專利名稱：結(jié)核分枝桿菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的構(gòu)建、表達和純化方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種融合蛋白，具體地說是一種結(jié)核分枝桿菌融合蛋白 MtblO. 4-Hspl6. 3的構(gòu)建、表達和純化方法，以及該融合蛋白在結(jié)核亞單位疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是全球傳播范圍最廣、持續(xù)時間最久、危害最為嚴重的傳染病。自上世紀80 年代以來結(jié)核病死灰復(fù)燃，發(fā)病率和死亡率據(jù)各類傳染病首位和第二位。據(jù)估計，每年有2 百萬人死于結(jié)核病感染；更為嚴重的是每年有大約20億人處于結(jié)核分支桿菌感染的潛伏期，其中有5-10%潛伏期結(jié)轉(zhuǎn)變成活動期結(jié)核。我國是結(jié)核病高負擔(dān)的國家之一，發(fā)病率約達到全國總?cè)丝诘?%。。由于細菌變異，部分結(jié)核病患者使用常規(guī)化學(xué)藥物治療不能治愈， 持續(xù)排菌，對個人健康和公共衛(wèi)生造成了極大的威脅。因此，研制和開發(fā)抗結(jié)核疫苗尤其是針對休眠期結(jié)核的疫苗是控制結(jié)核病的重要途徑。目前研制成功的唯一的結(jié)核病疫苗——卡介苗(BCG)，雖然已在全球范圍內(nèi)廣泛使用，然而不同研究顯示，BCG在不同人群中的保護性不穩(wěn)定，尤其是對成人肺結(jié)核的保護效率介于0-80%不等?，F(xiàn)階段進行研究的結(jié)核病疫苗主要有以下幾種(1)重組BCG;(2) 結(jié)核桿菌減毒活疫苗；C3)結(jié)核亞單位疫苗。其中結(jié)核亞單位疫苗包括蛋白疫苗、DNA疫苗和以病毒為載體的疫苗三種形式，其中蛋白疫苗因成份明確、相對安全，更易于被人們接受。大量研究表明，利用基因工程技術(shù)將具有不同優(yōu)勢的單個結(jié)核菌保護性抗原進行重組，可構(gòu)建成具有較強免疫原性和更好保護效應(yīng)的融合蛋白。因此，抗原選擇是構(gòu)建結(jié)核亞單位疫苗的首要步驟之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于構(gòu)建并表達純化融合蛋白MtblO. 4-Hspl6. 3，針對結(jié)核分枝桿菌各生長期的免疫應(yīng)答，尤其是對休眠狀態(tài)細菌建立有效的免疫應(yīng)答，并且提高單個抗原的保護效果；融合蛋白MtblO. 4-Hspl6. 3(MH)和佐劑(DDA+TDM)混合作為結(jié)核亞單位疫苗， 能誘導(dǎo)較強的Thl型細胞免疫為主的細胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)，具有較好的動物保護效果，作為后期臨床研究尤其是針對休眠期結(jié)核的候選亞單位疫苗。本發(fā)明所選用的結(jié)核桿菌抗原MtblO. 4、Hspl6. 3均有較強的免疫保護性，分別主要表達于生長期和休眠期且具有不同的免疫優(yōu)勢。兩抗原主要特性如下(I)MtblO. 4 MtblO. 4抗原是結(jié)核分支桿菌早期分泌性蛋白，屬于ESA T-6蛋白家族，該家族包括 ESAT-6，CFP-10，TB10. 4，TB10. 3等蛋白。相關(guān)研究證明MtblO. 4抗原是重要的結(jié)核分枝桿菌免疫保護性抗原，是理想的構(gòu)件結(jié)核疫苗的候選抗原。MtblO. 4抗原對BCG接種的健康者和結(jié)核分枝桿菌感染的患者均可誘導(dǎo)強烈的細胞及體液免疫反應(yīng)，與ESAT-6抗原相比是更好的結(jié)核疫苗候選抗原。將其免疫小鼠，可獲得明顯的特異性體液和細胞免疫反應(yīng)，此外小鼠在用氣霧攻擊結(jié)核桿菌H37Rv毒株后，可獲得接近BCG的免疫保護效果。(》Hspl6. 3 是熱休克蛋白(Hsp)的一種，在細菌休眠期和缺氧環(huán)境下高表達，對于結(jié)核菌在巨噬細胞內(nèi)的持續(xù)存在起重要作用。Hspl6. 3能夠激起Thl型細胞反應(yīng)，刺激高水平的IFN-Y的分泌。在健康的與肺結(jié)核密切接觸的家人(80% )和醫(yī)務(wù)工作者(90% )中，具有較高比例的 HspX T細胞刺激活性，比例明顯高于普通人群(50% )，提示Hspl6. 