專利名稱：一種抗菌肽天蠶素飼料添加劑的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種抗菌肽天蠶素飼料添加劑的制備方法，屬于基因工程技術領域。
背景技術：
畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)在國民經(jīng)濟中占有重要地位。高密度養(yǎng)殖方式在提高產(chǎn)量的同 時，也導致養(yǎng)殖生物疾病滋生，造成巨大經(jīng)濟損失。目前普遍使用抗生素防治病害，但所造 成的藥物殘留和病原菌抗藥性等問題，危害人類健康和環(huán)境，并成為限制畜牧水產(chǎn)品出口 的重要原因。在人們對食品安全日益關注的今天，尋找安全高效的抗生素替代品，發(fā)展健康 養(yǎng)殖，已成為飼料學科的重要研究方向。目前，抗生素替代品主要通過抑制或殺死病原菌、 改善腸道菌群、提高機體免疫力，以達到防病促生長的目的?？咕氖蔷哂锌咕钚缘囊活惗屉?，廣泛存在于生物界。生物內(nèi)源性的抗菌肽可 經(jīng)細菌感染誘導合成，在機體抵抗病原入侵方面起重要作用，更是缺乏特異性免疫功能生 物的重要防御成分。天蠶素(Cecropins)是5類昆蟲抗菌肽中抗菌活性較強的一種，其抗 菌譜廣，不僅能殺死細菌也能殺死一部分真菌；其殺菌機制是通過改變細菌細胞膜上的電 勢依賴通道，造成胞內(nèi)物質(zhì)泄漏而導致細菌死亡，這和抗生素通過阻斷大分子生物合成不 同，不易產(chǎn)生耐藥菌，且對各種抗生素耐藥菌也有殺傷作用；其還有分子量小、水溶性好及 無免疫原性等特點；它具有較強熱穩(wěn)定性，在10(TC加熱10分鐘還能保持一定活力，更適合 飼料的高溫加工過程；并且經(jīng)過人造胃酸處理后，活性保持不變；它對人畜無害，在雛雞中 發(fā)現(xiàn)，Cecropins還有促生長的作用。將Cecropins作為飼料添加劑不僅可以替代飼用抗 生素，殺滅消化道病原菌，達到防病促生長的作用，而且還可作為飼料的防腐劑使用，便于 飼料儲存。目前，已有在畢赤酵母中表達果蠅Cecropin B的報道。但畢赤酵母表達異源蛋白 需甲醇誘導，殘留的甲醇可能帶來毒害作用。釀酒酵母是美國食品和藥品管理局公布的可 用作飼料添加劑且對人畜無害的唯一酵母類微生物。釀酒酵母有成熟的異源基因表達系 統(tǒng)，本身還是高蛋白飼料，酵母細胞壁還是一種免疫促進劑。因此，釀酒酵母更適合用來生 產(chǎn)Cecropins作為飼料添加劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種抗菌肽天蠶素飼料添加劑的制備方法。一種抗菌肽天蠶素飼料添加劑的制備方法，步驟如下(1)將抗菌肽天蠶素基因(如SEQ ID N0. 14所示)和多拷貝整合表達載體(如 SEQ IDN0. 1所示)分別用Not I酶切，然后用DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化Ε. coli T0P10菌株， 涂布LB (100 μ g/mL氨芐青霉素)平板，利用Not I進行酶切驗證，經(jīng)分析測序，選取反向插 入cecAl片段的轉(zhuǎn)化子命名為pYIP-cecAl ；(2)將步驟(1)制得的pYIP-cecAl用Hpa I酶切，回收大片段后，加入到80 μ L酵 母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，將混合物電擊后，經(jīng)G418的YEPD平板的篩選，獲得表達天蠶素的酵母細胞；(3)培養(yǎng)步驟(2)制得的表達天蠶素的酵母細胞，經(jīng)干燥，制得天蠶素飼料添加 劑。上述步驟(2)中電轉(zhuǎn)化的電擊時間為3. 5 4. Oms0上述步驟(3)中的培養(yǎng)條件在無選擇壓力的YEPD培養(yǎng)基中28 30°C培養(yǎng)2 3天。