專利名稱：生物催化菌株在把右旋磷霉素轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮酌顾刂械膽?yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及 生物醫(yī)藥和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種生物催化菌株在把右旋磷霉素轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮酌顾刂械膽?yīng)用。
背景技術(shù)：
左旋磷霉素[(-)-順-(1R，2S)_1，2-環(huán)氧丙基磷酸，F(xiàn)0M]是一種廣譜抗生素。與其它抗生素不同，磷霉素具有獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗菌機制。磷霉素與其它抗生素之間沒有交叉耐藥性，目可呈現(xiàn)協(xié)同作用。同時，因為磷霉素還具有理化特性穩(wěn)定、安全低毒、無抗原性等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛用于臨床治療，被稱為二十一世紀的新抗生素。目前，磷霉素生產(chǎn)工藝采用的是化學(xué)合成技術(shù)，該技術(shù)收率低，主要原因是工藝中的環(huán)氧化步驟是對稱性的化學(xué)催化過程，所獲得的產(chǎn)物為磷霉素消旋體，即左旋和右旋磷霉素各占一半。其中，左旋磷霉素有療效，從消旋體中被拆分出來后，進一步精制成為產(chǎn)品； 而右旋磷霉素[(+)_順_(1S，2R)-1，2-環(huán)氧丙基磷酸]無療效，被作為廢棄物排放掉，這導(dǎo)致了嚴重的資源浪費和環(huán)境污染等問題。國內(nèi)外現(xiàn)有研究結(jié)果顯示，左旋磷霉素的不對稱合成是可以通過生物催化/轉(zhuǎn)化來實現(xiàn)的。一些細菌、放線菌和真菌可以完成由順丙烯磷酸到左旋磷霉素的不對稱環(huán)氧化過程，且只合成左旋磷霉素，而不生成右旋磷霉素。這方面的報道見文獻1 (ItOh N. , M. Kusaka, T. Hirota et al, .Microbial production of antibioticfosfomycin by a stereoselective epoxidation and its formation mechanism. ApplMicrobiol Biotechnol. 1995,43 394-401.) 2 (ffatanabe M. ， Sumida N. ， Murakami S. et al. A phosphonate-induced gene which promotes Penicillium-mediatedbioconversion of cis-propenylphosphonic acid to fosfomycin. Appl Environ Microbiol. 1999.65 1036-1044.)和文獻3(石家驥，崔福綿，葛猛.青霉菌立體選擇性環(huán)氧化順丙烯磷酸產(chǎn)生磷霉素·微生物學(xué)報· 2001. 41 353-356.)。通過生物催化菌株將右旋磷霉素轉(zhuǎn)化為左旋磷霉素則是一個新近發(fā)現(xiàn)的生物催化現(xiàn)象(中國發(fā)明專利一種把右旋磷霉素轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮酌顾氐姆椒ǎ瑢＠?ZL200710012579. 3)。該現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為實現(xiàn)右旋磷霉素的再利用提供了一條可能的新途徑，但目前對具此催化能力的微生物菌株所知甚少。此前，三種細菌弗氏檸檬酸桿菌 (Citrobacter freundii, ATCC 8090)、假單胞菌(Pseudomonas sp. ATCC 11922)以及梭狀芽孢桿菌(Clostridium sporogenes,ATCC 3584)的功能報道如下表，尚未見它們具有催化右旋磷霉素轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮酌顾啬芰Φ膱蟮?。? 三種細菌的已報道功能Daniel AS, et al. Distribution and diversity ofhsd
弗氏朽 酸桿菌ATCC 產(chǎn)生限制性內(nèi)切酶
genes in Escherichia coli and olher enteric bacteria
Citrobacterfieundii8090CfrAI
J.Bactenol. 170:1775-1782,1988 Control of sterilization by liquid chemical sterilants, it^fMM Clostridium ATCC 用于殺菌劑的 Annex A. London, UK: British Standards sporogenes3584殺菌SfcH Institution; British Standard BS EN ISO
14160:1998.
