專利名稱：一種新的偽狂犬病活疫苗的效力檢驗(yàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本研究采用Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)測定偽狂犬病活疫苗TCID5tl (半數(shù)組織 培養(yǎng)物感染量)的方法，與CEP (單層雞胚成纖維細(xì)胞)測定偽狂犬病活疫苗TCID5tl的方法 相比省時、省力。
背景技術(shù)：
偽狂犬病活疫苗效力檢驗(yàn)方法是使用雞胚成纖維細(xì)胞進(jìn)行效力檢驗(yàn)，但是使用 SPF雞胚制備成纖維細(xì)胞時，需要將雞胚孵化至9-10日齡，時間較長，此外制備過程中批 次間差異大，接毒培養(yǎng)數(shù)日后，由于對照細(xì)胞部分脫落，觀察病變時往往受到空白對照的影 響，尤其是倍比稀釋度高的接種瓶的細(xì)胞病變與空白對照瓶中老化脫落細(xì)胞難以判斷，影 響了最終判定結(jié)果。文獻(xiàn)檢索披露中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所劉景利等人進(jìn)行了偽狂犬強(qiáng)毒 S株TCID5tl與LD5tl毒價對比試驗(yàn)研究方法取偽狂犬強(qiáng)毒S株45代以Hank’ s液10倍遞增 稀釋至10_8倍，分兩組；一組以10_5 10_8等4個稀釋度接種已培養(yǎng)好的雞胚成纖維單層 細(xì)胞(20m培養(yǎng)瓶)，每個滴度接種4個小瓶，每瓶接種0. Iml,然后每小瓶加維持液4ml，設(shè) 4瓶細(xì)胞為對照組；37°C培養(yǎng)，接毒24h后觀察產(chǎn)生病變情況，觀察96h結(jié)束。另一組以同 樣稀釋度范圍(10_5 10_8)接種兔，每個稀釋度接種兔，每只兔腿部肌肉接種1ml，每日觀 察兔發(fā)病死亡情況，觀察7天結(jié)束；根據(jù)初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，S株45代毒的毒價在兔體上與 在雞胚成纖維細(xì)胞上基本一致；結(jié)論偽狂犬強(qiáng)毒毒價可用TCID5tl與LD5tl兩種方法測定，但 由于在測定LD5tl過程中，需接種實(shí)驗(yàn)動物，一方面過程相對比較繁瑣，另一方面實(shí)驗(yàn)動物的 個體差異及飼養(yǎng)條件等因素均可能會對結(jié)果有所影響；而在測定TCID5tl過程中，由于使用 10日齡SPF雞胚培養(yǎng)的雞胚成纖維單層細(xì)胞的穩(wěn)定性較好，且試驗(yàn)全過程均在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn) 行，試驗(yàn)較容易進(jìn)行，結(jié)果受外界因素影響較小。本研究與上述的相關(guān)文獻(xiàn)對比分析，兩者 偽狂犬病毒疫苗效力的檢驗(yàn)方法截然不同。本發(fā)明構(gòu)思是將疫苗接種在VERO細(xì)胞、PK-15細(xì)胞和CEF三種細(xì)胞上，測定的毒 價，其結(jié)果表明，采用VERO細(xì)胞代替雞胚成纖維細(xì)胞測定偽狂犬病活疫苗的效價是可行 的，準(zhǔn)確的，有應(yīng)用價值的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供的偽狂犬病活疫苗效力檢驗(yàn)方法，替代了單層雞胚成纖 維細(xì)胞測定偽狂犬病活疫苗的方法，使效力檢驗(yàn)更準(zhǔn)確、便于操作。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的一種新的偽狂犬病活疫苗的效力檢驗(yàn)方法，采用Vero細(xì)胞 測定偽狂犬病毒活疫苗TCID5tl的方法，分步如下；
其中Vero細(xì)胞的制備
抽取密度為2. OX IO6的Vero凍存細(xì)胞1. 5ml，置于37°C水浴中，晃動溶解4_5分鐘， 在2000rmp/min條件下，離心5分鐘，棄去上清，加入l_3ml細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，置
3于37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)48小時后，用濃度0. 25%的EDTA-胰酶消化細(xì)胞，再 用細(xì)胞營養(yǎng)液稀釋成2. OX IO6的Vero細(xì)胞懸液，鋪到細(xì)胞板上，置于37°C、5%的CO2培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24小時成致密單層備用； 其中偽狂犬病活疫苗的接種