上述步驟(2)中的酵母為具有絮凝性的野生型釀酒酵母ABXL-1D，菌種購自美國 ATCC公司。所述的多拷貝整合表達載體的制備方法可參見中國專利申請?zhí)枮?"201010531234. 0”，發(fā)明名稱為“一種多拷貝整合表達載體及其制備方法與在表達牛乳鐵 蛋白中的應用的申請中的記載”。釀酒酵母對人類無毒，被食品和藥物管理局(FDA)確認為無害表達系統(tǒng)，表達產(chǎn) 物可直接作為飼料添加劑應用，并且釀酒酵母的細胞壁成分β _1，3葡聚糖也是一種免疫 增強劑。故本發(fā)明利用強絮凝型釀酒酵母組成型表達天蠶素，在工業(yè)生產(chǎn)中不需要分離工 藝，復雜的蛋白純化工藝，利用成本較低的發(fā)酵培養(yǎng)基即可進行發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵完畢后收集 酵母，即可直接制成酵母干粉制劑作為飼料添加劑應用。為了降低重組天蠶素的生產(chǎn)成本，簡化生產(chǎn)工藝，本研究選擇具有絮凝性的野生 型釀酒酵母ABXL-ID整合表達天蠶素，但是目前商品化的釀酒酵母整合表達載體大都利用 營養(yǎng)缺陷型標記作為篩選標記和整合位點，需要營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母作為宿主，并且整合 后得到的拷貝數(shù)較低，不適合進行工業(yè)化生產(chǎn)。有研究表明，釀酒酵母的rDNA基因也可作 為整合位點，并且可使重組蛋白基因的拷貝數(shù)提高到50或50以上。本發(fā)明構建含有rDNA 作為整合位點，G418抗性為篩選標記，酵母強組成型表達啟動子PGK為啟動子的新型釀酒 酵母多拷貝整合表達載體。另外，Cecropins有較強的抗菌活性，并且其抗菌機制不同于 抗生素，不宜產(chǎn)生耐藥菌，其本身又是小肽，最終在體內(nèi)會被降解掉，安全無殘留。另外， Cecropins的熱穩(wěn)定性非常好，在沸水處理30min其抗菌活性保持不變，非常適用作為青貯 飼料的加工過程中的防腐劑。有益效果1、本發(fā)明所述的多拷貝整合表達載體以YIPlac204質(zhì)粒為骨架，PGK為啟動子， G418抗性為篩選標記，rDNA為整合位點，是適用于工業(yè)化生產(chǎn)使用的酵母多拷貝整合型表 達載體。2、本發(fā)明采用強絮凝性的野生型釀酒酵母作為重組蛋白的宿主菌，并成功表達重 組天蠶素。強絮凝性的釀酒酵母菌在工業(yè)化生產(chǎn)時，能使分散在培養(yǎng)液中的酵母細胞相互 聚集發(fā)生凝集，形成絮凝顆粒并沉降，從而有利于酵母細胞同培養(yǎng)液的有效分離，可大大簡 化生產(chǎn)工藝，降低成本。3、本發(fā)明采用組成型強啟動子PGK高效啟動重組蛋白的表達，提高了重組的表達 率和減去工業(yè)化生產(chǎn)時補料控制工藝，簡化了操作。4、本發(fā)明首次利用野生型釀酒酵母成功表達抗菌肽天蠶素，并且利用生物安全性 較高的多拷貝整合表達載體提高天蠶素在釀酒酵母基因組中的拷貝數(shù)從而提高天蠶素在 釀酒酵母中的表達效率，重組天蠶素不需純化就可直接作為飼料添加劑應用。利用該重組天蠶素釀酒酵母工程菌進行天蠶素的發(fā)酵生產(chǎn)，降低天蠶素的生產(chǎn)成本，從而為推廣天蠶 素作為飼料添加劑成為飼用抗生素替代品打下良好基礎。


