專利名稱：一種無載體固定化脂肪酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化工領(lǐng)域，尤其涉及一種無載體固定化脂肪酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
酶作為一種生物催化劑，近年來已被人們廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)與檢測、環(huán)保技術(shù)、 生物技術(shù)等領(lǐng)域。但酶價格昂貴、穩(wěn)定性差、反應(yīng)后難以回收等缺點(diǎn)限制了酶制劑產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用，在這種情況下固定化酶應(yīng)運(yùn)而生。酶的固定化是用固體材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)，仍能進(jìn)行其特有的催化反應(yīng)，并可回收及重復(fù)利用的一類技術(shù)。與游離酶相比，固定化酶在保持其高效專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時，又克服了游離酶的不足， 呈現(xiàn)貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用從而降低成本等一系列優(yōu)點(diǎn)。改進(jìn)傳統(tǒng)固定化方法、應(yīng)用工藝的優(yōu)化研究是酶固定化研究的主要趨勢。傳統(tǒng)酶的固定化方法有吸附法、包埋法、結(jié)合法和熱固定法等，這些方法都是需要把酶分子在不同的原理下結(jié)合在載體上。中國專利CN200680036485. 3公開了一種制備固定化酶制品的方法；CN200910047517. 5公開了一種磁性納米顆粒固定化脂肪酶及其制備方法；上述兩篇專利申請文件所記載的方法都需要利用載體實(shí)現(xiàn)酶的固定化。2004年，Roger Sheldon教授提出一種新型的無載體酶固定化的方法一Cross-Linking Enzyme Aggregates,使用戊二醛作為交聯(lián)劑把處于沉淀狀態(tài)的酶分子固定下來，所得到的固定化酶顯示了良好的催化活性。目前這種技術(shù)在?；?、脂肪酶和脫氫酶的固定化都有廣泛的研究。脂肪酶是一類能催化油脂和短鏈醇進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)生成脂肪酸甲酯的生物催化劑，被認(rèn)為是制備可再生能源的一生物柴油的一種優(yōu)良的生物方法脂肪酶所介導(dǎo)的反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和、醇用量小、產(chǎn)品易收集純化、無污染物排放等優(yōu)點(diǎn)。而目前國內(nèi)外用于生物柴油研究的脂肪酶主要為諾維信公司生產(chǎn)的NOVOZym435，此酶為樹脂固定化酶，載體為大孔丙烯酸樹脂，價格高昂，不利于酶法制備生物柴油的工業(yè)化生產(chǎn)。因此，開發(fā)一種成本低廉、制備方法簡便的無載體固定化脂肪酶勢在必行。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種無載體固定化脂肪酶的制備方法， 該方法通過脂肪酶在硫酸銨沉淀的作用下，利用交聯(lián)劑戊二醛把酶分子交聯(lián)聚集，來實(shí)現(xiàn)脂肪酶固定化目的，成本低、易于操作。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明提出以下的技術(shù)方案一種無載體固定化脂肪酶的制備方法，包括以下步驟1)將脂肪酶凍干酶粉溶解于磷酸緩沖液中制成酶液；2)步驟1)中的酶液在攪拌的同時加入硫酸銨固體，硫酸銨飽和度達(dá)到50%，攪拌，使脂肪酶沉淀；3)步驟2)完成后，逐滴加入濃度為12. 5% (ν/ν)的戊二醛溶液并于4°C攪拌；