3抗原具有免疫保護作用。本發(fā)明的技術(shù)方案為結(jié)核分枝桿菌融合蛋白MtblO. 4-Hspl6. 3的構(gòu)建、表達和純化方法為首先，將MtblO. 4和Hspl6. 3基因進行PCR擴增并依次插入到克隆載體的多克隆位點中，構(gòu)建重組載體；然后將上述重組載體在大腸桿菌中表達融合蛋白MtblO. 4-HSP16. 3 ；最后根據(jù)融合蛋白MtblO. 4-Hspl6. 3的分子量、電荷和親和力進行純化，通過純化得到融合蛋白MtblO. 4-Hspl6. 3。所述的融合蛋白MtblO. 4-Hspl6. 3的構(gòu)建方法包括以下步驟(1)根據(jù)GenBank中H37Rv中的MtblO. 4和Hspl6. 3的基因序列，設(shè)計引物；(2)PCR擴增MtblO. 4基因由于MtblO. 4基因后面要融合Hspl6. 3，所以設(shè)計引物時把MtblO. 4終止信號去掉；以結(jié)核桿菌標(biāo)準毒株DNA為模板，用5、端特異性引物 MtblO. 4F和端引物MtblO. 4R擴增MtblO. 4全基因序列；PCR 反應(yīng)條件96°C預(yù)變性 lmin, 98°C變性 10s, 54°C復(fù)性 15s, 72°C延伸 30s, 30 個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化進行純化。(3)構(gòu)建重組質(zhì)粒MtblO. 4-pET-30a(+)用 Nde I 和 Sac I 雙酶切純化后 MtblO. 4 基因和質(zhì)粒pET30a，在T4連接酶的作用下將兩者進行連接，轉(zhuǎn)化入E. Coli DH5 α中，構(gòu)建重組質(zhì)粒MtblO. 4-pET-30a(+)，PCR驗證篩選陽性克隆進行測序鑒定。(4)PCR擴增Hsp 16. 3基因以結(jié)核桿菌標(biāo)準毒株DNA為模板，用Hsp 16. 3F和 Hspl6. 3R擴增Hspl6. 3基因片段；PCR 反應(yīng)條件96°C 預(yù)變性 lmin，98°C變性 10s，55°C 復(fù)性 20s，72°C 延伸 30s，30 個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化；(5)構(gòu)建重組質(zhì)粒 MtblO. 4-Hspx-pET-30a(+)用 Sac I 和 HindIII 雙酶切純化后Hspx基因和重組質(zhì)粒MtblO. 4-pET-30a (+)，分別純化后用T4連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化入 E. ColiDH5 α，克隆構(gòu)建重組質(zhì)粒MtblO. 4-Hspx-pET_30a(+) ；PCR驗證篩選陽性克隆進行
測序鑒定。所述的融合蛋白MtblO. 4-Hspl6. 3的表達方法包括以下步驟(1)從以上 EColi 的 pET30a_Mtbl0. 4_Hspl6. 3(DH5a )提取重組質(zhì)粒 pET30a-Mtbl0. 4_Hspl6. 3，轉(zhuǎn)化入Ε. Coli BL21 (DE3)中，PCR驗證篩選陽性克隆進行測序鑒定(北京華大基因科技完成測序)，即為保存菌種pET30a-Mtbl0. 4_Hspl6. 3 (BL21)；(2)活化表達MH蛋白的E. coli BL-21菌體，取Iml活化后菌體加入200mlLB 培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)3h IOmim至OD 600nm達到 0. 6 ；加入IPTG (1. Ommo 1/L) IOOul ； 25°C誘導(dǎo)振蕩培養(yǎng)12h ；4°C 10000rpm/min離心IOmin收集菌體；菌體重懸于PB緩沖液(Na2HPO4 · 12H2020mMol/L, Na2HPO4 · 12H20 20mMol/L, ρΗ7· 4) 10ml/g 濕菌，冰浴下超聲破碎細菌Ih (180 200W，超聲如停k) ； 10000rpm/min離心20min后分別收集上清和沉淀，將上清和沉淀分別進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，與BL21空菌相比，分子量在26. 7KD左右有明顯的特異蛋白表達條帶，以上清形式表達為主，沉淀中蛋白很少。