圖ICecropinAl mRNA序列同根據(jù)其氨基酸序列設計的CecropinAl人工合成序列 的比對圖；圖 2pHP-cecAl 菌液 PCR 驗證其中泳道1 :pYIP-cecAl 菌液 PCR 驗證；泳道 2 :DL2000 Marker圖3釀酒酵母轉(zhuǎn)化子菌液PCR驗證；其中1泳道:S. cerevisiae ABXL-ID 菌液 PCR 結果，2 泳道S. cerevisiae ABXL-ID重組cecAl轉(zhuǎn)化子菌液PCR結果，3泳道:DL2000 Marker ；圖4重組轉(zhuǎn)化子SDS-PAGE檢測蛋白表達情況；其中1泳道1. CecropinAl轉(zhuǎn)化釀酒酵母ABXL-1D的轉(zhuǎn)化子，2泳道小分子量蛋 白Marker，3泳道對照釀酒酵母ABXL-1D。圖中箭頭所指為重組CecropinAl條帶。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發(fā)明的內(nèi)容做進一步的說明，但本發(fā)明所保護范圍不 限于此；質(zhì)粒pPIC9K購自Invitrogen公司，質(zhì)粒pUC57-cecAl是金思特生物科技有限公 司對cecAl進行人工合成后將其插入pUC57中得到的。實施例1抗菌肽天蠶素基因的獲得釀酒酵母和果蠅的密碼子偏愛性存在較大差異，為了使果蠅抗菌肽cecropin基 因能在釀酒酵母中得到比較高效的表達，因此根據(jù)釀酒酵母密碼子偏愛性表，將從NCBI上 查到的果蠅抗菌肽cecropinAl氨基酸序列轉(zhuǎn)換成適合在釀酒酵母中表達的核酸序列，同 時還要考慮整個核酸序列的GC含量、二級結構等問題，避免翻譯過程提前終止。CecropinAl mRNA序列同根據(jù)其氨基酸序列設計的CecropinAl人工合成序列的比對見圖1。將設計好的序列如SEQ ID N0. 14所示的Cecropin Al核酸序列(cecAl)兩端引 入Not I酶切位點后，交由金思特生物科技有限公司進行人工合成。該公司將合成好的片 段插入PUC57中，并進行測序，測序結果反饋序列合成無誤。實施例2多拷貝整合表達載體的構建(I)載體骨架pYB-1的構建(i)Bgl片段的擴增以YIPlac204為模板，引物bl和b2為引物，利用PCR技術擴 增Bgl片段并在其兩端分別引入Aat ILEcoR I和Bgl II酶切位點。引物序列如下下劃 線部分為Bgl II的識別位點，陰影部分為Aat II的識別位點，框架中的序列為EcoR I的 識別位點。引物 bl :5，GACGTC AGATCTATTCTTGCCACGACTCATCTCC 3，； (SEQ ID N0. 2)
弓i物 b2 :5，|gAATTC[ AGATCTGATTCCGATGCTGACTTGCTG 3，； (SEQ id NO. 3)PCR 反應條件為 94°C 2min,94°C 30sec,60°C 30sec，72°C 30sec，循環(huán)重復 34 次， 72°C IOmin0 PCR得到280bp大小的DNA片段，將該片段純化回收后同pGM_T載體連接，轉(zhuǎn) 化E. coli T0P10菌株，涂布含IPTG和X-gal的LB (100 μ g/mL氨芐青霉素)平板上，進行 藍白斑篩選挑取白色菌落，搖菌過夜后進行菌液PCR(以菌液為模板，T7和SP6通用引物為 引物)得到約460bp大小片段，即280bp的Bgl片段再加上載體上T7和SP6引物結合位點 間約ISObp的距離。這與預期相符，說明Bgl片段已經(jīng)同T載體連接成功。(ii)Bgl片段和YIPlac204的連接將Bgl片段用Aat II和EcoR I從T載體上酶 切下來，切膠回收。載體YIPlac204上有Aat II和EcoR I的酶切位點，將該載體用Aat II和 EcoR I雙酶切后，回收大片段，并將其同酶切過的Bgl片段連接，連接液轉(zhuǎn)化E. coliTOPlO 菌株，涂布LB (100 μ g/mL氨芐青霉素)平板。挑取若干轉(zhuǎn)化子進行小量質(zhì)粒制備后，用Bgl II酶切進行驗證，得到大小約為2. 2kb的大片段和256bp的小片段。同預期相符，說明Bgl 片段成功同YIPlac204的片段連接成為表達載體的骨架，將其命名為pYB_l。(ii)啟動子終止子元件的插入1. 