專利名稱：惡臭假單胞菌zjb09102及其在制備環(huán)氧氯丙烷中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株能夠催化脫鹵反應(yīng)的惡臭假單胞菌ZJB09102及其在制備環(huán)氧氯丙烷中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
環(huán)氧氯丙烷是一種無色、透明、油狀液體，有與氯仿、醚相似的刺激性氣味，它易揮發(fā)、不穩(wěn)定的液體，沸點為117.9°C，微溶于水(20°C時溶解度為7. 04g)，易溶于酒精，乙醚， 苯等有機溶劑，可與多種有機液體形成共沸物，并有毒性和麻醉性。是用于生產(chǎn)環(huán)氧樹脂、 氯醇橡膠、硝化炸藥、玻璃鋼、電絕緣制品的主要原料；也可用于生產(chǎn)膠黏劑、陽離子交換樹脂等、作增塑劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、醫(yī)藥以及纖維素酯、纖維素醚和樹脂的溶劑等。環(huán)氧氯丙烷的生產(chǎn)方法主要有丙烯高溫氯化法，醋酸丙烯酯法，1，3- 二氯-2-丙醇氯化法等方法。雖然化學(xué)法是目前環(huán)氧氯丙烷的主要生產(chǎn)方法，但是其主要的弊端是環(huán)境污染大，對生產(chǎn)設(shè)備的要求相對較高。生物法由于具有反應(yīng)條件溫和，污染小等優(yōu)點，越來越受到人們的重視。目前以1，3_ 二氯-2-丙醇為底物，采用生物法進行脫鹵生產(chǎn)環(huán)氧氯丙烷的研究未見文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種能夠催化脫鹵反應(yīng)的新菌株——惡臭假單胞菌ZJB09102 及其在制備環(huán)氧氯丙烷中的應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)ZJB09102，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號CCTCCNo =M 2010273，保藏日期2010年 10月24日。該菌株菌落形態(tài)如下呈圓形光滑狀、濕潤、不透明、邊緣整齊、淺白色、不易挑??； 光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)短桿狀，有鞭毛。生理生化指標(biāo)為革蘭氏陰性菌，氧化酶反應(yīng)呈陽性，V-P試驗及甲基紅試驗呈陰性。根據(jù)以上微生物學(xué)特征，這新的菌株被鑒定惡臭假單胞菌(I^eudomonas putida)，不屬于己公開專利菌種的任何一種，該微生物菌株具有將1，3- 二氯-2-丙醇轉(zhuǎn)化為環(huán)氧氯丙烷的能力，可以用于環(huán)氧氯丙烷的生產(chǎn)。本發(fā)明還涉及所述的惡臭假單胞菌ZJB09102在微生物催化1，3_ 二氯_2_丙醇制備環(huán)氧氯丙烷中的應(yīng)用。1，3-二氯-2-丙醇是一種廣泛應(yīng)用工業(yè)化學(xué)品原料，經(jīng)過微生物脫鹵酶催化反應(yīng)，得到環(huán)氧氯丙烷。應(yīng)用時，可將菌種接種至含底物1，3_ 二氯-2-丙醇的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)分離純化獲得環(huán)氧氯丙烷；或者將菌種接種至不含1，3_ 二氯-2-丙醇的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，在發(fā)酵過程中流加滅菌后的1，3_ 二氯-2-丙醇溶液，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)分離純化得到環(huán)氧氯丙烷。具體的，所述應(yīng)用為在適用惡臭假單胞菌屬的發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加底物1，3_ 二氯-2-丙醇進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液進行分離純化得到所述環(huán)氧氯丙烷。所述底物1，3- 二氯-2-丙醇初始添加量為2 20g/L培養(yǎng)基，在發(fā)酵培養(yǎng)開始后 0 M小時添加，可直接將底物添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中，也可在發(fā)酵進行后往培養(yǎng)基中流加底物溶液。所述發(fā)酵培養(yǎng)在20 40°C下進行，發(fā)酵培養(yǎng)總時間48 96小時。優(yōu)選在 35°C>pH7. 0下培養(yǎng)48小時左右。所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下葡萄糖1 5%，酵母粉0. 2.5%，蛋白胨0. 1 % 2. 5 %，(NH4) 2S04 :0. 1 % 2. 5 %，KaH2PO4 · 2H20 :0. 