所述的融合蛋白MtblO. 4-Hspl6. 3的純化方法包括以下步驟(1)配制以下緩沖液1 液 20mM PB (pH7. 4) ；II 液 20mM PB+1M NaCl (ρΗ7· 4) ；III 液20mM PB+2M NaCl (pH7. 4)；緩沖液均用0. 45um濾器過濾除菌；(2)大量表達融合蛋白MH，收集的菌體重懸于20mM PB緩沖液中，冰浴下超聲破碎 Ih左右，4°C /10，OOOrpm離心lOmin，離心后收集含MH蛋白的上清；上清用0. 45um濾器過濾除菌；(3)第一步純化離子交換層析。選用強陰離子交換柱Q介質(zhì)進行純化，收集不同梯度洗脫液進行SDS-PAGE分析得初步純化物；(4)第二步純化疏水層析。經(jīng)過離子交換層析初步純化后的蛋白，加入等體積的 III液，使蛋白含高鹽上柱。選用Butyl HP柱進行純化，收集不同梯度洗脫液進行SDS-PAGE 分析得二步純化物；(5)第三步純化凝膠過濾層析。將經(jīng)過離子交換層析和疏水層析兩步純化后的蛋白，選用superdex prep grade柱進行純化，收集不同梯度洗脫液進行SDS-PAGE分析得最終純化物；(6)將最終得到的蛋白純化物測定濃度之后即可使用。上述結(jié)核分枝桿菌融合蛋白MtblO. 4-Hspl6. 3應(yīng)用在結(jié)核亞單位疫苗中。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，成功構(gòu)建、表達和純化了不帶有任何標(biāo)簽的結(jié)核分枝桿菌融合蛋白TB10. 4-Ag85B，解決了融合蛋白所帶有的標(biāo)簽會影響到動物實驗以及更進一步的臨床學(xué)試驗的后續(xù)問題，并且通過利用不同的色譜分析方法使融合蛋白得到了有效的純化，此蛋白可誘導(dǎo)較強的細胞和體液免疫應(yīng)答并具有一定的動物保護效應(yīng)，有望成為臨床結(jié)核病預(yù)防和治療的候選疫苗；該融合蛋白疫苗可誘導(dǎo)動物較強的細胞和體液免疫反應(yīng)；通過動物攻毒實驗表明，該疫苗在BCG免疫基礎(chǔ)上，具有加強免疫作用，可提高和延長BCG的保護效果；且該疫苗無明顯毒副作用。


圖1在大腸桿菌中表達純化蛋白MH (Mr為26. 7xl03) (1.蛋白Maker，2.純化前的 MH, 3.第一步純化后的蛋白MH，4.第二步純化后的蛋白MH，5.第三步步純化后的蛋白)；圖2脾細胞分泌IFN-r水平(A 抗原Hspl6. 3刺激脾細胞，B =PPD刺激脾細胞)；圖3結(jié)核抗原Hps6. 3特異性抗體水平(A 抗體IgGl，B 抗體IgG2b)；圖4分泌IFN-r因子的脾細胞數(shù)量(A 細胞用MtblO. 4抗原的⑶8T細胞表位刺激，B 細胞用Hxp6. 3蛋白進行刺激，C 細胞用PPD進行刺激，*表示實驗組與PBS、BCG組進行統(tǒng)計學(xué)分析時P值小于0.05)；圖5分泌IL-17因子的脾細胞數(shù)量(A 細胞用MtblO. 4抗原的⑶8T細胞表位刺激，B 細胞用Hxp6. 3蛋白進行刺激，*表示實驗組與PBS、BCG組進行統(tǒng)計學(xué)分析時P值小于 0.05)；
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圖6結(jié)核抗原Hps6. 3特異性抗體水平(A 抗體IgGl，B 抗體IgG2b，C 抗體 IgG2c)；圖7融合蛋白MtblO. 4-Hspl6. 3對BCG初免動物的保護效果(結(jié)果用肺和脾的 CFU數(shù)的對數(shù)表示，每組小鼠數(shù)量大于等于6只，數(shù)據(jù)用方差分析方法和SPSS13. 0軟件進行統(tǒng)計)。
具體實施例方式以下對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。一、結(jié)核分枝桿菌融合蛋白MtblO. 4-Hspl6. 3的構(gòu)建、表達和純化首先，將MtblO. 4和Hspl6. 3基因進行PCR擴增并依次插入到克隆載體的多克隆位點中，構(gòu)建重組載體；然后將上述重組載體在大腸桿菌中表達融合蛋白 MtblO. 4-Hspl6. 3 ；最后根據(jù)融合蛋白MtblO. 4-Hspl6. 3的分子量、電荷和親和力進行純化，通過純化得到融合蛋白MtblO. 4-Hspl6. 3，具體步驟如下1、融合蛋白 MtblO. 4-Hspl6. 3(MH)的構(gòu)建(1)根據(jù) GenBank 中 H37Rv 中的 MtblO. 