8kb PGK啟動子和終止子片段(PGKp+t)以質(zhì)粒pMA91為模板，利用高保真PCR 聚合酶primeSTAR進行PCR擴增得到，反應條件為98°C 10sec，61°C 15sec，72°C 120sec，循 環(huán)重復34次，72°C lOmin，引物均引入BamH I酶切位點(下劃線)，pgkl CGCGGATCCAAGCTTTCTAACTGATCTATC(SEQ ID NO. 4)禾口pgk2 :CGCGGATCCCTTTAACGAACGCAGAATTTTGGAG (SEQ ID NO. 5)，反應產(chǎn)物大小約為 1836bp。將PCR產(chǎn)物回收后進行末端加A尾反應，然后再同pGM-T連接，連接液轉(zhuǎn)化E. coli T0P10菌株，涂布含IPTG和X-gal的LB (100 μ g/mL氨芐青霉素)平板上，進行藍白斑篩選 挑取若干白色菌落，小量制備質(zhì)粒后用EcoR I進行酶切驗證，得到約3051bp的T載體片段 和約1836bp的PGKp+t片段，同預期相符說明該片段已插入T載體中。將篩選出的轉(zhuǎn)化子 送去測序，測序結果經(jīng)過序列比對分析，表明PGKp+t片段序列同pMA91質(zhì)粒上的PGKp+t相 同。利用BamH I和Bgl II為同尾酶的特點，將用BamH I從T載體酶切下來，切膠回 收得到的PGKp+t片段同用Bgl II單酶切pYB-1，切膠回收得到的片段連接，連接液轉(zhuǎn)化 E.COliT0P10菌株，涂布LB(100μg/mL氨芐青霉素)平板。挑取若干轉(zhuǎn)化子進行小量質(zhì)粒 制備后，利用Hind III進行酶切驗證。若PGKp+t片段正向插入pYB-1的Bgl II位點，則經(jīng) Hind III酶切后將得到一條電泳條帶，而反向插入則會出現(xiàn)兩條帶，大小分別約為2230bp 和1960bp。選取反向插入的轉(zhuǎn)化子將其命名為pYB-2。(III)整合位點rDNA單元的插入酵母基因組中高度重復的rDNA單元，是構建高拷貝整合表達載體同源重組區(qū)的 首選序列。每個rDNA單元長達9. Ikb左右，由5S、5. 8S、25S和18S rRNA的轉(zhuǎn)錄區(qū)及一些 非轉(zhuǎn)錄區(qū)組成。有研究表明，用于介導整合的rDNA區(qū)域，不應包含其RNA polymerase I的 起始轉(zhuǎn)錄區(qū)，同時整合于rDNA區(qū)域的外源片斷大小接近rDNA單元長度時，其在有絲分裂中 穩(wěn)定性最高。根據(jù)這一要求，對S.cerevisiae rDNA序列進行分析，確定所需2. 2kb片斷， 其在rDNA單元中的相對位置。該片段含有質(zhì)粒用于線性轉(zhuǎn)化的Hpa I單酶切位點。
為了減少能賦予細菌氨芐青霉素抗性的β -內(nèi)酰胺酶編碼基因的擴散，增加重組 蛋白工程菌作為飼料添加劑的生物安全性，將選擇出的rDNA片段從Hpa I處分成兩段進行 PCR并克隆入pYB-2中，這樣就可以在轉(zhuǎn)化酵母時，利用Hpa I線性化載體從而去除β -內(nèi) 酰胺酶編碼基因Ampr。根據(jù)這兩段rDNA序列設計引物rDNAlF =CTGCAG TTTCCTCTGGC TTCACCCTATT (SEQ ID NO. 6)，rDNAIR CTGCAGi CCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCT (SEQ ID NO. 7),rDNA2F GACGTCACCTAAAACGACCGTACTTGCAT (SEQ ID NO. 8)，rDNA2R GACGTC GAAACTCACCAGGTCCAGACACA (SEQ ID NO. 9)，引物均引進酶切位點(Aat II下劃線，Pst I陰影)。以釀酒酵母ABXL-1D染色 體為模板，上述引物為上下游引物進行PCR擴增rDNAl和rDNA2片段。