ATCC 利用尼古丁作為碳 fl^JJfi^Pseiidomonas sp.J. Am. Chem. Soc. 76:155,1954
11922和氮源

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種生物催化菌株在把右旋磷霉素轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮酌顾刂械膽?yīng)用，為解決現(xiàn)有技術(shù)中右旋磷霉素嚴重的資源浪費和環(huán)境污染等問題提供技術(shù)基礎(chǔ)。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種生物催化菌株在把右旋磷霉素轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮酌顾刂械膽?yīng)用，利用弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii, ATCC 8090)、假單胞菌(Pseudomonas sp. ATCCl 1922)和梭狀芽孢桿菌(Clostridium sporogenes,ATCC 3584)三種細菌菌株，通過生物催化過程把右旋磷霉素轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮酌顾?，具體步驟如下(1)把三種細菌菌株，即弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii, ATCC 8090)、 假單胞菌(Pseudomonas sp. ATCC 11922)以及梭狀芽孢桿菌(Clostridiumsporogenes， ATCC 3584)，分別以完全培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，然后離心、收集菌體。完全培養(yǎng)基組分為按重量百分數(shù)計，牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.2%，瓊脂2%，余量為水；PH 了^，口丨！濕熱滅菌〗。!^!!。富集培養(yǎng)條件為恒溫震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 28-37"C、搖床轉(zhuǎn)速 150-250rpm，培養(yǎng) 12-72 小時。(2)將所收集菌體接種于催化培養(yǎng)基，每種菌體的接種量各占催化培養(yǎng)基重量的 2% -15% ；恒溫28-37°C震蕩培養(yǎng)48-120小時獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液進一步檢測其中是否含
有左旋磷霉素。催化培養(yǎng)基組分為按重量百分數(shù)計，右旋磷霉素0. 5-3. 0 %, (NH4)2SO4O. 5-1. 0 %, NaCl 0. 2 %, KCl 0. 1 %, MgSO4 · 7H20 0. 01-0. 02 %, FeSO4 · 7H20 0.01-0. 03%, KH2PO4O. 05-0. 15%，余量為水；pH 7. 5，121 °C濕熱滅菌 20min，恒溫震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28-37°C、搖床轉(zhuǎn)速150-250rpm，培養(yǎng)時間3-7天。(3)分別以薄層層析和生物鑒定盤方法定性及定量檢測發(fā)酵液中是否含有左旋磷霉素(中國發(fā)明專利一種把右旋磷霉素轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮酌顾氐姆椒?，專利號ZL200710012579. 3)。ATCC系美國典型物保藏中心，又稱美國模式典型物收集中心的簡稱。本發(fā)明的有益效果1.通過生物催化菌株將右旋磷霉素轉(zhuǎn)化為左旋磷霉素是一個新近發(fā)現(xiàn)的生物催化現(xiàn)象，為實現(xiàn)右旋磷霉素的再利用提供了一條可能的新途徑。但目前對具此催化能力的微生物菌株所知甚少。本發(fā)明驗證了三種細菌菌株的混合培養(yǎng)物具有通過生物催化過程把右旋磷霉素轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮酌顾氐哪芰?。這三種細菌菌株分別是弗氏檸檬酸桿菌 (Citrobacter freundii,ATCC 8O9O)、假單胞菌(Pseudomonassp. ATCC 11922)以及梭狀芽孢桿菌(Clostridium sporogenes，ATCC 3584)。利用這三種細菌菌株的混合培養(yǎng)物在催化培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)48-120小時實現(xiàn)該轉(zhuǎn)變過程。2.本發(fā)明提出的三種細菌菌株所具有的催化能力，具有使現(xiàn)在被廢棄的右旋磷霉素通過生物催化技術(shù)變廢為寶、獲得再利用的可能性。