抽取1頭份偽狂犬病活疫苗，用細(xì)胞維持液作10倍的梯度稀釋，取10_3-10_7的滴度樣， 分別加入上述的致密單層中，每孔lOOul，同時設(shè)對照每孔加細(xì)胞維持液lOOul，放入37°C、 5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察3-5天細(xì)胞病變，計算TCID5Q/0. Iml效價，每頭份病毒含量應(yīng) 不低于 5X103 °TCID5。。所述的檢驗(yàn)方法，所用細(xì)胞培養(yǎng)液由5gMEM干粉培養(yǎng)基，90ml注射用水，胎牛血清 IOml配制而成。所述的檢驗(yàn)方法，所用細(xì)胞維持液由5gMEM干粉培養(yǎng)基，98ml注射用水，胎牛血清 2ml配制而成。所述的檢驗(yàn)方法，使用Vero細(xì)胞進(jìn)行偽狂犬病活疫苗效力檢驗(yàn)的周期為8天，比 CEP細(xì)胞檢驗(yàn)縮短7天。本方法選取3個生產(chǎn)批次的偽狂犬病活疫苗同時接種已經(jīng)制備好的Vero細(xì)胞與 雞胚成纖維細(xì)胞(CEP)中，進(jìn)行TCID5tl測定的對比實(shí)驗(yàn)，測定的結(jié)果通過T檢驗(yàn)三者的差異 性，雞胚成纖維細(xì)胞和Vero細(xì)胞的T值為T1=O. 08，雞胚成纖維細(xì)胞和PK-15細(xì)胞的T值為 T2=O. 11值。計算得T1和T2所對應(yīng)WP1, P2值均> 0.05，則說明兩組數(shù)據(jù)差異均不顯著， 由于T1 < T2，雞胚成纖維細(xì)胞和Vero細(xì)胞的差異呈極不顯著，這說明用雞胚成纖維細(xì)胞和 Vero細(xì)胞測定偽狂犬弱毒的TCID5tl結(jié)果是相同的，與國家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)相符。本發(fā)明采用Vero細(xì)胞測定偽狂犬病毒致病變作用比對CEP細(xì)胞的致病變作用快， 病變特點(diǎn)明顯，并不再需要孵化SPF雞胚和制作CEP細(xì)胞；同時該方法簡化了程序，縮短時 間，降低了污染幾率，彰顯技術(shù)進(jìn)步。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對發(fā)明作進(jìn)一步說明。檢測流程復(fù)蘇、培養(yǎng)Vero細(xì)胞步驟；疫苗稀釋、接種、計算TCID5tl步驟；
(1)Vero細(xì)胞的制備
抽取密度為2. OX IO6的Vero細(xì)胞1. 5ml，置于37°C水浴中，快速晃動溶解5分鐘，在 2000rmp/min條件下，離心5分鐘，棄去上清，加入3ml細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞輕吹散，轉(zhuǎn)入培養(yǎng) 瓶中，置于37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)48小時后，用濃度0. 25%的EDTA-胰酶消化 液消化細(xì)胞，再用細(xì)胞營養(yǎng)液稀釋成2. OX IO6的Vero細(xì)胞懸液，鋪到96孔細(xì)胞板上，置于 37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24小時后成致密單層備用；
(2)偽狂犬病活疫苗的接種
抽取1頭份偽狂犬病毒活疫苗，用2%FBS細(xì)胞維持液作10倍的梯度稀釋，取10_3、 10_4、10-5、10_6、10-7的滴度樣，分別加入上述的致密單層中，每個滴度加4孔，每孔IOOul, 同時設(shè)正常細(xì)胞對照孔4孔，每孔加細(xì)胞維持液，放入37°C、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀 察4天細(xì)胞病變，采用Reed-Muench法計算TCID5(1/0. Iml效價，每頭份病毒含量應(yīng)不低于5X103°TCID5。。上述細(xì)胞培養(yǎng)液由5gMEM干粉培養(yǎng)基，90ml注射用水，胎牛血清IOml配制而成。上述細(xì)胞維持液由5gMEM干粉培養(yǎng)基，98ml注射用水，胎牛血清2ml配制而成 選用的Vero細(xì)胞購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；MEM培養(yǎng)基為Hyclone公司生產(chǎn)，貨號
