)通常方法確定質(zhì)粒pBlue-Gall的堿基序列。將編碼來自環(huán)狀芽孢桿菌的 β -半乳糖苷酶的堿基序列(5214bp)示于序列號(hào)5。另外，將被序列號(hào)5編碼的氨基酸序列(1738氨基酸)示于序列號(hào)6。該氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)了 2.中確定的N末端區(qū)域氨基酸序列(序列號(hào)1)和內(nèi)部氨基酸序列(序列號(hào)2)。認(rèn)為很有意味的是，本基因中的起始密碼子為GTG。應(yīng)予說明，將從序列號(hào)6的氨基酸序列中除去信號(hào)肽的氨基酸序列示于序列號(hào)7。4.來自環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶β-Gall、β-Gal 2, β _Gal4在大腸桿菌中的表達(dá)(a) β -半乳糖苷酶在大腸桿菌中的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建由于與分子量 189. 3kDa、134. 8kDa、153. 9kDa(質(zhì)量分析的值)的 β -Gall、 β -Gal2, β _Gal4相應(yīng)的蛋白質(zhì)的N末端區(qū)域氨基酸序列共通，因而基于編碼其的DNA序列而合成了 1種寡聚核苷酸F-Gal(序列號(hào)11)。另外，基于編碼各自推定的C末端區(qū)域氨基酸序列的DNA序列而合成3種寡聚核苷酸R-Gall、R-Gal2、R-Gal4 (序列號(hào)12、13、14)，并作為PCR引物。在正義引物F-Gal中附加McI限制性內(nèi)切酶識(shí)別部位，在反義引物R_Gall、 R-Gal2、R-Gal4中附加MlI限制性內(nèi)切酶識(shí)別部位。將這些引物和作為模板的具有β _半乳糖苷酶基因的染色體DNA，用以下的條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。<PCR 反應(yīng)液〉10XPCR 反應(yīng)緩沖液(Τ0Υ0Β0 公司)5. 0 μ 1dNTP 混合液(各 2. 5mM、Τ0Υ0Β0 公司)5. 0 μ 110μΜ 正義引物 1. 5μ 110μΜ 反義引物 1. 5μ 1
25mM MgS042. 0 μ 1蒸餾水33. Ομ 染色體DNA 溶液(200 μ g/ml) 1· O μ 1KOD-Plus-DNA 聚合酶(T0Y0B0 公司)1. 0 μ 1<PCR反應(yīng)條件〉步驟1 變性(94 °C、2分鐘)1循環(huán)步驟2 變性(94 °C、15秒)30循環(huán)退火(57°C、30秒)延伸(68°C、5 分鐘)用電泳確認(rèn)得到的PCR產(chǎn)物后，利用乙醇沉淀進(jìn)行脫鹽(69 μ 1)。接著，加入15 μ 1 的10ΧΤ緩沖液、10 μ 1的0. BSA溶液和SacI3y 1與SalI3 μ 1，在37°C中酶處理15 小時(shí)。用電泳確認(rèn)限制性內(nèi)切酶處理液，用NucleoSpin Extract II (Nippon Genetics公司)純化后，在預(yù)先經(jīng)Mel和Mil處理的載體pCold II DNA(Takara Bio公司)上連接 β-Gall、β-Gal2, β _Gal4 片段，得到了表達(dá)質(zhì)粒 pCold-Gall、Gal2、Gal4。(b) β -半乳糖苷酶在大腸桿菌中的表達(dá)將表達(dá)質(zhì)粒pCold-Gall、Gal2、Gal4 導(dǎo)入大腸桿菌 BL21Competent Cells (Takara Bio公司)中。從作為氨芐青霉素耐藥菌株而得到的轉(zhuǎn)化體中利用菌落PCR選擇保有了插入有目標(biāo)β-半乳糖苷酶基因的pC0ld-Gall、Ga12、(}a14的菌株。另外，還得到了作為對(duì)照而具有表達(dá)載體pCold II DNA的大腸桿菌BL21的轉(zhuǎn)化體。將這些轉(zhuǎn)化體接種于含有 100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基Iml中，在37°C以170rpm培養(yǎng)，直至達(dá)到0. D600 = 0. 4-1. 0 (預(yù)培養(yǎng))。接著，將預(yù)培養(yǎng)液300 μ 1接種于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基9ml中，在37°C以170rpm培養(yǎng)，直至達(dá)到0.D600 = 0.4-1.0。在15°C放置30分鐘后，添力卩9 μ 1的0. IM IPTG，在15°C以160rpm培養(yǎng)M小時(shí)(本培養(yǎng))，進(jìn)行集菌。將菌體懸浮于1. Oml的IOOmM磷酸緩沖液(pH 6. 0)中，加入Φ0. Imm的玻璃珠0. 50g，利用Multi Beads Siocker (安井機(jī)械公司)破碎菌體。破碎條件是將ON 120秒、OFF 60秒重復(fù)3. 75 循環(huán)。將得到的無細(xì)胞提取物(Cell free-extract)供給于離心分離，得到了可溶性成分。(c) β -半乳糖苷酶的表達(dá)確認(rèn)將獲取的可溶性成分提供到SDS-PAGE。作為電泳裝置使用PhastSystem (GE Healthcare 公司)，作為分離凝膠使用 PhastGel Homogeneous 7. 5 (GE Healthcare 公司)。其結(jié)果，如圖5所示，pCoId-Gall中在189kDa附近、pCoId-Gal2中在135kDa附近、 pCold-Gal4中在IMkDa附近分別確認(rèn)了認(rèn)為是β -GalU β -Gal2, β -Gal4的有意義的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。作為對(duì)照的pCold II DNA中沒有確認(rèn)同樣的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，因此認(rèn)為本蛋白質(zhì)是分別導(dǎo)入β-半乳糖苷酶基因β-Gall、β-Gal 2, i3_Gal4帶來的結(jié)果。另外，對(duì)于相同樣品，測(cè)定將ONPG和乳糖作為底物的半乳糖苷酶活性。將活性測(cè)定結(jié)果示于表2。[表2]
