專(zhuān)利名稱(chēng)：選擇表達(dá)異源蛋白質(zhì)的真核細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及選擇表達(dá)目的產(chǎn)物的真核宿主細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的新方法。此外，本發(fā)明涉及用于以高產(chǎn)量有效產(chǎn)生目的產(chǎn)物的方法。
背景技術(shù)：
大量克隆和表達(dá)目的產(chǎn)物如重組肽的能力變得越來(lái)越重要。純化高水平的蛋白質(zhì)的能力在人用藥物和生物技術(shù)領(lǐng)域很重要，例如用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)藥物，以及在基礎(chǔ)研究的背景中，例如用于結(jié)晶蛋白質(zhì)，以允許測(cè)定它們的三維結(jié)構(gòu)。可以在宿主細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)和隨后分離和純化難于以其他方式批量獲得的蛋白質(zhì)。用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)的選擇取決于許多因素，其包含細(xì)胞生長(zhǎng)特征、 表達(dá)水平、胞內(nèi)和胞外表達(dá)、目的蛋白質(zhì)的翻譯后修飾和生物學(xué)活性、以及治療性蛋白質(zhì)產(chǎn)生中的監(jiān)管問(wèn)題和經(jīng)濟(jì)考慮。哺乳動(dòng)物細(xì)胞超越其他表達(dá)系統(tǒng)如細(xì)菌或酵母的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)是進(jìn)行正確的蛋白質(zhì)折疊、復(fù)雜的N-聯(lián)糖基化和真正的0-聯(lián)糖基化，以及廣譜的其他翻譯后修飾的能力。由于所述優(yōu)勢(shì)，真核細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞是目前選擇用于產(chǎn)生復(fù)雜的治療性蛋白質(zhì)如單克隆抗體的表達(dá)系統(tǒng)。最常見(jiàn)的獲得高表達(dá)宿主細(xì)胞(也稱(chēng)為高產(chǎn)者)的方法以產(chǎn)生用于表達(dá)目的產(chǎn)物的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體作為第一步。表達(dá)載體驅(qū)動(dòng)編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸在宿主細(xì)胞中表達(dá)，并提供至少一個(gè)用于產(chǎn)生重組細(xì)胞系的選擇性標(biāo)記。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的關(guān)鍵元件通常包含具有強(qiáng)健轉(zhuǎn)錄活性的組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；通常包含Kozak序列的優(yōu)化的mRNA加工和翻譯信號(hào)、翻譯終止密碼子、mRNA切割和加A信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止子及用于制備穩(wěn)定細(xì)胞系和用于基因擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記；此外，表達(dá)載體可以提供用于載體在細(xì)菌中增殖的原核復(fù)制起點(diǎn)和選擇性標(biāo)記。近年來(lái)，研發(fā)的焦點(diǎn)集中在用于宿主細(xì)胞中的基因表達(dá)的改進(jìn)的載體的設(shè)計(jì)上。 盡管有許多可用的載體，但以高產(chǎn)量在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中強(qiáng)健地產(chǎn)生多肽/蛋白質(zhì)仍具有挑戰(zhàn)性。一種已建立的用于獲得以高產(chǎn)量表達(dá)目的產(chǎn)物的高產(chǎn)細(xì)胞系的方法是宿主細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。但是，穩(wěn)定摻入基因組中是罕見(jiàn)事件，且只有小部分穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞是高產(chǎn)者。 因此，它們的選擇具有挑戰(zhàn)性。選擇性標(biāo)記和選擇系統(tǒng)廣泛用于遺傳工程、重組DNA技術(shù)和重組產(chǎn)物的產(chǎn)生，以獲得以高產(chǎn)量表達(dá)目的產(chǎn)物的宿主細(xì)胞。各個(gè)系統(tǒng)還用于產(chǎn)生和鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆。使用各個(gè)選擇性標(biāo)記和選擇系統(tǒng)的主要目的是引入選擇性基因，通過(guò)暴露于選擇性生長(zhǎng)條件，該選擇性基因允許鑒定能夠高水平產(chǎn)生所引入的選擇性標(biāo)記，并因此高水平產(chǎn)生目的產(chǎn)物的細(xì)胞。將例如缺乏酶，如二氫葉酸還原酶(DHFR)或谷氨酰胺合成酶(GS)的細(xì)胞系與包含編碼這些選擇性標(biāo)記酶的基因的表達(dá)載體及諸如氨甲蝶呤(MTX，其抑制DHFR)和甲硫氨酸亞氨基代砜(methionine sulfoxamineJSX，其抑制GS)的藥劑結(jié)合使用，可以例如通過(guò)基因擴(kuò)增來(lái)達(dá)到提高產(chǎn)物表達(dá)的產(chǎn)量。
現(xiàn)有技術(shù)中常用的一種突出的選擇系統(tǒng)是二氫葉酸還原酶/MTX選擇系統(tǒng)。二氫葉酸還原酶(DHFR)催化二氫葉酸至四氫葉酸(THF)的NADP依賴(lài)性還原。然后THF內(nèi)轉(zhuǎn)化為分別用于嘌呤和胸苷酸從頭生物合成的10-甲?；?DHF和5，10-亞甲基-DHF。DHFR是催化dUMP在5，10-亞甲基-DHF依賴(lài)性反應(yīng)中轉(zhuǎn)化為dTMP的胸苷酸合酶(TS)的催化活性的副產(chǎn)物。因此，DHFR對(duì)DNA復(fù)制所需嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成必需的THF輔因子的回收至關(guān)重要。因此，缺乏DHFR基因(即通過(guò)定向基因組缺失)的細(xì)胞(例如CHO 細(xì)胞)可用作受體來(lái)在無(wú)核苷酸的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染DHFR基因。轉(zhuǎn)染后，使細(xì)胞接受濃度逐漸增加的抗葉酸鹽劑(antif0late)MTX (最有效的DHFR抑制劑(Kd = IpM))，從而迫使細(xì)胞產(chǎn)生提高水平的DHFR。多輪選擇后，選擇性標(biāo)記DHFR常經(jīng)歷顯著的擴(kuò)增。還可以將各個(gè)選擇性標(biāo)記的更敏感的突變體形式與野生型宿主細(xì)胞結(jié)合使用。備選地，已將對(duì)MTX具有主要抗性(即較低敏感性)的突變體小鼠DHFR或DHFR的其他突變體形式廣泛用作顯性選擇性標(biāo)記，其在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中明顯增強(qiáng)高水平MTX抗性的獲得。但是，現(xiàn)有技術(shù)中使用的DHFR/MTX 選擇系統(tǒng)的主要劣勢(shì)是此技術(shù)利用尤其是在高濃度下改變受體細(xì)胞基因型的致突變毒性劑MTX。這常產(chǎn)生MTX抗性細(xì)胞群體，其中由于例如還原葉酸鹽載體(RFC)中的功能突變的喪失/或RFC基因表達(dá)的喪失(二者都消除MTX攝取)而不存在目的靶基因的表達(dá)。但是， 為了達(dá)到足夠嚴(yán)格的選擇條件來(lái)分離以足夠的產(chǎn)量產(chǎn)生目的產(chǎn)物的宿主細(xì)胞，需要提高濃度的/高濃度的MTX。顯而易見(jiàn)，高嚴(yán)格性選擇系統(tǒng)對(duì)從轉(zhuǎn)染群體富集高產(chǎn)細(xì)胞至關(guān)重要。選擇系統(tǒng)的嚴(yán)格性越高，選擇過(guò)程后低產(chǎn)者的數(shù)目越少，而在轉(zhuǎn)染細(xì)胞群體中發(fā)現(xiàn)非常罕見(jiàn)的超高產(chǎn)克隆的可能性越高。因此，本發(fā)明的目的是提供用于選擇以高產(chǎn)量產(chǎn)生目的產(chǎn)物的宿主細(xì)胞的嚴(yán)格選擇系統(tǒng)，以及用于以足夠的產(chǎn)量產(chǎn)生目的產(chǎn)物的方法。具體而言，本發(fā)明的目的是提供需要更少量的毒性劑，尤其是MTX的嚴(yán)格選擇系統(tǒng)。