4(Rv(^88，相對分子量 Mr 為 10. 4X IO3 96AA)和Hspl6. 3(Rv2301，相對分子量Mr為16. 3X103，144AA)的基因序列，設(shè)計4對引物， 分別為Mtb 10. 4F GTGCATATGTCGCAAATCATGTACAACTA(Nde I)Mtb 10. 4R ATAGAGCTCGCCGCCCCATTT(Sac I)Hspx F ATAGAGCTCTTCGCAGTCACGAACGACGGGGTGATTATGGCCACCACCCTTC(Sac I)Hspx R ACAAAAGCTTTCAGTTGGTGGACCG(HindiII)O) PCR擴增MtblO. 4基因由于MtblO. 4基因后面要融合Hspl6. 3，所以設(shè)計引物時把MtblO. 4終止信號去掉，以結(jié)核桿菌標(biāo)準毒株(H37Rv)DNA為模板，用5、端特異性引物 MtblO. 4F和；T端引物MtblO. 4R擴增MtbO. 4全基因序列；PCR反應(yīng)條件96°C預(yù)變性Imin, 98°C變性10s，復(fù)性15s，72°C延伸30s，30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收
試劑盒純化進行純化。(3)構(gòu)建重組質(zhì)粒MtblO. 4-pET-30a (+)用 Nde I 和 &ic I 雙酶切純化后 MtblO. 4 基因和質(zhì)粒pET30a，在T4連接酶的作用下將兩者進行連接，轉(zhuǎn)化入E. Coli DH5 α中，構(gòu)建重組質(zhì)粒MtblO. 4-pET-30a(+)，PCR驗證篩選陽性克隆進行測序鑒定。(見鑒定結(jié)果序列表)G)PCR擴增Hspl6. 3基因以結(jié)核桿菌標(biāo)準毒株(H37Rv) DNA為模板，用Hspl6. 3F 和Hspl6. 3R擴增Hspl6. 3基因片段；PCR反應(yīng)條件96°C預(yù)變性lmin，98°C變性10s，55°C 復(fù)性20s，72°C延伸30s，30個循環(huán)；72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化。(5)構(gòu)建重組質(zhì)粒 MtblO. 4-Hspx-pET_30a(+)用 Sac I 和 HindIII 雙酶切純化后Hspx基因和重組質(zhì)粒MtblO. 4-pET-30a (+)，分別純化后用T4連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化入 E. ColiDH5 α，克隆構(gòu)建重組質(zhì)粒MtblO. 4-Hspx-pET_30a(+)。PCR驗證篩選陽性克隆進行測序鑒定。(見鑒定結(jié)果序列表)
2、MH蛋白(分子量為26. 7x 103)的表達(見氨基酸序列表)(1) UWiE. Coli 中的 pET30a-Mtbl0. 4_Hspl6. 3 (DH5 α )提取重組質(zhì)粒 pET30a-Mtbl0. 4-Hspl6. 3，轉(zhuǎn)化入Ε. Coli BL21(DE3)中，PCR驗證篩選陽性克隆進行測序鑒定(北京華大基因科技完成測序)，即為保存菌種pET30a-Mtbl0. 4_Hspl6. 3 (BL21)。(2)活化表達MH蛋白的E. coli BL-21菌體，取Iml活化后菌體加入200mlLB 培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng) 3hl0mim 至 0D600nm 達到約 0. 6 ；加入 IPTG(1. Ommo 1/L) IOOul ； 25 °C 誘導(dǎo)振蕩培養(yǎng)12h ；4 V 10000rpm/min離心IOmin收集菌體；菌體重懸于PB緩沖液 (Na2HPO4 · 12H2020mMol/L, Na2HPO4 · 12H20 20mMol/L, ρΗ7· 4) 10ml/g 濕菌，冰浴下超聲破碎細菌Ih (180 200W，超聲如停k) ； 10000rpm/min離心20min后分別收集上清和沉淀，將上清和沉淀分別進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，與BL21空菌相比，分子量在沈.7KD左右有明顯的特異蛋白表達條帶，以上清形式表達為主，沉淀中蛋白很少。(見蛋白表達結(jié)果序列表)。