權(quán)利要求
1.一種來自環(huán)狀芽孢桿菌的半乳糖苷酶，其利用SDS-PAGE測(cè)得的分子量為 195kDa。
2.一種來自環(huán)狀芽孢桿菌的半乳糖苷酶，其由權(quán)利要求1所述的半乳糖苷酶的片段構(gòu)成。
3.—種β -半乳糖苷酶，由序列號(hào)7的氨基酸序列、或顯示β -半乳糖苷酶活性的其片段構(gòu)成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的β-半乳糖苷酶，其中，所述片段含有序列號(hào)7的氨基酸序列中從N末端到WSIGNEIY即序列號(hào)18的區(qū)域。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的β-半乳糖苷酶，其中，所述片段含有序列號(hào)8 10的任一序列號(hào)的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的β-半乳糖苷酶，其中，由含有序列號(hào)5的序列的DNA進(jìn)行編碼。
7.—種β-半乳糖苷酶基因，其由選自以下(a) (e)中的任一 DNA構(gòu)成(a)編碼序列號(hào)6或7的氨基酸序列的DNA；(b)含有序列號(hào)5的序列的DNA；(c)在嚴(yán)格條件下對(duì)與序列號(hào)5的序列互補(bǔ)的序列進(jìn)行雜交的DNA；(d)作為序列號(hào)5的序列的DNA序列簡(jiǎn)并體的DNA；(e)由以序列號(hào)5的序列為基準(zhǔn)并含有1個(gè)或多個(gè)堿基的取代、缺失、插入、附加或逆位的序列構(gòu)成的且編碼具有β -半乳糖苷酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的β-半乳糖苷酶基因，其中，具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白質(zhì)由序列號(hào)7的氨基酸序列中發(fā)生小于60%、優(yōu)選為小于45%、進(jìn)一步優(yōu)選為小于25%的變化的序列或其片段構(gòu)成。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的半乳糖苷酶基因，其中，所述變化為保守性氨基酸取代。
10.一種β -半乳糖苷酶，由權(quán)利要求7 9中任一項(xiàng)所述的β -半乳糖苷酶基因編碼。
11.一種重組載體，其含有權(quán)利要求7 9中任一項(xiàng)所述的半乳糖苷酶基因。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的重組載體，其為表達(dá)載體。
13.一種轉(zhuǎn)化體，其導(dǎo)入有權(quán)利要求7 9中任一項(xiàng)所述的半乳糖苷酶基因。
14.一種轉(zhuǎn)化體，其導(dǎo)入有權(quán)利要求11或12所述的重組載體。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的轉(zhuǎn)化體，其為細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或真菌細(xì)胞。
16.一種半乳糖苷酶的制造方法，其包括以下步驟(1)和O)(1)將權(quán)利要求13 15中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體在能產(chǎn)生由所述β-半乳糖苷酶基因編碼的蛋白質(zhì)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的步驟；(2)將產(chǎn)生的所述蛋白質(zhì)進(jìn)行回收的步驟。
17.一種酶劑，將權(quán)利要求1 6和10中任一項(xiàng)所述的β-半乳糖苷酶作為有效成分。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的酶劑，其中，所述有效成分是選自含有序列號(hào)7的氨基酸序列的β -半乳糖苷酶、含有序列號(hào)8的氨基酸序列的β -半乳糖苷酶、含有序列號(hào)9的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶和含有序列號(hào)10的氨基酸序列的β-半乳糖苷酶中的一種以上的半乳糖苷酶。
19.一種權(quán)利要求1 6和10中任一項(xiàng)所述的β -半乳糖苷酶或者權(quán)利要求17或18 所述的酶劑的使用，用于制造選自低乳糖牛奶、作為腸內(nèi)雙歧桿菌生長(zhǎng)因子的低聚半乳糖、 乳糖不耐受癥患者用藥品或補(bǔ)充劑中的制品。
20.低乳糖牛奶、作為腸內(nèi)雙歧桿菌生長(zhǎng)因子的低聚半乳糖、乳糖不耐受癥患者用藥品或補(bǔ)充劑，其使用權(quán)利要求1 6和10中任一項(xiàng)所述的β -半乳糖苷酶或者權(quán)利要求17 或18所述的酶劑而得到。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供新型β-半乳糖苷酶。提供來自環(huán)狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶及其基因。本發(fā)明的β-半乳糖苷酶可以用于牛奶、乳制品、發(fā)酵乳制品、低聚半乳糖或膳食補(bǔ)充劑的制造等。
文檔編號(hào)C12N9/38GK102449148SQ20108002394
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月5日
發(fā)明者中西一弘, 山口莊太郎, 星由紀(jì)子, 片瀨徹, 箕田正史, 長(zhǎng)屋美穗 申請(qǐng)人:天野酶株式會(huì)社