此外，本發(fā)明的目的是提供用于以高產(chǎn)量產(chǎn)生目的產(chǎn)物的方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于選擇以高產(chǎn)量表達(dá)目的產(chǎn)物的宿主細(xì)胞的選擇系統(tǒng)，以及涉及各個(gè)產(chǎn)物，尤其是多肽，如抗體的產(chǎn)生。根據(jù)一方面，本發(fā)明涉及用于選擇至少一個(gè)表達(dá)目的產(chǎn)物的真核宿主細(xì)胞的方法，該方法至少包括以下步驟(a)提供多個(gè)真核宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞的細(xì)胞生存取決于葉酸鹽攝取，其中該真核宿主細(xì)胞至少包含⑴引入的編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸；和(ii)引入的編碼DHFR酶的多核苷酸；(b)在至少包含DHFR的抑制劑和限制濃度的葉酸鹽的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)該多個(gè)真核宿主細(xì)胞；(c)選擇至少一個(gè)表達(dá)該目的產(chǎn)物的真核宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生目的產(chǎn)物的方法，其包括在允許表達(dá)該目的產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)按照本發(fā)明選擇的宿主細(xì)胞。還提供選擇性培養(yǎng)基，其至少包含DHFR的抑制劑和限制濃度的葉酸鹽，其可以用于本發(fā)明的選擇方法中?！斑x擇性培養(yǎng)基”是用于選擇宿主細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，本申請(qǐng)的其他目的、特征、優(yōu)勢(shì)和方面將從以下描述和所附權(quán)利要求變得顯而易見(jiàn)。但是，應(yīng)理解，雖然指出了本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施方案，但以下描述、 所附權(quán)利要求和具體的實(shí)施例僅以說(shuō)明的方式給出。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，所公開(kāi)的發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的多種改變和修改將從對(duì)以下的閱讀變得顯而易見(jiàn)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用DHFR作為選擇性標(biāo)記的選擇系統(tǒng)，其需要更低濃度的毒性劑，如抗葉酸鹽劑MTX，但仍提供足以鑒定高產(chǎn)宿主細(xì)胞的嚴(yán)格選擇條件。根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供用于選擇至少一個(gè)表達(dá)目的產(chǎn)物的真核宿主細(xì)胞的方法，該方法至少包括以下步驟(a)提供多個(gè)真核宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞的細(xì)胞生存取決于葉酸鹽攝取，其中該真核宿主細(xì)胞至少包含(i)引入的編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸；和(ii)引入的編碼DHFR酶的多核苷酸；(b)在至少包含DHFR的抑制劑和限制濃度的葉酸鹽的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)該多個(gè)真核宿主細(xì)胞；(c)選擇至少一個(gè)表達(dá)目的產(chǎn)物的真核宿主細(xì)胞?！岸嗪塑账帷笔峭ǔ囊粋€(gè)脫氧核糖或核糖連接至另一個(gè)脫氧核糖或核糖的核苷酸的聚合物，且取決于背景，其指DNA以及RNA。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”不包含任意大小限制，且還包含含有修飾，尤其是修飾的核苷酸的多核苷酸。“目的產(chǎn)物”指待從該宿主細(xì)胞表達(dá)的產(chǎn)物。目的產(chǎn)物可以是例如多肽或多核苷酸，如RNA。優(yōu)選地，目的產(chǎn)物是多肽，尤其是免疫球蛋白分子。下文詳細(xì)描述了目的產(chǎn)物的其他實(shí)例。“引入的多核苷酸”指已例如通過(guò)使用諸如轉(zhuǎn)染的重組技術(shù)引入宿主細(xì)胞中的多核苷酸序列。宿主細(xì)胞可以包含或不包含各自對(duì)應(yīng)于與所引入的多核苷酸相同的多核苷酸的內(nèi)源性多肽?？梢岳缤ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)染可以摻入宿主細(xì)胞的基因組中(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染)的適宜載體來(lái)實(shí)現(xiàn)引入。下文詳細(xì)描述了允許將多核苷酸引入宿主細(xì)胞中的適宜的表達(dá)載體。在異源核酸未插入基因組中的情況下，異源核酸可以在隨后的階段，例如在細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂時(shí)丟失(瞬時(shí)轉(zhuǎn)染)。適宜的載體還可以例如通過(guò)附加型復(fù)制保持在宿主細(xì)胞中而不摻入基因組中。但是，現(xiàn)有技術(shù)中還已知用于將多核苷酸引入宿主細(xì)胞中的其他技術(shù)，下文對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步詳述?！癉HFR抑制劑”是抑制二氫葉酸還原酶(DHFR)活性的化合物。各個(gè)抑制劑可以例如與DHFR底物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合DHFR。適宜的DHFR抑制劑是例如抗葉酸鹽劑，如氨甲蝶呤(MTX)。其他實(shí)例包括但不限于三甲曲沙葡萄糖醛酸酯(trimetrexate glucuronate) (neutrexine)、三甲氧節(jié)二氨啼唆、乙胺啼唆(pyrimethamine)禾口培美曲塞(pemetrexed)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“選擇”尤其指用選擇性標(biāo)記和選擇性培養(yǎng)條件來(lái)選擇，并因此獲得已摻入本發(fā)明的載體或載體組合的宿主細(xì)胞的方法。因此，可以從轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的群體分離和/或富集成功轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。與已成功摻入本發(fā)明的載體或載體組合的宿主細(xì)胞相比，未成功摻入本發(fā)明的載體或載體組合的宿主細(xì)胞優(yōu)選在選擇性培養(yǎng)條件下死亡或生長(zhǎng)受損。選擇期間，可以從轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的群體將已成功摻入本發(fā)明的載體或載體組合的宿主細(xì)胞富集為庫(kù)(pool)。還可以在選擇期間從轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的群體分離單個(gè)宿主細(xì)胞(例如通過(guò)克隆選擇)。為了獲得成功轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的選擇方法的適宜實(shí)施方案(例如通過(guò)FACS分選或有限稀釋)為本領(lǐng)域公知，因此無(wú)需詳述?！叭~酸鹽的限制濃度”指選擇性培養(yǎng)基中葉酸鹽的濃度，其對(duì)宿主細(xì)胞提供選擇壓力。因此，葉酸鹽并不大量包含在選擇性培養(yǎng)基中，從而對(duì)宿主細(xì)胞提供選擇壓力。宿主細(xì)胞能夠攝入和加工以限制濃度包含于選擇性培養(yǎng)基中的葉酸鹽。宿主細(xì)胞不能加工的葉酸鹽且尤其是葉酸鹽的衍生物不能構(gòu)成選擇壓力，并因此不能構(gòu)成限制濃度。下文描述了適宜的濃度范圍?！岸嚯摹敝赴ㄟ^(guò)肽鍵連接在一起的氨基酸的聚合物的分子。多肽包含任意長(zhǎng)度的多肽，包含蛋白質(zhì)(例如具有超過(guò)50個(gè)氨基酸)和肽(例如具有2-49個(gè)氨基酸)。多肽包含任意活性或生物活性的蛋白質(zhì)和/或肽。下文概述了適宜的實(shí)例。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，用于提供能夠產(chǎn)生目的產(chǎn)物的重組真核細(xì)胞的選擇系統(tǒng)可以基于選擇性培養(yǎng)基中葉酸鹽的有限的可用性，連同DHFR作為選擇性標(biāo)記的使用。