PCR反應條件為 950C 5min,94°C 30sec,61°C 30sec,72°C lOOsec，循環(huán)重復 34 次，72°C IOmin0 PCR 反應產(chǎn) 物rDNAl和rDNA2的大小分別約為1134bp禾Π 1216bp。將rDNA2和pYB_2用Aat II酶切， 切膠純化回收片段后連接，連接液轉(zhuǎn)化E. coli T0P10菌株，涂布LB (100 μ g/mL氨芐青霉 素)平板。挑取若干轉(zhuǎn)化子進行小量質(zhì)粒制備后，利用Hind III和Hpa I進行酶切驗證， 酶切后產(chǎn)生三條帶，大小分別約為2156bp，1856bp和960bp的轉(zhuǎn)化子為rDNA2片段反向插 入pYB-2的轉(zhuǎn)化子，將其命名為pYB-3。將pYB-3和rDNAl用Pst I酶切，切膠純化回收片段后連接，連接液轉(zhuǎn)化E. coli T0P10菌株，涂布LB (100 μ g/ml氨芐青霉素)平板。挑取若干轉(zhuǎn)化子進行小量質(zhì)粒制備后， 利用Hpa I進行酶切驗證，酶切后產(chǎn)生兩條帶，大小分別約為4089bp和2450bp的轉(zhuǎn)化子為 rDNAl片段反向插入pYB-3的轉(zhuǎn)化子，將其命名為pYB_4。(IV) pYB-5 的構建由于G418抗性基因中含有Bgl II位點，因此，PGKp+t片段中的克隆位點Bgl II 則不可用，需要另換克隆位點。經(jīng)過序列分析后，得知載體和cecAl上不存在Not I位點， 并且Not I在基因組中出現(xiàn)頻率低，故將PGKp+t片段的Bgl II位點置換成Not I位點。 用于置換酶切位點的Not片段通過PCR得到，該PCR以YIPlac204為模板，兩端引入BamH 1(下劃線)和Not I位點(陰影)的notF :CGCGGATCC (iaiCCCCiC ATTCTTGCCACGACTCATCTCC (SEQ ID NO. 10)禾口notR :CGCGGATCC (;C(;(ia’(iG GATTCCGATGCTGACTTGCTG (SEQ ID NO. 11)為引物，條件為95°C2min,94°C 30sec,61°C 30sec，72°C 30sec，循環(huán)重復 34 次， 72°C IOmin, PCR反應得到大小約為256bp的Not片段。將Not片段用BamHI酶切，pYB-4 用Bgl II酶切，純化回收后連接，連接液轉(zhuǎn)化E. coli T0P10菌株，涂布LB (100 μ g/mL氨芐 青霉素)平板。挑取若干轉(zhuǎn)化子進行小量質(zhì)粒制備后，利用Not I進行酶切驗證。挑選釋 放出約256bp的Not片段的轉(zhuǎn)化子，將其命名為pYB-5。(v)G418抗性基因的插入以質(zhì)粒pUG6為模板，利用高保真PCR聚合酶primeSTAR進行PCR擴增得到約 1. 4Kb 的 KanMX 基因，PCR 反應條件為 98°C 10sec，58°C 15sec，72°C 120sec，循環(huán)重復 34 次， 72°C lOmin，引物均引入BamH I酶切位點(下劃線)，引物序列為
kanF :GGATCCTAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGC (SEQ ID NO. 12)禾口kanR GGATCCATTAAGGGTTCTCGAGAGCTCG (SEQ ID NO. 13)，反應產(chǎn)物大小約為 1456bp。將PCR產(chǎn)物回收后進行末端加A尾反應，然后再同pGM-T連接，連接液轉(zhuǎn)化E. coli T0P10菌株，涂布含IPTG和X-gal的LB (100 μ g/mL氨芐青霉素)平板上，進行藍白斑篩選 挑取若干白色菌落，小量制備質(zhì)粒后用EcoR I進行酶切驗證，得到約3051bp的T載體片段 和約1472bp的KanMX片段，同預期相符說明該片段已插入T載體中。