3. MH蛋白(分子量為26. 7 X IO3)的純化(1)配制以下緩沖液1 液 20mM PB (pH7. 4) ；II 液 20mM PB+1M NaCl (ρΗ7· 4) ；III 液20mM PB+2M NaCl (pH7. 4)；緩沖液均用0. 45um濾器過濾除菌；(2)大量表達融合蛋白MH，收集的菌體重懸于20mM PB緩沖液中，冰浴下超聲破碎 Ih左右，4°C /10，OOOrpm離心lOmin，離心后收集含MH蛋白的上清；上清用0. 45um濾器過濾除菌；(3)第一步純化離子交換層析；選用季銨基交聯(lián)瓊脂糖高柱效介質(zhì)⑴ SepheroseHigh Performance)(注強陰離子交換柱)進行純化，收集不同梯度洗脫液進行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分析得初步純化物；(4)第二步純化疏水層析；經(jīng)過離子交換層析初步純化后的蛋白，加入等體積的III液，使蛋白含高鹽上柱，選用丁基交聯(lián)瓊脂糖高柱效介質(zhì)(Butyl SepheroseHigh Performance)進行純化，收集不同梯度洗脫液進行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分析得二步純化物；(5)第三步純化凝膠過濾層析；將經(jīng)過離子交換層析和疏水層析兩步純化后的蛋白，選用凝膠過濾介質(zhì)Superdex 75pre grade (superdex為交聯(lián)瓊脂糖和葡萄糖的符合填料；分離范圍為3000 70000)進行純化，收集不同梯度洗脫液進行聚丙烯酰胺凝膠 (SDS-PAGE)電泳分析得最終純化物；(純化結(jié)果見附圖1)(6)將最終得到的蛋白純化物測定濃度之后即可使用。二、融合蛋白MH免疫活性檢測方法1實驗材料MH蛋白；Hspl6.4蛋白、己二酸二癸酯(DDA)、海藻糖二霉菌酸脂 (TDM)；卡介苗(BCG)、磷酸鹽緩沖液(PBS)；2實驗動物C57BL/6小鼠；3實驗動物分組(共四組)A =PBS ；B =BCG ；C:MH+DDA+TDM ；
D:Hspl6. 3+DDA+TDM ；4制備蛋白和佐劑混合疫苗將融合蛋白MtblO. 4-Hspx(MH)和Hspl6. 3蛋白分別用用PBS稀釋到0. 2mg/ml ； DDA和TDM用氯仿-甲醇溶液(氯仿甲醇=9 1)溶解，氮氣吹干(使氯仿-甲醇溶液揮發(fā)完全)、用低溫冷凍干燥儀將吹干后的薄膜過夜干燥成粉末狀，PBS重懸粉末(DDA終濃度為5mg/ml，TDM終濃度為lmg/ml)，60°C水浴20分鐘溶解粉末，冷卻到室溫待用。將溶解好的蛋白、DDA、TDM按2 1 1比例混合均勻即可使用。5免疫動物第1周用制備好的混合疫苗(MH+DDA+TDM和Hspl6. 3+DDA+TDM)腹股溝皮下免疫實驗組動物一次O00 μ 1/只)，同時免疫對照組PBS和BCG組(5 X IO6CFU/只)；實驗組動物初次免疫后分別在第3、6周用制備好的混合疫苗腹股溝皮下相同劑量加強免疫動物 (200 μ 1/ 只)。6免疫指標(biāo)測定方法(1)細胞免疫檢測應(yīng)用ELISA方法檢測了免疫小鼠脾臟淋巴細胞分別針對特異性抗原分泌IFN-γ 和IL-17的水平。小鼠末次免疫6W后無菌分離脾臟淋巴細胞，特異性抗原和脾細胞在M 板中共同孵育68小時后，收集細胞培養(yǎng)上清，用ELISA計數(shù)檢測脾臟淋巴細胞在Hspl6. 3 蛋白，PPD蛋白刺激后IFN-Y的表達。具體步驟無菌摘除脾臟，研磨后經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾，用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞。將分離出的淋巴細胞加入到M孔細胞培養(yǎng)板中，終濃度為 5X106，分別給予 Hspl6.3 蛋白(10ug/ml)，PPD 蛋白(10ug/ml)刺激。在 37°C、5% CO2條件下共同孵育68時后，收集細胞培養(yǎng)上清。將細胞培養(yǎng)上清加入到96孔ELISA板中，IOOul/孔，按ELISA說明依次加入檢測抗體等試劑，洗板、顯色、終止反應(yīng)、酶標(biāo)儀讀板、 根據(jù)標(biāo)準曲線求的IFN-r的數(shù)值(pg/ml)。結(jié)果顯示PBS、BCG、MH+DDA+TDM、H+DDA+TDM四組結(jié)果進行比較，重組MH蛋白與 DDA和TDM佐劑結(jié)合組，在Hsp 16. 