該系統(tǒng)廣泛應(yīng)用，即應(yīng)用于細(xì)胞生存取決于葉酸鹽的攝取的真核宿主細(xì)胞。如上文所述，現(xiàn)有技術(shù)必須使用稍高的抗葉酸鹽劑/MTX濃度來(lái)達(dá)到足夠的選擇壓力進(jìn)行基因擴(kuò)增，并從而達(dá)到目的產(chǎn)物的產(chǎn)生的增加。這是劣勢(shì)，因?yàn)榭谷~酸鹽劑如MTX具有毒性并可以在遺傳上改變宿主細(xì)胞。本發(fā)明的方法基于DHFR選擇性標(biāo)記與選擇性培養(yǎng)基中葉酸鹽的限制濃度的組合使用，其具有這樣的優(yōu)勢(shì)即使在低DHFR抑制劑濃度下，選擇嚴(yán)格性也顯著提高。因此，使用本發(fā)明的選擇系統(tǒng)時(shí)，即使在按低濃度將DHFR抑制劑(例如MTX)用于選擇性培養(yǎng)基中時(shí)也獲得高產(chǎn)者。因此，與用于提供允許鑒定高產(chǎn)細(xì)胞克隆的嚴(yán)格選擇條件的現(xiàn)有技術(shù)的方法相比，在使用本發(fā)明的教導(dǎo)時(shí)，需要更少的DHFR抑制劑，并因此具有更低的毒性劑濃度。 由于其獨(dú)特設(shè)計(jì)，提供了非常嚴(yán)格的選擇系統(tǒng)，其允許從轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞群體富集高產(chǎn)細(xì)胞。 本發(fā)明的選擇系統(tǒng)的此高嚴(yán)格性降低了在群體中選擇后群體中低產(chǎn)者的數(shù)目，提高了發(fā)現(xiàn)非常罕見(jiàn)的超高產(chǎn)克隆的可能性。選擇性培養(yǎng)基可以包含一種或多種類(lèi)型的葉酸鹽。本發(fā)明的葉酸鹽(folate)可以是例如氧化葉酸鹽(即葉酸(folic acid))或還原葉酸鹽或其衍生物。一般而言，葉酸鹽可以用于本發(fā)明內(nèi)，只要能夠優(yōu)選通過(guò)功能性膜結(jié)合葉酸鹽受體將這種葉酸鹽攝入真核細(xì)胞中。氧化葉酸鹽(即葉酸)以及葉酸的還原衍生物(稱(chēng)為還原葉酸鹽或四氫葉酸鹽 (THF))是一組B-9維生素，其是真核細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中嘌呤、胸苷酸和某些氨基酸的生物合成必需的輔因子和/或輔酶。THF輔因子對(duì)于DNA復(fù)制尤其重要，由此對(duì)于細(xì)胞增殖尤其重要。THF輔因子在一系列涉及嘌呤、胸苷酸和氨基酸的從頭生物合成以及甲基代謝(包含DNA的CpG島甲基化)的互連代謝途徑中作為一碳單位發(fā)揮作用。THF輔因子包含10-甲?；?THF (10-CH0-THF)，其在涉及嘌呤從頭生物合成的兩個(gè)關(guān)鍵的從頭甲?；D(zhuǎn)移酶反應(yīng)中貢獻(xiàn)一碳單位。氧化葉酸鹽的優(yōu)選的實(shí)例是葉酸。還原葉酸鹽的優(yōu)選的實(shí)例是5-甲基-四氫葉酸鹽、5-甲?；?四氫葉酸鹽、10-甲?；?四氫葉酸鹽和5，10-亞甲基-四氫葉酸鹽。選擇性培養(yǎng)基中葉酸鹽的濃度尤其取決于所使用的真核宿主細(xì)胞。500nM或更低、250nM或更低、150nM或更低、IOOnM或更低、75nM或更低、50nM或更低、25nM或更低、15nM 或更低、或甚至IOnM或更低，如7，5nM或更低的葉酸鹽濃度是適宜的。適宜的范圍包含 0. 1ηΜ-500ηΜ、0· 1ηΜ_250ηΜ、5 或 10ηΜ_250ηΜ、優(yōu)選 1ηΜ_150ηΜ、5 或 10ηΜ_150ηΜ、ΙηΜ-ΙΟΟηΜ、 5 或 IOnM-IOOnM 和更優(yōu)選 1ηΜ_50ηΜ、2. 5nM_50nM、10nM_50nM 或 12. 5nM_50nM。在用葉酸作為葉酸鹽時(shí)，這些范圍尤其適宜。從本發(fā)明的意義上說(shuō)，各濃度是有限的，因此適于對(duì)宿主細(xì)胞提供選擇壓力。濃度越低，所施加的選擇壓力越強(qiáng)，只要細(xì)胞仍然是活的。所述濃度范圍尤其適合于用CHO細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。用于選擇性培養(yǎng)基中的DHFR抑制劑的濃度也取決于所使用的真核宿主細(xì)胞。在假定選擇性培養(yǎng)基中DHFR抑制劑的濃度降低的情況下，500nM或更低、400nM或更低、300nM 或更低、250ηΜ或更低、200ηΜ或更低、150ηΜ或更低的DHFR抑制劑濃度是有利的。但是，優(yōu)選地，選擇性培養(yǎng)基包含至少I(mǎi)OnM的DHFR抑制劑。優(yōu)選的抗葉酸鹽劑(優(yōu)選MTX)濃度是 1ηΜ-500ηΜ、優(yōu)選10ηΜ_200ηΜ、10ηΜ_150ηΜ和更優(yōu)選ΙΟηΜ-ΙΟΟηΜ。選擇性培養(yǎng)基中的各濃度尤其適合用于CHO細(xì)胞。上文所述的葉酸鹽和抗葉酸鹽劑的優(yōu)選的濃度和濃度范圍可以彼此組合。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，使用選擇性培養(yǎng)基，其包含200nM或更低、優(yōu)選150nM或更低、優(yōu)選IOOnM或更低的DHFR抑制劑的濃度，優(yōu)選MTX的濃度；少于ΙΟΟηΜ、優(yōu)選少于75nM的葉酸鹽的濃度，優(yōu)選葉酸的濃度。在一個(gè)實(shí)施方案中，將12. 5nM-50nM的葉酸鹽濃度與IOnM-IOOnM的抗葉酸鹽劑濃度組合使用。優(yōu)選地，用葉酸和MTX作為葉酸鹽和抗葉酸鹽劑。葉酸和MTX的適宜濃度可以彼此依賴(lài)；優(yōu)選的組合是2. 5nM-75nM、2. 5nM_50nM 或12. 5nM-50nM的葉酸濃度與10nM_500nM、優(yōu)選IOnM-IOOnM的MTX濃度組合。在使用 DHFR+(正)細(xì)胞時(shí)，尤其優(yōu)選這些濃度。上述濃度尤其適合用于快速生長(zhǎng)的懸浮細(xì)胞，其是商業(yè)產(chǎn)生細(xì)胞系的優(yōu)選表型。 但是，不同細(xì)胞系可以具有不同的葉酸消耗特性。此外，限制性/選擇性濃度可以取決于所使用的葉酸鹽、各自的抗葉酸鹽劑而不同。因此，對(duì)于不同細(xì)胞系，葉酸鹽(尤其是葉酸) 和抗葉酸鹽劑(尤其是MTX)的限制濃度以及葉酸與MTX的適宜比例可以不同。但是，技術(shù)人員可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)容易地測(cè)定適宜的濃度。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，在轉(zhuǎn)染和/或選擇之前，在無(wú)葉酸鹽的培養(yǎng)基中或在包含限制濃度的葉酸鹽的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)宿主細(xì)胞。上文描述了葉酸鹽的適宜的限制濃度。優(yōu)選地，用于預(yù)培養(yǎng)宿主細(xì)胞的該培養(yǎng)基以50nM或更低的濃度包含葉酸鹽，尤其是葉酸。摻入的選擇性標(biāo)記DHFR的表達(dá)為宿主細(xì)胞提供了選擇性培養(yǎng)條件下的選擇優(yōu)勢(shì)。例如，缺乏DHFR基因(例如通過(guò)定向基因組缺失，也稱(chēng)為DHFR-宿主細(xì)胞)的宿主細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)可以用作受體，用于在無(wú)核苷酸的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染DHFR基因作為選擇性標(biāo)記基因。但是，如果使用適當(dāng)?shù)倪x擇性培養(yǎng)條件，則在進(jìn)行DHFR選擇時(shí)，還可能使用內(nèi)源性表達(dá)DHFR的宿主細(xì)胞(DHFR+(正)宿主細(xì)胞)。用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)染后，可以使細(xì)胞接受濃度逐漸提高的DHFR抑制劑。DHFR抑制劑的一個(gè)實(shí)例是抗葉酸鹽劑如MTX，其是有效的DHFR抑制劑(Kd= IpM)。抗葉酸鹽劑如MTX在培養(yǎng)基中的存在迫使細(xì)胞產(chǎn)生提高水平的DHFR來(lái)存活。通過(guò)多輪選擇，選擇性標(biāo)記DHFR常經(jīng)歷顯著的基因擴(kuò)增，以達(dá)到產(chǎn)生提高水平的DHFR。