1 % 0. 5 %，MgSO4 0.01% 0.05%，余量為水，pH值4.0 7.0。培養(yǎng)基濃度以質(zhì)量/體積百分比(w/v)表示，某組分濃度為表示每IOOmL溶液中含有Ig該組分。所述分離純化方法可按常規(guī)方法進行，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)產(chǎn)物環(huán)氧氯丙烷性質(zhì)進行設(shè)定，本發(fā)明中產(chǎn)物分離純化方法如下將發(fā)酵液進行固液分離得到上清液，加入等量乙酸乙酯進行萃取，取有機相進行蒸餾去除溶劑，得到環(huán)氧氯丙烷。具體的，所述應(yīng)用方法如下(1)種子培養(yǎng)基滅菌、接種惡臭假單胞菌ZJB09102，搖床轉(zhuǎn)速150r/minJ8°C下培養(yǎng)M小時獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成葡萄糖1 5%，酵母粉0. 2. 5%，蛋白胨:0· 2. 5%，(NH4)2SO4 :0· 2. 5%，KaH2PO4 · 2H20 :0. 0. 5%， MgSO4 0. 01% 0. 05%，余量為水，pH值4. 0 7. 0 ；所述種子培養(yǎng)基組成也可與發(fā)酵培養(yǎng)基相同；(2)種子液以1 10%體積比接種至滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速150r/min、 28°C下培養(yǎng)72小時獲得發(fā)酵液；1，3- 二氯-2-丙醇0. 2 2 %，葡萄糖1 5 %，酵母粉 0. 2. 5%，蛋白胨0. 2. 5%, (NH4)2SO4 0. 2. 5%, KaH2PO4 · 2H20 :0.
0. 5%, MgSO4 0. 01% 0. 05%，余量為水，pH 值 4. 0 7. 0 ；(3)發(fā)酵液離心，取上清液加入等量乙酸乙酯進行萃取，取有機相進行蒸餾去除溶劑，得到環(huán)氧氯丙烷。本發(fā)明中，環(huán)氧氯丙烷的分析方法可采用氣相色譜進行環(huán)氧氯丙烷氣相色譜分析方法將一定量發(fā)酵液12000rpm，離心lOmin，取上清液進行微濾，進行GC檢測。使用Agilent 6890氣相色譜儀，色譜柱為FFAP毛細(xì)管柱 (30. OmX 250 μ mX0.33 μ m)。氣相色譜條件前進樣口 190°C, FID檢測器220°C ；分流比 10 1 ；氫氣流量40. Oml/min,空氣流量400ml/min,尾氣(氮氣)流量35. Oml/min ；升溫柱箱初始溫度90°C，保持4. 5min, 15°C /min升到150°C，保持3. 5min。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明微生物菌株惡臭假單胞菌ZJB09102具有很強的脫鹵反應(yīng)的能力；利用該菌株生產(chǎn)環(huán)氧氯丙烷，1，3- 二氯-2-丙醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)到 50 % 90 %，(即1摩爾的1，3- 二氯-2-丙醇能轉(zhuǎn)化為0. 50 0. 90摩爾的環(huán)氧氯丙烷)； 而且生產(chǎn)過程不使用化學(xué)催化劑，具有綠色環(huán)保的特點，適用于環(huán)氧氯丙烷的工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此
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實施例1 培養(yǎng)基配方(w/v) :1，3-二氯-2-丙醇0. 5%，酵母粉0. 1%，蛋白胨0. 1%， (NH4)2S04 :0. 1%, NaH2PO4 · 2H20 0. 1%, MgSO4 :0. 01 %，用自來水配制，用 HCl 溶液將 pH 調(diào)到5.0，滅菌備用。取IOOmL上述培養(yǎng)基，平均分裝在2個250mL三角瓶中，滅菌，接入惡臭假單胞菌 ZJB09102(CCTCC No =M 2010273)，培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在搖床培養(yǎng)24h作為種子液。取2L上述培養(yǎng)基，平均分裝入40個500mL搖瓶中，滅菌。接入種子液，以體積比 1. 5%的接種量接入種子液，進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20°C，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)時間為 72h，1，3- 二氯-2-丙醇轉(zhuǎn)化成環(huán)氧氯丙烷的轉(zhuǎn)化率為88%。收集上述發(fā)酵液1. 5L，經(jīng)過離心(lOOOOXg，IOmin)之后，上清液中加入等量的乙酸乙酯，萃取后進行蒸餾去除溶劑，得到3. 86g環(huán)氧氯丙烷。