3蛋白，PPD蛋白刺激后，脾細胞分泌IFN-γ的水平明顯高于PBS組和BCG組，具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P < 0. 05)；與單個抗原H+DDA+TDM組相比無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P >0.05)，表明可產(chǎn)生相同水平的IFN-r。結(jié)果證明本發(fā)明的融合蛋白與佐劑DDA和TDM混合后可引起較強的細胞免疫反應(yīng)，保留了單個抗原Hspl6. 3的免疫原性。(結(jié)果見附圖2-A、2-B)(2)體液免疫反應(yīng)用ELISA法檢測小鼠血清抗體表達水平。用Hspl6. 3 (5ug/ml)包被96孔板 (10(^1/恥11)41過夜；用？8511溶液30(^1/^11洗板5次\11^11/次；從1 100 開始至 1 25600(IgG2b 和 IgG2c)或從 1 1600 開始到 1 509600 (IgGl)，加入對倍稀釋的血清樣品，37°C放置lh。洗板后，加入200μ 1/well的1 15000稀釋的兔抗鼠IgGl、 1 10000稀釋的兔抗鼠IgG^、l 5000稀釋的兔抗鼠IgG2c，37°C放置lh。洗板后，加入ΙΟΟμ 1/well TMB顯色液，室溫避光反應(yīng)15分鐘顯色后，加入50 μ I/well終止液QN的 H2SO4)終止反應(yīng)；在450nm檢測OD值。結(jié)果顯示PBS、BCG、MH+DDA+TDM、H+DDA+TDM四組結(jié)果進行比較，重組MH蛋白與 DDA和TDM佐劑結(jié)合組，針對抗原Hpsl6. 3所產(chǎn)生的特異性抗體IgGl、IgGb和IgGc的水平明顯高于PBS、BCG和單個抗原H+DDA+TDM組。此結(jié)果顯示本發(fā)明的融合蛋白可刺激機體產(chǎn)生抗原Hspl6. 3特異性抗體，具有較強的體液免疫反應(yīng)，說明抗原融合后保留了原單個抗原Hspl6. 3的免疫原性。(結(jié)果見附圖 3-A、3-B、3-C)三、加強BCG效應(yīng)及保護力評價1實驗材料MH蛋白；己二酸二癸酯(DDA)、海藻糖二霉菌酸脂(TDM)；卡介苗 (BCG)、磷酸鹽緩沖液(PBS)；2實驗動物C57BL/6小鼠；3實驗動物分組(共三組)A =PBSB =BCGCBCG/MH+DDA+TDM4制備疫苗將融合蛋白MtbO. 4-Hspx (MH)用PBS稀釋到0. 2mg/ml ；DDA和TDM用氯仿-甲醇溶液(氯仿甲醇=9 1)溶解，氮氣吹干(使氯仿-甲醇溶液揮發(fā)完全)、用低溫冷凍干燥儀將吹干后的薄膜過夜干燥成粉末狀，PBS重懸粉末(DDA終濃度為5mg/ml，TDM終濃度為lmg/ml)，60°C水浴20分鐘溶解粉末，冷卻到室溫待用。將溶解好的蛋白、DDA、TDM按 2:1:1比例混合均勻即可使用。5免疫動物第1周卡介苗(BCG) 5 X IO6CFU腹股溝皮下免疫動物一次；卡介苗(BCG)初次免疫后分別在第12、14周用制備好的蛋白疫苗腹股溝皮下免疫動物QOO μ 1/只)。6、免疫指標(biāo)測定方法小鼠最后一次蛋白、苗免疫6周后分別進行細胞免疫和體液免疫檢測。(1)細胞免疫檢測應(yīng)用ELISP0T方法檢測了免疫小鼠脾臟淋巴細胞分別針對特異性抗原分泌 IFN-Y和IL-17的水平。IFN-Y和IL-17的分泌水平與結(jié)核病的保護性免疫反應(yīng)成正相。 最后一次免疫小鼠6周后無菌分離脾臟淋巴細胞，應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點實驗(ELISP0T)技術(shù)檢測脾臟淋巴細胞在MtblO. 4⑶8+T cell抗原表位，Hspl6. 3蛋白，PPD蛋白刺激后IFN-γ 和IL-17的表達。具體步驟96孔板預(yù)先用IFN-Y抗體和IL-17抗體包被過夜，無菌摘除脾臟，研磨后經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾，用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞。將分離出的淋巴細胞加入96 孔ELISP0T板中，終濃度為5X106/空，分別給予MtblO. 4CD8+T cell抗原表位(5ug/ml)， HSP16.3蛋白(10ug/ml)，PPD蛋白(10ug/ml)刺激。