現(xiàn)有技術(shù)中已知可以與本發(fā)明結(jié)合使用的幾種適宜的DHFR基因。DHFR可以是野生型DHFR或其功能性變體或衍生物。術(shù)語(yǔ)“變體”或“衍生物”包含就各DHFR酶的氨基酸序列而言具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列交換(例如缺失、取代或添加)的DHFR酶、包含DHFR 酶或其功能性片段的融合蛋白質(zhì)和已修飾來(lái)提供其他結(jié)構(gòu)和/或功能的DHFR酶，以及前述的功能性片段，該片段仍然具有DHFR酶的至少一種功能。DHFR酶/變體可以用作選擇性標(biāo)記，其比野生型DHFR酶對(duì)MTX更敏感或更不敏感。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，所使用的DHFR酶比對(duì)應(yīng)的野生型DHFR酶和/或由宿主細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)(如果表達(dá))的DHFR酶對(duì)抗葉酸鹽劑如 MTX更敏感。DHFR酶可以源自任意物種，只要它在本發(fā)明內(nèi)是有功能的，即與所利用的宿主細(xì)胞相容。例如，對(duì)MTX具有主要抗性的突變體小鼠DHFR已廣泛用作顯性選擇性標(biāo)記，其顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)染子細(xì)胞中高水平MTX抗性的獲得。優(yōu)選地，使用比內(nèi)源表達(dá)于DHFR+(正)宿主細(xì)胞中的DHFR酶對(duì)DHFR抑制劑如MTX更不易感并因此更不敏感的DHFR酶。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，在DHFR基因可讀框的3’端放置內(nèi)含子或其片段。這對(duì)該構(gòu)建體的表達(dá)/擴(kuò)增速率具有有利作用。用于DHFR表達(dá)盒中的內(nèi)含子導(dǎo)致DHFR基因的更小的非功能性變體(Grillari等，2001，J. Biotechnol. 87，59-65)。因此，DHFR基因的表達(dá)水平降低，并因此可以進(jìn)一步提高該選擇系統(tǒng)的嚴(yán)格性。因此，宿主細(xì)胞可以包含引入的編碼 DHFR酶的多核苷酸，該多核苷酸包含定位在DHFR編碼序列3’的內(nèi)含子。利用內(nèi)含子來(lái)降低DHFR基因的表達(dá)水平的備選方法描述于EP 0724639中，且也可以使用。與合成其自身葉酸鹽的大多數(shù)原核生物、植物和真菌不同，哺乳動(dòng)物和其他真核生物物種缺乏THF輔因子生物合成，因此必須從外源來(lái)源，通常是從培養(yǎng)基獲得它們。目前已知三個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中介導(dǎo)葉酸鹽和抗葉酸鹽劑的攝取，即還原葉酸鹽載體(RFC)、質(zhì)子偶聯(lián)葉酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PCFT，也稱(chēng)為SLC46A)和葉酸鹽受體(FR)。優(yōu)選地，真核宿主細(xì)胞選自哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞和真菌細(xì)胞。真菌細(xì)胞和植物細(xì)胞可以是葉酸鹽原養(yǎng)型(即這類(lèi)細(xì)胞可以自主合成其細(xì)胞生存(即細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖)必需的其自身的葉酸鹽)。本發(fā)明尤其包含是葉酸鹽營(yíng)養(yǎng)缺陷型或可以成為葉酸鹽營(yíng)養(yǎng)缺陷型的這類(lèi)真菌和植物細(xì)胞。這可以例如由遺傳操作引起，即細(xì)胞現(xiàn)在不能合成其細(xì)胞生存必需的足量的葉酸鹽。例如，可以例如通過(guò)適當(dāng)?shù)陌谢虻幕蚱茐幕蚧虺聊?，或關(guān)鍵酶的抑制等來(lái)失活這類(lèi)真菌或植物細(xì)胞例如經(jīng)適當(dāng)?shù)拇x途徑內(nèi)源性生物合成葉酸鹽的能力。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。該哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以選自嚙齒動(dòng)物細(xì)胞、人細(xì)胞和猴細(xì)胞。尤其優(yōu)選的是嚙齒動(dòng)物細(xì)胞，其優(yōu)選選自CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、NSO細(xì)胞、小鼠3T3成纖維細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞。最尤其優(yōu)選的嚙齒動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。還優(yōu)選人細(xì)胞，優(yōu)選地，其選自HEK293細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞、PerC6細(xì)胞和HeLa細(xì)胞。其他優(yōu)選的是猴細(xì)胞，優(yōu)選地，其選自C0S-1、C0S-7細(xì)胞和Vero細(xì)胞。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞是DHFR+(正)細(xì)胞，尤其是DHFR+ (正)CHO細(xì)胞。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，通過(guò)至少一個(gè)表達(dá)載體來(lái)引入編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸和編碼DHFR酶的多核苷酸。用于引入各個(gè)載體的適宜的技術(shù)描述于下文，且包括例如轉(zhuǎn)染。本發(fā)明的“表達(dá)載體”是能夠攜帶至少一個(gè)外源核酸片段的多核苷酸。載體像分子運(yùn)載體一樣，將核酸片段各自的多核苷酸遞送入宿主細(xì)胞中。它包含至少一個(gè)表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含用于正確表達(dá)摻入其中的多核苷酸的調(diào)節(jié)序列?？梢詫⒍嗪塑账?例如編碼目的產(chǎn)物或選擇性標(biāo)記)插入表達(dá)載體的表達(dá)盒中來(lái)從該載體表達(dá)。本發(fā)明的表達(dá)載體可以以環(huán)狀或線(xiàn)性化形式存在。術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”還包含允許轉(zhuǎn)移外源核酸片段的人工染色體或類(lèi)似的各個(gè)多核苷酸。編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸和編碼DHFR酶的多核苷酸可以定位在相同或不同的表達(dá)載體上。使用攜帶兩種多核苷酸的表達(dá)載體具有僅需將一個(gè)表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞中的優(yōu)勢(shì)。此外，尤其是在建立穩(wěn)定表達(dá)系時(shí)，多核苷酸更有可能一起摻入基因組中，并因此以相似的產(chǎn)量表達(dá)。但是，使用至少兩個(gè)表達(dá)載體的組合進(jìn)行轉(zhuǎn)染也是可能的，且在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其中各個(gè)多核苷酸定位在不同的表達(dá)載體上。然后將表達(dá)載體的該組合轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中。真核宿主細(xì)胞可以包含至少一個(gè)其他引入的編碼另一目的產(chǎn)物的多核苷酸。此實(shí)施方案尤其適合用于表達(dá)免疫球蛋白分子。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，宿主細(xì)胞包含分別編碼目的產(chǎn)物的至少兩個(gè)引入的多核苷酸，其中至少一個(gè)多核苷酸編碼免疫球蛋白分子的重鏈或其功能性片段，而另一多核苷酸編碼免疫球蛋白分子的輕鏈或其功能性片段?？梢酝ㄟ^(guò)使用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體來(lái)引入各個(gè)多核苷酸。在使用至少兩個(gè)表達(dá)載體的組合的情況下，該編碼免疫球蛋白分子的重鏈和輕鏈(或其功能性片段)的多核苷酸可以定位在相同或不同的表達(dá)載體上。宿主細(xì)胞和因此用于將多核苷酸引入該宿主細(xì)胞中的表達(dá)載體可以額外地包含編碼一個(gè)或多個(gè)其他選擇性標(biāo)記的一個(gè)或多個(gè)其他多核苷酸。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以應(yīng)用將本發(fā)明的系統(tǒng)與一個(gè)或多個(gè)不同的選擇系統(tǒng)(例如抗生素抗性選擇系統(tǒng)，如ne0/G418) —起利用的共選擇來(lái)進(jìn)一步改善性能。除允許選擇真核宿主細(xì)胞的其他真核選擇性標(biāo)記外，還可以使用允許真核宿主細(xì)胞中的選擇的原核選擇性標(biāo)記。各個(gè)原核選擇性標(biāo)記的實(shí)例是提供對(duì)諸如例如氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素和/或氯霉素的抗生素的抗性的標(biāo)記。