4)將步驟幻得到的懸濁液離心，得到不溶于水的顆粒，用磷酸緩沖液清洗，至上清中不含有脂肪酶水解活性為止；5)將步驟4)中得到的不溶于水的顆粒冷凍干燥，得到淡黃色的粉末，即為無載體固定化脂肪酶。所述脂肪酶為擴(kuò)展青霉脂肪酶。所述步驟1)脂肪酶凍干酶粉在0-4°C溫度條件下溶解于磷酸緩沖液，所述磷酸緩沖液(Na2HPO4-NaH2PO4)PH = 6. 0，濃度為0. 05M ；每Ig脂肪酶凍干粉溶解于上述緩沖液 200mL 中。所述步驟3)中戊二醛添加量為每IOOmL溶液中加入ImL戊二醛溶液，攪拌時間為24小時。所述步驟4)中測定脂肪酶水解活性反應(yīng)體系為緩沖液清洗上清2. OmL底物pNPP (20 μ Μ)0. 23mLTritonX-1000. 27mL反應(yīng)溫度為37°C，在400nm下連續(xù)5min記錄對硝基苯酚(pNP)的產(chǎn)生量。pNPP ^ p-nitrophenyl palmitate 的縮寫，其中文名稱為棕櫚酸對硝基苯酯本發(fā)明的第二個目的在于提供上述方法制備的無載體固定化脂肪酶。有益效果說明本發(fā)明所述無載體固定化脂肪酶的制備方法具有成本低、易于操作的優(yōu)點(diǎn)。本方法采用飽和度為50%的硫酸銨來沉淀脂肪酶，達(dá)到了最佳沉淀效果；戊二醛在反應(yīng)體系的終濃度，戊二醛濃度過高，酶分子會驟聚而失活，戊二醛濃度過低即無法形成交聯(lián)體，經(jīng)過多次摸索本方法采用終濃度為0.125% (ν/ν)的戊二醛溶液，形成高質(zhì)量交聯(lián)體。


圖1所示是本發(fā)明第一實(shí)施例的固定化PEL-CLEA催化水解反應(yīng)的反應(yīng)時間和產(chǎn)物吸光值的關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)路線做進(jìn)一步詳細(xì)說明，本發(fā)明的技術(shù)路線為1)酶液配制本發(fā)明所使用的擴(kuò)展青霉脂肪酶凍干粉是由該酶的發(fā)酵液經(jīng)過凍干濃縮后所得的粉末狀物質(zhì)，稱取適量的酶粉溶于緩沖液中，在低溫恒速磁力攪拌下能得到實(shí)驗(yàn)所需的相應(yīng)酶濃度的酶液；本發(fā)明所述擴(kuò)展青霉購自深圳市綠微康生物工程有限公司；2)以緩沖體系硫酸銨終濃度50%沉淀脂肪酶分子；3)加入交聯(lián)劑戊二醛，是緩沖體系中戊二醛終濃度為0. 125%，4°C下連續(xù)攪拌 24h ；
4)懸濁液經(jīng)過離心后所得到的不溶于水的沉淀物顆粒用同種緩沖液清洗數(shù)次，至清洗上清中不含有脂肪酶水解活性為止，由此才能確定之后催化反應(yīng)的是被固定下來的脂肪酶而不是游離的酶；5)上述不溶于水的沉淀物顆粒即為經(jīng)過戊二醛固定下來的酶，使用冷凍干燥使其完全干燥、用研缽碾壓后得到淡黃色的粉末狀物質(zhì)即為擴(kuò)展青霉脂肪酶的無載體固定化 (PEL-CLEA)。實(shí)施例1無載體固定化擴(kuò)展青霉脂肪酶的制備及催化水解反應(yīng)稱取1. 5gPEL凍干酶粉于500mL錐形瓶中，加入300mL50 %硫酸銨磷酸緩沖液 (pH6. 5,0. 05M)，4°C下磁力攪拌至酶粉顆粒全溶；取lmL50%戊二醛與3mL磷酸緩沖液混合，得12. 5 %戊二醛，在上述錐形瓶中逐滴加入3mL后反應(yīng)Mh ；離心后上清測無酶活，把沉淀物使用磷酸緩沖液洗至上清無顏色為止(共洗8次，洗出液均無酶活)；真空干燥過夜， 稱得 0. 3977g。無載體固定化擴(kuò)展青霉脂肪酶催化水解反應(yīng)取30mg固定化酶進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件如下磷酸緩沖液(ρΗ6·0，0· 05M) 7. 2mLTritonX-IOO1. 8mL
底物 pNPP (20 μ Μ) ImL在37°恒溫?fù)u床反應(yīng)，隔5min取2mL在6000rpm下離心^iiin后在400nm檢測吸光值。結(jié)果參見圖1，圖1為對硝基苯酚反應(yīng)時間和其在400nm下的吸光值變化圖(對硝基苯酚為PNPP在脂肪酶催化水解的產(chǎn)物)。在無載體固定化擴(kuò)展青霉脂肪酶的催化下，對硝基苯酚的生成和反應(yīng)時間成正比例關(guān)系，其吸光值的變化量為0. OOM/min，說明此無載體固定化擴(kuò)展青霉脂肪酶具有良好的催化性能。實(shí)施例2用實(shí)施例1所制備無載體固定化擴(kuò)展青霉脂肪酶制備生物柴油。