具體實施例方式三種細菌菌株，即弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii,ATCC 8090)、假單胞菌(Pseudomonas sp. ATCCl 1922)和梭狀芽孢桿菌(Clostridium sporogenes, ATCC 3584)， 可以通過生物催化把右旋磷霉素轉(zhuǎn)化為左旋磷霉素，利用這三種細菌菌株的混合培養(yǎng)物， 在催化培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)48-120小時，可以實現(xiàn)該轉(zhuǎn)變過程。先把三種細菌菌株分別以完全培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，然后離心、收集菌體。完全培養(yǎng)基組分為按重量百分數(shù)計，牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.2%，瓊脂2%，余量為水；pH 7. 5，121°C濕熱滅菌20min。富集培養(yǎng)條件為恒溫震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28_37°C、搖床轉(zhuǎn)速 150-250rpm，培養(yǎng) 12-72 小時。再將所收集菌體分別接種于催化培養(yǎng)基，28-37°C恒溫震蕩培養(yǎng)48-120小時，發(fā)酵液進一步檢測其中是否含有左旋磷霉素。催化培養(yǎng)基組分為按重量百分數(shù)計，右旋磷霉素 0. 5-3. 0%, (NH4)2SO4O. 5-1. 0%, NaCl 0. 2%, KCl 0. 1 %, MgSO4 · 7H20 0. 01-0. 02%, FeSO4 ·7Η20 0. 01-0. 03%,KH2PO4O. 05-0. 15%，余量為水；ρΗ 7. 5，121°C濕熱滅菌 20min，恒溫震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28-37°C、搖床轉(zhuǎn)速150-250rpm，培養(yǎng)時間3-7天。最后分別以薄層層析和生物鑒定盤方法定性和定量檢測發(fā)酵液中是否含有左旋磷霉素。實施例先把三種細菌菌株，即弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii,ATCC 8090)、假單胞菌(Pseudomonas sp. ATCC 11922)和梭狀芽孢桿菌(Clostridium sporogenes, ATCC 3584)，分別以完全培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，離心、收集菌體。完全培養(yǎng)基組分為按重量百分數(shù)計， 牛肉膏0. 5%，蛋白胨l%，NaCl 0. 2%，瓊脂2%，余量為水；pH 7. 5，121°C濕熱滅菌20min。 富集培養(yǎng)條件為恒溫震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30°C、搖床轉(zhuǎn)速150rpm，培養(yǎng)24小時。再將所收集菌體接種于催化培養(yǎng)基中，弗氏檸檬酸桿菌、假單胞菌和梭狀芽孢桿菌的接種量分別占催化培養(yǎng)基重量的6%、2%、4%，37°C恒溫震蕩培養(yǎng)96小時，發(fā)酵液進一步檢測其中是否含有左旋磷霉素。催化培養(yǎng)基組分為按重量百分數(shù)計，右旋磷霉素 3. 0%, (NH4)2SO4L 0%,NaCl 0. 2%, KCl 0.1%, MgSO4 ‘ 7H20 0. 01%, FeSO4 ‘ 7H20 0. 02%,KH2PO4O. 10%，余量為水，pH 7. 5，121 °C濕熱滅菌20min。恒溫震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30°C、搖床轉(zhuǎn)速150rpm，培養(yǎng)時間5天。 最后，以薄層層析定性鑒定發(fā)酵液中含有左旋磷霉素，以生物鑒定盤方法定量檢測發(fā)酵液中左旋磷霉素濃度為67. 3 μ g/ml。結(jié)果表明，通過本發(fā)明可以驗證三種細菌菌株的混合培養(yǎng)物具有通過生物催化把右旋磷霉素轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮酌顾氐哪芰Γ宫F(xiàn)在被廢棄的右旋磷霉素通過生物催化技術(shù)變廢為寶、獲得再利用成為可能。
權(quán)利要求