用于將多核苷酸引入宿主細(xì)胞中的載體通常包含諸如例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、加A 信號(hào)、轉(zhuǎn)錄中止或終止信號(hào)的適于驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄控制元件作為表達(dá)盒的元件。如果希望的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，則優(yōu)選適宜的轉(zhuǎn)錄控制元件包含于載體中，并與待表達(dá)的多核苷酸有效連接，例如，導(dǎo)致適合用于招募核糖體的5’帽結(jié)構(gòu)的5’非翻譯區(qū)和終止翻譯過(guò)程的終止密碼子。尤其是，可以在存在于適當(dāng)?shù)膯?dòng)子中的轉(zhuǎn)錄元件的控制下轉(zhuǎn)錄作為選擇性標(biāo)記基因的多核苷酸以及編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸。產(chǎn)生的選擇性標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)錄物和目的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)錄物具有便于實(shí)質(zhì)水平的蛋白質(zhì)表達(dá)(即翻譯)和正確的翻譯終止的功能性翻譯元件。能夠正確驅(qū)動(dòng)摻入的多核苷酸的表達(dá)的功能性表達(dá)單位在本文中也稱(chēng)為“表達(dá)盒”。用于將多核苷酸引入真核宿主細(xì)胞中的本發(fā)明的表達(dá)載體或表達(dá)載體的組合可以包含至少一個(gè)啟動(dòng)子和/或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件作為表達(dá)盒的元件。雖然這兩個(gè)控制元件間的物理邊界并非總是清晰，但術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”通常指RNA聚合酶和/或任意相關(guān)因子與之結(jié)合并在其上起始轉(zhuǎn)錄的核酸分子上的位點(diǎn)。增強(qiáng)子在時(shí)間及空間上增強(qiáng)啟動(dòng)子活性。 許多啟動(dòng)子在廣范圍的細(xì)胞類(lèi)型中具有轉(zhuǎn)錄活性。啟動(dòng)子可以劃分為兩類(lèi)組成性發(fā)揮作用的啟動(dòng)子和通過(guò)誘導(dǎo)或脫阻抑來(lái)調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。兩種類(lèi)型都適合用于本發(fā)明的教導(dǎo)。用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平產(chǎn)生多肽的啟動(dòng)子應(yīng)是強(qiáng)啟動(dòng)子，且優(yōu)選在廣范圍的細(xì)胞類(lèi)型中具有活性。在許多細(xì)胞類(lèi)型中驅(qū)動(dòng)表達(dá)的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子包括但不限于腺病毒主要晚期啟動(dòng)子、人巨細(xì)胞病毒即時(shí)早期啟動(dòng)子、SV40和勞斯肉瘤病毒啟動(dòng)子及鼠3-磷酸甘油酸激酶啟動(dòng)子EFla。在啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子獲自CMV和/或SV40時(shí)，用本發(fā)明的表達(dá)載體達(dá)到了良好的結(jié)果。轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子可以選自SV40啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、EFl α啟動(dòng)子、RSV啟動(dòng)子、 BR0AD3啟動(dòng)子、鼠rosa沈啟動(dòng)子、pCEFL啟動(dòng)子和β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。優(yōu)選地，編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸和編碼DHFR酶的多核苷酸處于不同轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的控制下。一般而言，能夠促進(jìn)必需多核苷酸在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)，尤其是轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子將是適宜的。驅(qū)動(dòng)從多核苷酸表達(dá)的不同轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子可以是相同的或不同的。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，用比驅(qū)動(dòng)編碼DHFR酶和/或其他選擇性標(biāo)記(如果存在)的表達(dá)的啟動(dòng)子更強(qiáng)的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸的表達(dá)。此安排具有產(chǎn)生比選擇性標(biāo)記轉(zhuǎn)錄物多的目的產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄物的作用。目的產(chǎn)物的產(chǎn)生顯著超過(guò)選擇性標(biāo)記的產(chǎn)生是有利的，因?yàn)閱蝹€(gè)細(xì)胞產(chǎn)生異源產(chǎn)物的能力并非是無(wú)限的，因此應(yīng)集中于目的產(chǎn)物。此外，選擇過(guò)程僅發(fā)生在建立表達(dá)細(xì)胞系的起始階段，然后其不斷產(chǎn)生目的產(chǎn)物。因此，將細(xì)胞的資源集中于目的產(chǎn)物的表達(dá)/產(chǎn)生是有利的。此外，用較弱的啟動(dòng)子來(lái)表達(dá)選擇性標(biāo)記，尤其是DHFR進(jìn)一步提高了選擇壓力，并因此允許在選擇性培養(yǎng)基中使用較低濃度的DHFR抑制劑。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，驅(qū)動(dòng)編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸的表達(dá)的啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子，而驅(qū)動(dòng)編碼DHFR酶的多核苷酸的表達(dá)的啟動(dòng)子是SV40啟動(dòng)子。已知CMV啟動(dòng)子是可用于哺乳動(dòng)物表達(dá)的最強(qiáng)的啟動(dòng)子之一，且導(dǎo)致非常好的表達(dá)速率。認(rèn)為它比SV40啟動(dòng)子產(chǎn)生顯著更多的轉(zhuǎn)錄物。根據(jù)另一實(shí)施方案，編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸和編碼DHFR酶的多核苷酸處于相同的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的控制下，并因此從一個(gè)表達(dá)盒表達(dá)。上文描述了適宜的啟動(dòng)子。在此實(shí)施方案中，從處于該轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的控制下的各個(gè)表達(dá)盒獲得一個(gè)長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄物。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，將至少一個(gè)IRES元件有功能地定位在編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸和/或編碼DHFR酶的多核苷酸之間。從而確保從該轉(zhuǎn)錄物獲得分開(kāi)的翻譯產(chǎn)物。表達(dá)盒可以包含適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)。從上游啟動(dòng)子連續(xù)轉(zhuǎn)錄通過(guò)第二轉(zhuǎn)錄單位可以抑制下游啟動(dòng)子的功能(稱(chēng)為啟動(dòng)子封堵或轉(zhuǎn)錄干擾的現(xiàn)象)。在原核生物和真核生物中都已描述了此事件。