將篩選出的轉(zhuǎn)化子送 去測序，測序結果經(jīng)過序列比對分析，表明KanMX片段序列同pUG6質(zhì)粒上的KanMX序列相 同。將KanMX用BamH I從T載體酶切下來，切膠回收后同用Bgl II單酶切pYB_l，切 膠回收得到的片段連接，連接液轉(zhuǎn)化E. coli TOPlO菌株，涂布LB(100 μ g/mL氨芐青霉素) 平板。挑取若干轉(zhuǎn)化子進行小量質(zhì)粒制備后，利用Pst I進行酶切驗證。若KanMX正向插入 pYB-1的BamH I位點，則經(jīng)Pst I酶切后將得到三條電泳條帶，大小分別為276bp，1200bp 和6720bp。選取正向插入的轉(zhuǎn)化子將其命名為pYB-6(pYIP-6)。pYIP_6即為構建完畢的多 拷貝整合表達載體。其序列如SEQ ID NO. 1所示。實施例3抗菌肽天蠶素飼料添加劑的制備方法，步驟如下(I)cecAl表達載體的構建將實施例1制得的pUC57_cecAl和載體pYIP_6用Not I酶切，切膠回收相應的片段進行連接，連接液轉(zhuǎn)化E. coli T0P10菌株，涂布LB (100 μ g/mL 氨芐青霉素)平板。挑取若干轉(zhuǎn)化子，搖菌過夜后，以菌液為模板，進行菌液PCR，引物序列如下Pl :CAGATCATCAAGGAAGTA, SEQ ID NO. 15P2 CCTTACCTTCCAATAATTCC SEQ ID NO. 16反應條件為95°C2min ；94°C 30sec，54°C 30sec，72°C 30sec,循環(huán)重復 34 次； 72°C IOmin。得到約323bp大小片段(圖2)，即203bp的cecAl再加上載體上Pl和P2引物結 合位點間約120bp的距離。這與預期相符，說明cecAl已經(jīng)同pYIP_6載體連接成功。將 插入片段的幾個轉(zhuǎn)化子送去測序，分析測序結果將反向插入cecAl片段的轉(zhuǎn)化子命名為 pYIP-cecAl。(II)表達載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母ABXL-ID以及含多拷貝基因轉(zhuǎn)化子的篩選提取 pYIP-cecAl質(zhì)粒，用Hpa I酶切，切膠回收線性化質(zhì)粒。將回收得到的線性化質(zhì)粒加入到 80 μ L釀酒酵母ABXL-ID電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，將混合物加入0. Icm電擊杯中，選取酵母電擊 參數(shù)進行電擊。電擊完后，涂布含200 μ g/mL G418的YEPD平板，30°C倒置培養(yǎng)2天。經(jīng)過 梯度濃度G418平板篩選得到的轉(zhuǎn)化子為含高拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子。(III)重組天蠶素釀酒酵母工程菌的菌液PCR檢驗將步驟(II)挑選出來的含高 拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子和空白菌利用凍_煮_凍的方法制備模板，利用根據(jù)cecAl設計的引物進 行PCR驗證，引物序列如下Sense ATGAATTTCTATAATATTTT SEQ ID N0. 17Antisense TTAACCTCTTGCTGTAGCAG SEQ ID N0. 18