1.一種生物催化菌株在把右旋磷霉素轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮酌顾刂械膽?yīng)用，其特征在于利用弗氏檸檬酸桿菌、假單胞菌和梭狀芽孢桿菌三種細菌菌株，通過生物催化過程把右旋磷霉素轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮酌顾亍?br> 2.按照權(quán)利要求1所述的生物催化菌株在把右旋磷霉素轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮酌顾刂械膽?yīng)用， 其特征在于，利用這三種細菌菌株的混合培養(yǎng)物在催化培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)48-120小時實現(xiàn)該轉(zhuǎn)變過程。
3.按照權(quán)利要求1所述的生物催化菌株在把右旋磷霉素轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮酌顾刂械膽?yīng)用， 其特征在于，具體步驟如下(1)把三種細菌菌株，即弗氏檸檬酸桿菌、假單胞菌和梭狀芽孢桿菌，分別以完全培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，然后離心、收集菌體；(2)將所收集菌體接種于催化培養(yǎng)基，每種菌體的接種量各占催化培養(yǎng)基重量的 2% -15% ；恒溫震蕩培養(yǎng)48-120小時獲得發(fā)酵液，發(fā)酵液進一步檢測其中是否含有左旋磷霉素；(3)分別以薄層層析和生物鑒定盤方法定性及定量檢測發(fā)酵液中是否含有左旋磷霉ο
4.按照權(quán)利要求3所述的生物催化菌株在把右旋磷霉素轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮酌顾刂械膽?yīng)用， 其特征在于，完全培養(yǎng)基組分為按重量百分數(shù)計，牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.2%, 瓊脂2%，余量為水；pH 7. 5，121°C濕熱滅菌20min ；富集培養(yǎng)條件為恒溫震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度^_37°C、搖床轉(zhuǎn)速150-250rpm，培養(yǎng)12-72小時。
5.按照權(quán)利要求3所述的生物催化菌株在把右旋磷霉素轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮酌顾刂械膽?yīng)用，其特征在于，催化培養(yǎng)基組分為按重量百分數(shù)計，右旋磷霉素0. 5-3. 0%, (NH4)2SO4O. 5-1. 0 %, NaCl 0. 2 %, KCl 0. 1 %, MgSO4 · 7H20 0. 01-0. 02 %, FeSO4 · 7H20 0.01-0. 03%, KH2PO4O. 05-0. 15%，余量為水；pH 7. 5，121 °C濕熱滅菌 20min，恒溫震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度^_37°C、搖床轉(zhuǎn)速150-250rpm，培養(yǎng)時間3_7天。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種生物催化菌株在把右旋磷霉素轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮酌顾刂械膽?yīng)用，三種細菌菌株可以通過生物催化把右旋磷霉素轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮酌顾?，為解決現(xiàn)有右旋磷霉素嚴重的資源浪費和環(huán)境污染等問題提供了技術(shù)基礎(chǔ)。右旋磷霉素是左旋磷霉素化學(xué)合成工藝中形成的副產(chǎn)物，無藥效，被作為廢物棄掉，污染環(huán)境、浪費資源。本發(fā)明驗證了三種細菌菌株的混合培養(yǎng)物具有通過生物催化把右旋磷霉素轉(zhuǎn)變?yōu)樽笮酌顾氐哪芰?。這三種細菌菌株分別是弗氏檸檬酸桿菌、假單胞菌以及梭狀芽孢桿菌。本發(fā)明提出的三種細菌菌株所具有的催化能力，具有使現(xiàn)在被廢棄的右旋磷霉素通過生物催化技術(shù)變廢為寶、獲得再利用的可能性。
文檔編號C12P17/02GK102154430SQ20101061604
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者周麗沙, 周凱, 孔雙, 季光輝, 徐慧, 楊偉超, 王若超, 紀悅, 趙華, 金玉坤, 韓斯琴 申請人:東北制藥集團股份有限公司, 中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所