在37°C、5% CO2條件下共同孵育48小時后，按ELISP0T操作說明依次加入檢測抗體等試劑，洗板、顯色，計數(shù)斑點數(shù)。結(jié)果顯示PBS、BCG、BCG/MH+DDA+TDM三組結(jié)果進行比較重組MH蛋白與DDA和TDM 佐劑結(jié)合組，在MtblO. 4⑶8+T cell抗原表位，HSP16. 3蛋白，PPD蛋白刺激后，脾細胞分泌 IFN- γ和IL-17的水平明顯高于PBS組和BCG組。結(jié)果證明本發(fā)明的融合蛋白與佐劑DDA 和TDM混合后可引起較強的細胞免疫反應(yīng)。(見附圖4-A、4-B、4-C、附圖5_A、5_B)(2)體液免疫反應(yīng)
用ELISA法檢測小鼠血清抗體表達水平。用Hspl6. 3(5ug/ml)包被96孔板 (100μ l/well)4°C過夜，用PBST溶液300μ l/well洗板5次x1min/次，從1100開始至 1 25600(IgG2b和IgG2c)或從1 1600開始到1 509600 (IgGl)，加入對倍稀釋的血清樣品，37°C放置lh。洗板后，加入200μ1/νθ11的1 15000稀釋的兔抗鼠IgGl、1 10000 稀釋的兔抗鼠IgG2c、l 5000稀釋的兔抗鼠IgG2c，37°C放置lh。洗板后，加入ΙΟΟμΙ/ well TMB顯色液，室溫避光反應(yīng)15分鐘顯色后，加入50μ I/well終止液QN的H2S04)終止反應(yīng)；在450nm檢測OD值。結(jié)果顯示PBS、BCG、BCG/MH+DDA+TDM三組結(jié)果進行比較，重組MH蛋白與DDA和 TDM佐劑結(jié)合組，Hpsl6. 3所產(chǎn)生的特異性抗體IgGl、IgGb和IgGc的水平明顯高于PBS和 BCG組。此結(jié)果表明本發(fā)明的融合蛋白可刺激機體產(chǎn)生較強的體液免疫反應(yīng)。(見附圖6-A、 6-B、6-C)7、攻毒后免疫小鼠組織的結(jié)核菌載量具體步驟給每組小鼠攻擊等量的結(jié)核菌毒株H37Rv后6周，解剖所有的小鼠，計算肺臟中結(jié)核菌的數(shù)量，用來評價本專利的融合蛋白MH的動物保護效果。結(jié)果顯示，在小鼠肺臟中，BCG/MH+DDA+TDM組的結(jié)核菌量明顯少于PBS組(P = 0. 00)和BCG組(P = 0. 069)。(細菌載量結(jié)果見附圖7)最后應(yīng)說明的是以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.結(jié)核分枝桿菌融合蛋白MtblO.4-Hspl6. 3的構(gòu)建、表達和純化方法，其特征在于 首先，將MtblO. 4和Hspl6. 3基因進行PCR擴增并依次插入到克隆載體的多克隆位點中，構(gòu)建重組載體；然后將上述重組載體在大腸桿菌中表達融合蛋白MtblO. 4-Hspl6. 3 ； 最后根據(jù)融合蛋白MtblO. 4-Hspl6. 3的分子量、電荷和親和力進行純化，通過純化得到融合蛋白 MtblO. 4-Hspl6. 3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌融合蛋白MtblO.4-Hspl6. 3的構(gòu)建、表達和純化方法，其特征在于所述的融合蛋白MtblO. 4-Hspl6. 3的構(gòu)建方法包括以下步驟(1)根據(jù)GenBank中結(jié)核桿菌標(biāo)準毒株H37Rv的MtblO. 4和Hspl6. 3的基因序列，設(shè)計引物；O)PCR擴增MtblO. 4基因以結(jié)核桿菌標(biāo)準毒株H37Rv DNA為模板，用5、端特異性引物MtblO. 4F和3、端引物MtblO. 4R擴增MtblO. 4全基因序列；PCR反應(yīng)條件96°C預(yù)變性lmin，98°C變性10s，M°C復(fù)性15s，72°C延伸30s, 30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化進行純化；(3)構(gòu)建重組質(zhì)粒MtblO. 4-pET-30a 用Nde I和Sac I雙酶切純化后的MtblO. 4基因和質(zhì)粒pET30a，在T4連接酶的作用下將兩者進行連接，轉(zhuǎn)化入E.Coli DH5 α (DH5 α為大腸桿菌Ε. Coli的一個菌屬)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒MtblO. 4-pET-30a(+)，PCR驗證篩選陽性克隆進行測序鑒定；G)PCR擴增Hspl6. 3基因以結(jié)核桿菌標(biāo)準毒株DNA為模板，用Hspl6. 3F和Hspl6. 3R 擴增Hspl6.3基因片段；PCR反應(yīng)條件96°C預(yù)變性lmin，98°C變性10s，55°C復(fù)性20s，72°C延伸30s, 30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化；(5)構(gòu)建重組質(zhì)粒MtblO. 4-Hspx-pET-30a(+)用&ic I和HindIII雙酶切純化后Hspx 基因和重組質(zhì)粒MtblO. 4-pET-30a(+)，分別純化后用T4連接酶進行連接，轉(zhuǎn)化入E. Coli DH5 α，克隆構(gòu)建重組質(zhì)粒MtblO. 4-Hspx-pET-30a(+) ；PCR驗證篩選陽性克隆進行測序鑒定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌融合蛋白MtblO.4-Hspl6. 3的構(gòu)建、表達和純化方法，其特征在于所述的融合蛋白MtblO. 4-Hspl6. 3的表達方法包括以下步驟(1)從以上E.Coli pET30a-Mtbl0. 4-Hspl6. 3 提取重組質(zhì)粒 pET30a-Mtbl0. 4_Hspl6. 3，轉(zhuǎn)化入Ε. Coli中，PCR驗證篩選陽性克隆進行測序鑒定；(2)活化表達MH蛋白的Ε.coli菌體，取活化后菌體加入培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)；誘導(dǎo)振蕩培養(yǎng)，離心收集菌體；菌體重懸于緩沖液中，冰浴下超聲破碎細菌，離心后分別收集上清和沉淀，將上清和沉淀分別進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)核分枝桿菌融合蛋白MtblO.4-Hspl6. 3的構(gòu)建、表達和純化方法，其特征在于所述的融合蛋白MtblO. 4-Hspl6. 3的純化方法包括以下步驟(1)配制以下緩沖液1液 20mM PB ；II 液 2OmM PB+1M NaCl ；III 液 2OmM PB+2M NaCl ； 緩沖液均用濾器過濾除菌；(2)大量表達融合蛋白MH，收集的菌體重懸于緩沖液中，冰浴下超聲破碎，離心后收集含MH蛋白的上清，上清用濾器過濾除菌；(3)第一步純化離子交換層析選用強陰離子交換柱Q介質(zhì)進行純化，收集不同梯度洗脫液進行SDS-PAGE分析得初步純化物；(4)第二步純化疏水層析經(jīng)過離子交換層析初步純化后的蛋白，加入等體積的III 液，使蛋白含高鹽上柱，選用Butyl HP柱進行純化，收集不同梯度洗脫液進行SDS-PAGE分析得二步純化物；(5)第三步純化凝膠過濾層析將經(jīng)過離子交換層析和疏水層析兩步純化后的蛋白， 選用superdex 75柱進行純化，收集不同梯度洗脫液進行SDS-PAGE分析得最終純化物；(6)將最終得到的蛋白純化物測定濃度之后即可使用。
5.結(jié)核分枝桿菌融合蛋白MtblO. 4-Hspl6. 3在結(jié)核亞單位疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了結(jié)核分枝桿菌融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3的構(gòu)建、表達和純化方法及其應(yīng)用，將Mtb10.4和Hsp16.3基因進行PCR擴增并依次插入到克隆載體的多克隆位點中,構(gòu)建重組載體；然后在大腸桿菌中表達；最后進行純化得到融合蛋白Mtb10.4-Hsp16.3，該融合蛋白可在結(jié)核亞單位疫苗中應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點在于該融合蛋白疫苗可誘導(dǎo)動物較強的細胞和體液免疫反應(yīng)；通過動物攻毒實驗表明，該疫苗在BCG免疫基礎(chǔ)上，具有加強免疫作用，可提高和延長BCG的保護效果；且該疫苗無明顯毒副作用。
文檔編號C12N15/31GK102154324SQ201010613320
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者萬艷, 李青, 牛紅霞, 王秉翔, 祝秉東, 胡麗娜, 辛奇, 達澤蛟, 馬維民 申請人:蘭州大學(xué)