實施例2 培養(yǎng)基配方1，3-二氯-2-丙醇0. 2 %，酵母粉2. 5 %，蛋白胨0. 5 %， (NH4)2S04 :0. 1%,NaH2PO4 ·2H20 0. 5%,MgSO4 :0. 05%，用自來水配制，用 NaOH 溶液將 pH 調(diào)到7.0，滅菌備用。取500mL培養(yǎng)基，平均分裝在10個500mL三角瓶中，滅菌，接入惡臭假單胞菌 ZJB09102，進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為^°C，培養(yǎng)時間為50h，反應(yīng)在攪拌、通風(fēng)、振蕩條件下進行，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。1，3_ 二氯-2-丙醇轉(zhuǎn)化成環(huán)氧氯丙烷的轉(zhuǎn)化率為90%。收集上述發(fā)酵液400mL，進行分離、純化，步驟同實施例1，得到0. 52克環(huán)氧氯丙燒。實施例3:發(fā)酵培養(yǎng)基配方1，3_ 二氯-2-丙醇2%，酵母粉2. 5 %，蛋白胨2. 5 %， (NH4)2S04 2. 5%,NaH2PO4 ·2H20 0. 1%,MgSO4 :0. 05%，用自來水配制，用 NaOH 溶液將 pH 調(diào)到7.0，滅菌備用。種子培養(yǎng)基配方酵母粉2· 5 %，蛋白胨2· 5 %，(NH4)2SO4 2. 5 %, NaH2PO4 · 2H20 0. 1%, MgSO4 :0. 05%，，用自來水配制，用NaOH溶液將pH調(diào)到7. 0，滅菌備用。取IOOmL種子培養(yǎng)基，平均分裝在2個500mL三角瓶中，滅菌，接入惡臭假單胞菌 ZJB09102,培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，在30°C搖床培養(yǎng)24h作為種子液，備用。取4L發(fā)酵培養(yǎng)基，平均分裝在80個500mL三角瓶中，滅菌。接入種子液，以體積比2. 0%的接種量接入種子液，進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時間為72h，反應(yīng)在攪拌、 通風(fēng)、振蕩條件下進行，搖床轉(zhuǎn)速200r/min。1，3_ 二氯-2-丙醇轉(zhuǎn)化成環(huán)氧氯丙烷的轉(zhuǎn)化率為50%。收集上述發(fā)酵液3. 5L，進行分離、純化，步驟同實施例1，得到36. Ig環(huán)氧氯丙烷。實施例4培養(yǎng)基配方1，3-二氯-2-丙醇1.0%，酵母粉0.5%，蛋白胨1.0%，(NH4)2SO4 1. 0%, NaH2PO4 · 2H20 0. 5%, MgSO4 0. 03%，用自來水配制，pH 7. 0，滅菌備用。取200mL上述培養(yǎng)基，平均分裝在4個250mL三角瓶中，滅菌，接入惡臭假單胞菌ZJB09102,培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在搖床培養(yǎng)24h作為種子液，備用。在IOL發(fā)酵罐中加入上述培養(yǎng)基7. 0L，滅菌，接入種子液lOOmL，下進行發(fā)酵培養(yǎng)。在接種后，隨即開始流加1，3_ 二氯-2-丙醇，流加速度0.04mL/min，總共流加 140mLl，3-二氯-2-丙醇(濃度為98%，ν/ν)。在培養(yǎng)溫度30°C，通氣量5L/min，攪拌速度 300r/min，培養(yǎng)72h結(jié)束。1，3_ 二氯-2-丙醇轉(zhuǎn)化成環(huán)氧氯丙烷的轉(zhuǎn)化率為90%。收集上述發(fā)酵液6L，進行分離、純化，步驟同實施例1，得到69.3克環(huán)氧氯丙烷。實施例5 培養(yǎng)基配方1，3-二氯-2-丙醇2.0 %，酵母粉2. 5 %，蛋白胨1.0 %， (NH4)2SO4 1. 0%, NaH2PO4 · 2H20 :0. 5%, MgSO4 :0. 03%，用自來水配制，ρΗ6· 5，滅菌備用。取200mL上述培養(yǎng)基，平均分裝在4個500mL三角瓶中，滅菌，接入惡臭假單胞菌 ZJB09102,培養(yǎng)菌體，搖床轉(zhuǎn)速150r/min，在搖床培養(yǎng)24h作為種子液，備用。在IOL發(fā)酵罐中加入上述培養(yǎng)基7L，滅菌，接入種子液lOOmL，下進行發(fā)酵培養(yǎng)。在菌體發(fā)酵24h后，進行流加1，3- 二氯-2-丙醇，流加速度0. 07mL/min ；總共流加1，3_ 二氯-2-丙醇180mL(濃度為98%，ν/ν)，培養(yǎng)溫度，通氣量5L/min，攪拌速度 300r/min，共培養(yǎng)72h。1，3_ 二氯-2-丙醇轉(zhuǎn)化成環(huán)氧氯丙烷的轉(zhuǎn)化率為82%。收集上述發(fā)酵液7L，進行分離、純化，步驟同實施例1，得到140. 7g環(huán)氧氯丙烷。
權(quán)利要求