在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單位之間正確放置轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)可以防止啟動(dòng)子封堵。轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)已得到良好的表征，已顯示將它們摻入表達(dá)載體中對(duì)基因表達(dá)具有多種有益作用。所使用的宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。大多數(shù)真核生物新生 mRNA在其3’端具有聚腺苷酸尾，其是在涉及初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的切割和偶聯(lián)的聚腺苷酸化反應(yīng)的復(fù)雜過(guò)程期間添加的。聚腺苷酸尾對(duì)mRNA穩(wěn)定性和可轉(zhuǎn)移性是有利的。因此，用于表達(dá)編碼目的產(chǎn)物和DHFR酶的多核苷酸的表達(dá)盒通常包含適合用于轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷化作用的聚腺苷酸化位點(diǎn)。存在幾種可以用于哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中的有效的加A信號(hào)，包含源自牛生長(zhǎng)激素(bgh)、小鼠珠蛋白、SV40早期轉(zhuǎn)錄單位和單純皰疹病毒胸苷激酶基因的那些。但是，還已知合成的聚腺苷酸化位點(diǎn)(參見(jiàn)例如Promega的pCI-neo表達(dá)載體，其基于Levitt等，1989，Genes Dev. 3，(7) :1019-1025)。聚腺苷酸化位點(diǎn)可以選自SV40聚腺苷酸化位點(diǎn)，如SV40晚期和早期聚腺苷酸化位點(diǎn)(參見(jiàn)例如Subramani等，1981，Mol. Cell. Biol. 854-864中所述的質(zhì)粒pSV2_DHFR)、合成的聚腺苷酸化位點(diǎn)(參見(jiàn)例如Promega的pCI-neo 表達(dá)載體，其基于 Levitt 等，1989，Genes Dev. 3, (7) :1019-1025)和 bgh 聚腺苷酸化位點(diǎn)(牛生長(zhǎng)激素)。此外，包含編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸和編碼DHFR酶的多核苷酸的表達(dá)盒可以包含至少一個(gè)內(nèi)含子。在用哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)時(shí)，此實(shí)施方案尤其適宜。來(lái)自高等真核生物的大多數(shù)基因包含在RNA加工期間去除的內(nèi)含子。各個(gè)構(gòu)建體在轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)中比缺乏內(nèi)含子的相同構(gòu)建體更有效地表達(dá)。通常，將內(nèi)含子放置在可讀框的5’端，但也可以放置在3’端。因此，可以將內(nèi)含子包含于表達(dá)盒中來(lái)提高表達(dá)速率。該內(nèi)含子可以定位在啟動(dòng)子和/或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件與待表達(dá)的多核苷酸的可讀框的5’端之間。現(xiàn)有技術(shù)中已知可以與本發(fā)明結(jié)合使用的幾種適宜的內(nèi)含子。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，在用于表達(dá)目的產(chǎn)物的表達(dá)盒中使用的內(nèi)含子是合成內(nèi)含子，如SIS或RK內(nèi)含子。RK內(nèi)含子是強(qiáng)的合成內(nèi)含子，優(yōu)選將其放置在目的基因的ATG起始密碼子前。RK內(nèi)含子由CMV啟動(dòng)子的內(nèi)含子供體剪接位點(diǎn)和小鼠IgG重鏈可變區(qū)的受體剪接位點(diǎn)組成(參見(jiàn)例如 Eaton 等，1986，Biochemistry 25,8343-8347 ；Neuberger 等， 1983，EMB0J. 2(8)，1373-1378 ；它可以獲自 pRK-5 載體(BD PharMingen))。可以以其環(huán)狀形式將包含上文所述的多核苷酸和/或表達(dá)盒的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中。由于內(nèi)切核酸酶和外切核酸酶的活性，超螺旋載體分子通常將在核內(nèi)轉(zhuǎn)化為線(xiàn)性分子。但是，轉(zhuǎn)染前將表達(dá)載體線(xiàn)性化通常改善穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的效率。這還因?yàn)樵谵D(zhuǎn)染前線(xiàn)性化表達(dá)載體可以控制線(xiàn)性化的點(diǎn)。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，表達(dá)載體或至少兩個(gè)表達(dá)載體的組合包含至少一個(gè)預(yù)先確定的限制位點(diǎn)，其可以用于在轉(zhuǎn)染前線(xiàn)性化該載體。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，這樣排列線(xiàn)性化位點(diǎn)，使得通過(guò)線(xiàn)性化，編碼DHFR酶的多核苷酸定位在編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸的5’。此排列對(duì)基因擴(kuò)增有利。在額外使用原核選擇性標(biāo)記的情況下，編碼該原核標(biāo)記的多核苷酸定位在編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸的3’。這具有這樣的作用該原核選擇性標(biāo)記基因處于3’，并因此處于該線(xiàn)性化載體核酸的“哺乳動(dòng)物”部分 “之外”。此排列是有利的，因?yàn)橥茰y(cè)原核基因?qū)Σ溉閯?dòng)物表達(dá)不利，因?yàn)樵诵蛄锌梢栽诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中導(dǎo)致增加的甲基化或其他沉默效應(yīng)。優(yōu)選將編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸和編碼DHFR酶的多核苷酸穩(wěn)定引入該宿主細(xì)胞中。穩(wěn)定引入或轉(zhuǎn)染對(duì)表達(dá)細(xì)胞系的建立，尤其是對(duì)目的產(chǎn)物的大規(guī)模產(chǎn)生和因此對(duì)工業(yè)產(chǎn)生是有利的?，F(xiàn)有技術(shù)中已知用于將多核苷酸和表達(dá)載體引入真核宿主細(xì)胞(包含哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞)中的幾種適當(dāng)?shù)姆椒ā８鞣N方法包括但不限于磷酸鈣轉(zhuǎn)染、電穿孔、脂質(zhì)體、生物射彈和聚合物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。除傳統(tǒng)的基于隨機(jī)摻入的方法外，還可以用重組介導(dǎo)法來(lái)將編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸和編碼DHFR酶的多核苷酸轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞基因組中。這類(lèi)重組介導(dǎo)法可以包括使用位點(diǎn)特異性重組酶如Cre、Flp或Φ031 (參見(jiàn)例如 Oumard等，Cytotechnology (2006) 50 :93-108)，其可以介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的定向插入。備選地， 可以用同源重組的機(jī)制來(lái)插入該多核苷酸(綜述于Sorrell等，Biotechnology Advances 23(2005)431-469中)。基于重組的基因插入允許最小化包含在轉(zhuǎn)移/引入至宿主細(xì)胞的異源核酸中的元件數(shù)。例如，可以使用已提供了啟動(dòng)子和聚腺苷酸化位點(diǎn)(外源或內(nèi)源) 的插入基因座，使得僅需將其余元件(例如編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸和編碼DHFR酶的多核苷酸)轉(zhuǎn)移/轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞。上文詳細(xì)描述了本發(fā)明的適宜的表達(dá)載體或表達(dá)載體的組合的實(shí)施方案以及適宜的宿主細(xì)胞；我們稱(chēng)之為以上公開(kāi)內(nèi)容。