在25mL具塞三角瓶中加入Ig玉米油，一定比例的溶劑、甲醇和水，置于可自動控溫的往復(fù)搖床中加熱至一定溫度后，加入實(shí)施例1所制備無載體固定化擴(kuò)展青霉脂肪酶 400mg開始反應(yīng)，定時取反應(yīng)液用于甲酯含量分析。取50 μ L反應(yīng)液離心分層，取上層液樣 5 μ L，用295 μ L正己烷溶解，混勻，再加入300 μ L十七碳烯酸甲酯Qmg/mL)作為內(nèi)標(biāo)；取 ι μ L樣品進(jìn)樣，由氣相色譜測定反應(yīng)物中的脂肪酸甲酯量。結(jié)果測定顯示，在Ig玉米油中加入0. 5mL新型溶劑一離子液體[&iiim] [PF6]作為反應(yīng)溶劑，醇油摩爾比為2 1，含水量為1.5% (w/w相對于油的質(zhì)量)，搖床轉(zhuǎn)速250r/ min，溫度40°C，反應(yīng)時間Mh，此時400mg該無載體固定化擴(kuò)展青霉脂肪酶催化玉米油產(chǎn)生生物柴油的甲酯轉(zhuǎn)化率為47. 43%。
權(quán)利要求
1.一種無載體固定化脂肪酶的制備方法，包括以下步驟1)將脂肪酶凍干酶粉溶解于磷酸緩沖液中制成酶液；2)步驟1)中的酶液在攪拌的同時加入硫酸銨固體，硫酸銨飽和度達(dá)到50%，攪拌，使脂肪酶沉淀；3)步驟幻完成后，逐滴加入濃度為12.5%(ν/ν)的戊二醛溶液并于4°C攪拌；4)將步驟幻得到的懸濁液離心，得到不溶于水的顆粒，用磷酸緩沖液清洗，至上清中不含有脂肪酶水解活性為止；5)將步驟4)中得到的不溶于水的顆粒冷凍干燥，得到淡黃色的粉末，即為無載體固定化脂肪酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無載體固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于所述脂肪酶為擴(kuò)展青霉脂肪酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的無載體固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于，所述步驟1)脂肪酶凍干酶粉在0-4°C溫度條件下溶解于磷酸緩沖液，所述磷酸緩沖液 (Na2HPO4-NaH2PO4) pH = 6. 0，濃度為0. 05M ；每Ig脂肪酶凍干粉溶解于上述緩沖液200mL中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的無載體固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于，所述步驟3)中戊二醛添加量為每IOOmL溶液中加入ImL戊二醛溶液，攪拌時間為M小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的無載體固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于，所述步驟4)中測定脂肪酶水解活性反應(yīng)體系為 緩沖液清洗上清2. OmL 底物 pNPP (20 μ Μ) 0. 23mL TritonX-100 0. 27mL反應(yīng)溫度為37°C，在400nm下連續(xù)5min記錄對硝基苯酚 (pNP)的產(chǎn)生量。
6.權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述方法制備的無載體固定化脂肪酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種無載體固定化脂肪酶的制備方法，包括以下步驟1)酶液配制；2)以緩沖體系硫酸銨終濃度50％沉淀脂肪酶分子；3)加入交聯(lián)劑戊二醛；4)離心，得到不溶于水的沉淀物顆粒；5)使用冷凍干燥使其完全干燥后得到淡黃色的粉末狀物質(zhì)即為無載體固定化的擴(kuò)展青霉脂肪酶(PEL-CLEA)。本發(fā)明所述方法通過脂肪酶在硫酸銨沉淀的作用下，利用交聯(lián)劑戊二醛把酶分子交聯(lián)聚集，來實(shí)現(xiàn)脂肪酶固定化目的，成本低、易于操作。
文檔編號C12N11/00GK102154256SQ20101060350
公開日2011年8月17日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月23日
發(fā)明者楊縝, 賴璟琦 申請人:深圳大學(xué)