SH30024. OlB ；胎牛血清為Hyclone公司生產(chǎn)，貨號SV30087. 02 ；EDTA-胰酶消化液為蘭州 百靈公司生產(chǎn)。試驗(yàn)結(jié)果見下表1。(1)三種細(xì)胞接種偽狂犬病毒后的病變結(jié)果見表1。表1. CEP、Vero細(xì)胞和PK-15細(xì)胞接種偽狂犬病毒后病變統(tǒng)計
權(quán)利要求
1.一種新的偽狂犬病活疫苗的效力檢驗(yàn)方法，其特征在于采用Ver0細(xì)胞測定偽狂犬 病毒活疫苗TCID5tl的方法，分步如下；其中Vero細(xì)胞的制備抽取密度為2. OX IO6的Vero凍存細(xì)胞1. 5ml，置于37°C水浴中，晃動溶解4_5分鐘， 在2000rmp/min條件下，離心5分鐘，棄去上清，加入l_3ml細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，置 于37°C、5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)48小時后，用濃度0. 25%的EDTA-胰酶消化細(xì)胞，再 用細(xì)胞營養(yǎng)液稀釋成2. OX IO6的Vero細(xì)胞懸液，鋪到細(xì)胞板上，置于37°C、5%的(X)2培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)M小時成致密單層備用；其中偽狂犬病活疫苗的接種抽取1頭份偽狂犬病活疫苗，用細(xì)胞維持液作10倍的梯度稀釋，取10_3-10_7的滴度樣， 分別加入上述的致密單層中，每孔lOOul，同時設(shè)對照每孔加細(xì)胞維持液lOOul，放入37°C、 5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察3-5天細(xì)胞病變，計算TCID5Q/0. Iml效價，每頭份病毒含量應(yīng) 不低于 5X103 °TCID5。。
2.按照權(quán)利要求1所述的檢驗(yàn)方法，其特征在于所用細(xì)胞培養(yǎng)液由5gMEM干粉培養(yǎng) 基，90ml注射用水，胎牛血清IOml配制而成。
3.按照權(quán)利要求1所述的檢驗(yàn)方法，其特征在于所用細(xì)胞維持液由5gMEM干粉培養(yǎng) 基，98ml注射用水，胎牛血清2ml配制而成。
4.按照權(quán)利要求1所述的檢驗(yàn)方法，其特征在于使用Vero細(xì)胞進(jìn)行偽狂犬病活疫苗 效力檢驗(yàn)的周期為8天，比CEP細(xì)胞檢驗(yàn)縮短7天。
5.按照權(quán)利要求1所述的檢驗(yàn)方法，其特征在于選用的Vero細(xì)胞購自中國獸醫(yī)藥品 監(jiān)察所；MEM培養(yǎng)基為Hyclone公司生產(chǎn)，貨號SH30024. OlB ；胎牛血清為Hyclone公司生 產(chǎn)，貨號SV30087. 02 ；EDTA-胰酶消化液為蘭州百靈公司生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明的一種新的偽狂犬病活疫苗的效力檢驗(yàn)方法，其中Vero細(xì)胞的制備抽取密度為2.0×106的Vero細(xì)胞1.5ml，置于37℃水浴中，快速晃動溶解4-5分鐘，在2000rmp/min條件下，離心5分鐘，棄去上清，加入1-3ml細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)48小時后，用濃度0.25%的EDTA-胰酶消化液消化細(xì)胞后再用細(xì)胞營養(yǎng)液稀釋成2.0×106的Vero細(xì)胞懸液，鋪到細(xì)胞板上，置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24小時后長成致密單層備用；抽取1頭份偽狂犬病毒活疫苗，用細(xì)胞維持液作10倍的梯度稀釋，取樣分別加入上述的致密單層的96孔細(xì)胞板中，每孔加細(xì)胞維持液，放入37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察3-5天細(xì)胞病變，采用Reed-Muench法計算TCID50/0.1ml效價，每頭份病毒含量應(yīng)不低于5×103.0TCID50。
文檔編號C12Q1/02GK102094064SQ20101058832
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月15日
發(fā)明者劉淑梅, 李延濤, 杜久斌, 賀筍, 趙海源, 趙欽, 黃炯 申請人:新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司