在除DHFR酶外還使用其他選擇性標(biāo)記的情況下，可以在應(yīng)用用于DHFR酶的選擇性條件之前應(yīng)用用于該選擇性標(biāo)記的選擇性條件。例如，在將新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neo) 用作其他選擇性標(biāo)記的情況下，可以首先在例如包含G418的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，以選擇摻入了本發(fā)明的表達(dá)載體的細(xì)胞。本發(fā)明除DHFR選擇性標(biāo)記外還在選擇性培養(yǎng)基中使用限制濃度的葉酸鹽的策略具有這樣的優(yōu)勢(shì)即使使用較低的DHFR抑制劑濃度也獲得非常高的嚴(yán)格性。從這些新的選擇條件存活的細(xì)胞群體的生產(chǎn)力顯著提高。實(shí)施例已顯示該選擇方法后獲得的宿主細(xì)胞以高產(chǎn)量產(chǎn)生目的產(chǎn)物。單個(gè)宿主細(xì)胞的平均生產(chǎn)力也提高。因此，提高了以較低的篩選努力發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)克隆的可能性。因此，本發(fā)明的選擇系統(tǒng)優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)中使用的選擇系統(tǒng)。具體而言，與單獨(dú)使用各個(gè)選擇性標(biāo)記相比，獲得了具有更高生產(chǎn)力的宿主細(xì)胞。因此，由于選擇條件的更高的嚴(yán)格性，優(yōu)化了選擇方法?！銓淖畛醯募?xì)胞群體的非選擇細(xì)胞分離并可以富集由于本發(fā)明的嚴(yán)格的篩選/選擇方法而獲得的細(xì)胞。它們可以作為單個(gè)細(xì)胞分離和培養(yǎng)。它們還可以用于一個(gè)或多個(gè)其他選擇周期，可選地進(jìn)行其他定性或定量分析，或者可以用于例如開(kāi)發(fā)用于蛋白質(zhì)產(chǎn)生的細(xì)胞系。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，直接將按上文所述選擇的產(chǎn)生宿主細(xì)胞的富集群體用作用于以高產(chǎn)量產(chǎn)生目的多肽的群體。優(yōu)選地，選擇穩(wěn)定表達(dá)目的產(chǎn)物的宿主細(xì)胞。上文詳細(xì)描述了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染/表達(dá)的優(yōu)勢(shì)。我們稱(chēng)之為以上公開(kāi)內(nèi)容。還提供用于產(chǎn)生目的產(chǎn)物的方法，其至少包括以下步驟(a)進(jìn)行本發(fā)明的選擇方法來(lái)選擇至少一個(gè)表達(dá)目的產(chǎn)物的真核宿主細(xì)胞；和(b)在允許表達(dá)目的產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)至少一個(gè)選擇的真核宿主細(xì)胞。由于本發(fā)明的選擇方法允許鑒定高產(chǎn)細(xì)胞克隆，該選擇系統(tǒng)是產(chǎn)生方法的重要的和摻入的部分?？梢酝ㄟ^(guò)破碎細(xì)胞獲得目的產(chǎn)物。多肽還可以例如分泌表達(dá)在培養(yǎng)基中， 并可以從培養(yǎng)基獲得。各個(gè)方法的組合也是可能的。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，在無(wú)血清的條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞。因此，可以以高產(chǎn)量有效地產(chǎn)生和獲得/分離產(chǎn)物，尤其是多肽。所獲得的產(chǎn)物還可以接受其他加工步驟，例如純化和/或修飾步驟。因此，用于產(chǎn)生目的產(chǎn)物的方法可以包括以下步驟中的至少一個(gè)-從該細(xì)胞培養(yǎng)基和/或從該宿主細(xì)胞分離目的產(chǎn)物；和/或-加工分離的目的產(chǎn)物。可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法回收和可選地進(jìn)一步加工，例如進(jìn)一步純化、分離和/ 或修飾按照本發(fā)明產(chǎn)生的目的產(chǎn)物，例如多肽。例如，可以通過(guò)包括但不限于離心、過(guò)濾、超濾、提取或沉淀的常規(guī)方法從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基回收產(chǎn)物。可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法進(jìn)行純化，其包括但不限于層析(例如離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法 (例如制備型等電聚焦)、差別溶解度(例如硫酸銨沉淀)或提取。目的產(chǎn)物可以是能夠通過(guò)由該多核苷酸編碼的遺傳信息的轉(zhuǎn)錄、翻譯或任意其他表達(dá)事件產(chǎn)生的任意生物產(chǎn)物。在這方面，產(chǎn)物將是表達(dá)產(chǎn)物。目的產(chǎn)物可以選自多肽、核酸，尤其是RNA或DNA。產(chǎn)物可以是具有藥物活性或治療活性的化合物、或?qū)⒃跍y(cè)定中利用的研究工具等。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，產(chǎn)物是多肽，優(yōu)選是具有藥物活性或治療活性的多肽，或是將在診斷或其他測(cè)試中使用的利用的研究工具等。因此，多肽不限于任意具體的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的組，相反，它可以是人們希望通過(guò)本文中公開(kāi)的方法來(lái)選擇和/或表達(dá)的任意大小、功能或來(lái)源的任意蛋白質(zhì)。因此，可以表達(dá)/產(chǎn)生幾種不同的目的多肽。如上文所述，術(shù)語(yǔ)多肽包含任意活性或生物活性的蛋白質(zhì)和/或肽，其包含例如生物活性多肽， 如酶蛋白質(zhì)或肽(例如蛋白酶、激酶、磷酸酶)、受體蛋白質(zhì)或肽、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)或肽、細(xì)菌和 /或內(nèi)毒素結(jié)合蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)或肽、免疫多肽、毒素、抗生素、激素、生長(zhǎng)因子、疫苗等。 該多肽可以選自肽類(lèi)激素、白細(xì)胞介素、組織纖溶酶原激活物、細(xì)胞因子、免疫球蛋白，尤其是抗體或功能性抗體片段或其變體。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽是免疫球蛋白分子或抗體、或其功能性變體，例如嵌合抗體、或部分或完全人源化的抗體。這種抗體可以是診斷抗體，或具有藥物活性或治療活性的抗體。還提供通過(guò)上文和權(quán)利要求中定義的本發(fā)明的方法獲得的產(chǎn)物。優(yōu)選地，該產(chǎn)物是多肽，尤其是免疫球蛋白分子或其功能性片段。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明還提供選擇性培養(yǎng)基，其包含限制濃度的葉酸鹽和至少一種DHFR抑制劑。優(yōu)選地，該選擇性培養(yǎng)基具有以下特征中的一個(gè)或多個(gè)(a)它以選自以下的濃度包含葉酸鹽，優(yōu)選葉酸(aa) 500nM 或更低；(bb) 250nM 或更低；(cc) 150nM 或更低；(dd) IOOnM 或更低；(ee) 75nM 或更低；(ff)50nM 或更低；(gg) 25nM 或更低；和 / 或(hh)15nM 或更低；和 / 或(b)它以選自以下的濃度范圍包含葉酸鹽，優(yōu)選葉酸(aa) 0. 1ηΜ_500ηΜ ；(bb) 0. 1ηΜ-250ηΜ,優(yōu)選 2· 5nM_250nM 或 5 或 10nM_250nM ；(cc) 0. 1ηΜ-150ηΜ,優(yōu)選 2，5nM_150nM 或 5 或 10nM_150nM ；(dd) InM-IOOnM,優(yōu)選 2. 5nM-IOOnM 或 5 或 IOnM-IOOnM ；(ee) 1ηΜ_75ηΜ，優(yōu)選 2· 5nM_75nM 或 5 或 10nM_75nM ；(ff) 1ηΜ-50ηΜ ；(gg) 2. 5nM-50nM ；禾口 / 或(hh) 12. 5nM-50nM ；禾口 / 或(c)它以選自以下的濃度包含DHFR抑制劑，優(yōu)選抗葉酸鹽劑(aa) 500nM 或更低；(bb) 400nM 或更低；(cc) 300nM 或更低；(dd) 250nM 或更低；