反應條件為94°C2min,94°C 30sec,60°C 30sec,72°C 30sec,循環(huán)重復 34 次， 72°C IOmin0取10 μ L PCR反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。轉(zhuǎn)化子PCR得到的片段大 約為204bp，符合引物同模板結合區(qū)域之間的距離，而沒有經(jīng)載體轉(zhuǎn)化的空白菌PCR沒有 得到條帶(圖3)，說明經(jīng)篩選得到的轉(zhuǎn)化子基因組中含有cecAl，pYIP-cecAl已經(jīng)整合入 S. cerevisiae ABXL-ID 基因組中。( IV ) Tricine SDS-PAGE檢測釀酒酵母胞內(nèi)表達重組cecAl情況接種轉(zhuǎn)化子于 50mLYEPD液體培養(yǎng)基中，30°C 200rpm振蕩培養(yǎng)48h后，取ImL菌液離心后，用ImL PBS洗滌 兩次后，用200 μ L PBS溶解沉淀后，加2 X上樣緩沖液混勻后，沸水浴IOmin。取20 μ L處 理液上樣SDS-PAGE(圖4)。由圖5可知，轉(zhuǎn)化子表達一種不在空白菌中表達的蛋白，大小約 為4. 6kD，同Cecropins分子量相符，說明Cecropins在釀酒酵母轉(zhuǎn)化子中成功表達，但表達 量比較低。
權利要求
1.一種抗菌肽天蠶素飼料添加劑的制備方法，步驟如下(1)將抗菌肽天蠶素基因和多拷貝整合表達載體分別用NotI酶切，然后用DNA連接酶 連接后，轉(zhuǎn)化E. coli TOPlO菌株，涂布LB平板，利用Not I進行酶切驗證，經(jīng)分析測序，選 取反向插入cecAl片段的轉(zhuǎn)化子命名為pYIP-cecAl ；(2)將步驟(1)制得的pYIP-cecAl用HpaI酶切，回收大片段后，加入到80 μ L酵母電 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，將混合物電擊后，經(jīng)G418的YEPD平板的篩選，獲得表達天蠶素的酵母細 胞；(3)培養(yǎng)步驟( 制得的表達天蠶素的酵母細胞，經(jīng)干燥，制得抗菌肽天蠶素飼料添加劑。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟O)中電轉(zhuǎn)化的電擊時間為 3. 5 ~ 4. Oms0
3.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，上述步驟(3)中的培養(yǎng)條件在無選擇 壓力的YEPD培養(yǎng)基中28 30°C培養(yǎng)2 3天。
4.如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，上述步驟(2)中的酵母為具有絮凝性的 野生型釀酒酵母ABXL-1D，菌種購自美國ATCC公司。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗菌肽天蠶素飼料添加劑的制備方法，屬于基因工程技術領域。包括如下步驟(1)將抗菌肽天蠶素基因和多拷貝整合表達載體分別用Not I酶切，然后用DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化E.coli TOP10菌株，涂布LB平板，利用Not I進行酶切驗證，選取反向插入cecA1片段的轉(zhuǎn)化子命名為pYIP-cecA1；(2)將步驟(1)制得的pYIP-cecA1用Hpa I酶切，回收大片段后，加入到80μL酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，將混合物電擊后，經(jīng)G418的YEPD平板的篩選，獲得表達天蠶素的酵母細胞；(3)培養(yǎng)步驟(2)制得的表達天蠶素的酵母細胞，經(jīng)干燥，制得天蠶素飼料添加劑。本發(fā)明可降低天蠶素的生產(chǎn)成本，從而為推廣天蠶素作為飼料添加劑成為飼用抗生素替代品打下良好基礎。
文檔編號C12R1/85GK102093998SQ20101058042
公開日2011年6月15日 申請日期2010年12月9日 優(yōu)先權日2010年12月9日
發(fā)明者劉增英, 孫冰玉, 張燕君 申請人:山東大學