1.惡臭假單胞菌O3SeudomonaSputida)ZJB09102，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 地址中國，武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號CCTCCNo =M 2010273，保藏日期2010年10月M日。
2.如權(quán)利要求1所述的惡臭假單胞菌ZJB09102在微生物催化1，3-二氯-2-丙醇制備環(huán)氧氯丙烷中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為在適用惡臭假單胞菌屬的發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加底物1，3- 二氯-2-丙醇進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，發(fā)酵液進行分離純化得到所述環(huán)氧氯丙烷。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述底物1，3-二氯-2-丙醇初始添加量為 2 20g/L培養(yǎng)基，在發(fā)酵培養(yǎng)開始后O M小時添加。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)在20 40°C下進行，發(fā)酵培養(yǎng)總時間48 96小時。
6.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下葡萄糖1 5%，酵母粉:0. 2. 5%，蛋白胨0. 2. 5%，(NH4)2SO4 :0· 2. 5%， KaH2PO4 · 2H20 0. 0. 5%, MgSO4 0. 01% 0. 05%，余量為水，pH 值 4. 0 7. 0。
7.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述分離純化方法如下將發(fā)酵液進行固液分離得到上清液，加入等量乙酸乙酯進行萃取，取有機相進行蒸餾去除溶劑，得到環(huán)氧氯丙焼。
8.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用方法如下(1)種子培養(yǎng)基滅菌、接種惡臭假單胞菌ZJB09102，搖床轉(zhuǎn)速150r/minJ8°C下培養(yǎng)M小時獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成葡萄糖1 5%，酵母粉0. 2. 5%，蛋白胨:0· 2. 5%，(NH4)2SO4 :0· 2. 5%，KaH2PO4 · 2H20 :0. 0. 5%， MgSO4 0. 01% 0. 05%，余量為水，pH 值 4. 0 7. 0 ；(2)種子液以1 10%體積比接種至滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速150r/min、28°C下培養(yǎng)72小時獲得發(fā)酵液；1，3-二氯-2-丙醇0. 2 2%，葡萄糖1 5%，酵母粉0. 2. 5%，蛋白胨:0· 2. 5%，(NH4)2SO4 :0· 2. 5%，KaH2PO4 · 2H20 :0. 0. 5%， MgSO4 0. 01% 0. 05%，余量為水，pH 值 4. 0 7. 0 ；(3)發(fā)酵液離心，取上清液加入等量乙酸乙酯進行萃取，取有機相進行蒸餾去除溶劑， 得到環(huán)氧氯丙烷。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株能夠催化脫鹵反應(yīng)的惡臭假單胞菌ZJB09102及其在制備環(huán)氧氯丙烷中的應(yīng)用，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學(xué)，430072，保藏編號CCTCC NoM 2010273，保藏日期2010年10月24日。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明微生物菌株惡臭假單胞菌ZJB09102具有很強的脫鹵反應(yīng)的能力；利用該菌株生產(chǎn)環(huán)氧氯丙烷，1，3-二氯-2-丙醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)到50％～90％(即1摩爾的1，3-二氯-2-丙醇能轉(zhuǎn)化為0.50～0.90摩爾的環(huán)氧氯丙烷)，而且生產(chǎn)過程不使用化學(xué)催化劑，具有綠色環(huán)保的特點，適用于環(huán)氧氯丙烷的工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12P17/02GK102168041SQ20101059988
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月22日
發(fā)明者胡忠策, 許輝輝, 鄭裕國 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)