(ee) 200nM 或更低；(ff) 150nM 或更低；和 / 或(gg)l50nM 或更低；禾P/或(d)它以選自以下的濃度包含DHFR抑制劑，其優(yōu)選是抗葉酸鹽劑且更優(yōu)選是 MTX (aa) 1ηΜ-500ηΜ ；(bb) 10nM_200nM ；(cc) 10nM-150nM ；禾口 / 或(dd) IOnM-IOOnM。葉酸鹽和DHFR抑制劑的所示濃度和濃度范圍可以彼此組合。上文結(jié)合本發(fā)明的選擇方法詳細(xì)描述了濃度范圍的優(yōu)勢(shì)和其他優(yōu)選實(shí)施方案及選擇性培養(yǎng)基中葉酸鹽和抗葉酸鹽劑的適宜的實(shí)施方案；稱(chēng)之為以上公開(kāi)內(nèi)容。該選擇性培養(yǎng)基可以與本發(fā)明的選擇系統(tǒng)結(jié)合使用。本文中提到的文本和文件的全部?jī)?nèi)容在此引用作為參考，并因此構(gòu)成本公開(kāi)內(nèi)容的部分。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，而不以任意方式限制其范圍。具體而言，實(shí)施例涉及本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。
實(shí)施例一般而言，適宜的材料如試劑是技術(shù)人員熟悉的、市售的和可以按照廠家的說(shuō)明使用。按所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用包含用于表達(dá)單克隆抗體作為目的產(chǎn)物的表達(dá)盒的表達(dá)載體進(jìn)行CHO細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。作為選擇性標(biāo)記，G418抗性基因(NEO)和DHFR基因在分開(kāi)的表達(dá)盒中存在于表達(dá)載體上。此實(shí)驗(yàn)表明，在低葉酸條件下用減少的MTX量選擇產(chǎn)生高產(chǎn)細(xì)胞群體。作為參考，使用了 DHFR的標(biāo)準(zhǔn)選擇條件，其使用更高的MTX濃度和非限制量的葉酸。實(shí)施例I-DHFR和限制濃度的葉酸1. 1.表達(dá)載體表達(dá)載體是哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，其包含以相同的方向排列在表達(dá)載體上的以下決定性元件
權(quán)利要求
1.用于選擇至少一個(gè)表達(dá)目的產(chǎn)物的真核宿主細(xì)胞的方法，其至少包括以下步驟(a)提供多個(gè)真核宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞的細(xì)胞生存取決于葉酸鹽攝取，其中所述真核宿主細(xì)胞至少包含(i)引入的編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸；和( )引入的編碼DHFR酶的多核苷酸；(b)在至少包含DHFR的抑制劑和限制濃度的葉酸鹽的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述多個(gè)真核宿主細(xì)胞；(c)選擇至少一個(gè)表達(dá)所述目的產(chǎn)物的真核宿主細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述選擇性培養(yǎng)基包含濃度為500nM或更低的DHFR抑制劑和濃度為500nM或更低的葉酸鹽。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述選擇性培養(yǎng)基包含濃度為200nM或更低的DHFR抑制劑和濃度為2. 5nM-IOOnM的葉酸鹽。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中所述選擇性培養(yǎng)基包含濃度為12.5nM-50nM 的葉酸鹽與濃度為IOnM-IOOnM的MTX的組合。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中與由所述宿主細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)的DHFR酶相比， 所述DHFR酶對(duì)DHFR抑制劑具有較低的敏感性。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中所述真核宿主細(xì)胞是CHO宿主細(xì)胞，優(yōu)選 DHFR+(正)細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中將DHFR+(正)宿主細(xì)胞與引入的DHFR酶結(jié)合使用；與所述宿主細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)的DHFR酶相比，所述引入的DHFR酶對(duì)MTX更不敏感。
8.權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的方法，其中已通過(guò)至少一個(gè)表達(dá)載體引入編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸和編碼DHFR酶的多核苷酸。
9.權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)的方法，其中所述宿主細(xì)胞包含至少兩個(gè)引入的編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸，其中優(yōu)選至少一個(gè)多核苷酸編碼免疫球蛋白分子的重鏈，而另一多核苷酸編碼免疫球蛋白分子的輕鏈。
10.權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的方法，其中所述引入的編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸和所述引入的編碼DHFR酶的多核苷酸包含在不同的表達(dá)盒中，且其中與用于驅(qū)動(dòng)編碼DHFR酶的多核苷酸表達(dá)的表達(dá)盒相比，用于驅(qū)動(dòng)編碼目的產(chǎn)物的多核苷酸表達(dá)的表達(dá)盒包含更強(qiáng)的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子。
11.用于產(chǎn)生目的產(chǎn)物的方法，其至少包括以下步驟(a)進(jìn)行權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的選擇方法來(lái)選擇至少一個(gè)表達(dá)所述目的產(chǎn)物的真核宿主細(xì)胞；和(b)在允許表達(dá)所述目的產(chǎn)物的條件下培養(yǎng)至少一個(gè)選擇的真核宿主細(xì)胞。
12.權(quán)利要求11的方法，其包括以下步驟中的至少一個(gè)(c)從所述細(xì)胞培養(yǎng)基和/或從所述真核宿主細(xì)胞分離所述目的產(chǎn)物；和/或(d)進(jìn)一步加工所述分離的目的產(chǎn)物。
13.權(quán)利要求11或12的方法，其中所述目的產(chǎn)物是免疫球蛋白分子或其功能性片段。
14.選擇性培養(yǎng)基，其包含濃度為500nM或更低的DHFR抑制劑和限制濃度為500nM或更低的葉酸鹽。
15.權(quán)利要求14的選擇性培養(yǎng)基，其包含限制濃度為2.5nM-100nM的葉酸鹽和/或濃度為200nM或更低的DHFR抑制劑。
16.權(quán)利要求14或15的選擇性培養(yǎng)基，其包含濃度為12.5nM-50nM的葉酸與濃度為 IOnM-IOOnM 的 MTX。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于選擇至少一個(gè)表達(dá)目的產(chǎn)物的真核宿主細(xì)胞的方法，其包括(a)提供多個(gè)真核宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞的細(xì)胞生存取決于葉酸鹽攝取，其中該真核宿主細(xì)胞至少包含(i)編碼目的產(chǎn)物的外源多核苷酸；和(ii)編碼DHFR酶的外源多核苷酸；(b)在至少包含DHFR的抑制劑和限制濃度的葉酸鹽的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)該多個(gè)真核宿主細(xì)胞；和(c)選擇至少一個(gè)表達(dá)該目的產(chǎn)物的真核宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供用于表達(dá)目的產(chǎn)物的方法，其基于通過(guò)該方法選擇的宿主細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102333875SQ201080009517
公開(kāi)日2012年1月25日 申請(qǐng)日期2010年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月27日
發(fā)明者H-P·科諾普夫, T·約斯多克 申請(qǐng)人:諾瓦提斯公司