專利名稱：一種人工誘導(dǎo)臭馬比木內(nèi)生菌合成喜樹(shù)堿的技術(shù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種合成喜樹(shù)堿的技術(shù)方法，尤其是一種人工誘導(dǎo)臭馬比木內(nèi)生菌合 成喜樹(shù)堿的技術(shù)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
喜樹(shù)堿(Camptothecin，CPT)是從中國(guó)特有的珙桐科植物喜樹(shù)中分離得到的一種 天然五環(huán)生物堿。喜樹(shù)堿是由Wall等于1966年首次從喜樹(shù)皮中提取出來(lái)，隨后人們的研 究又逐步分離出10-羥基喜樹(shù)堿、甲氧基喜樹(shù)堿、10-甲氧基喜樹(shù)堿等喜樹(shù)堿類似物。喜樹(shù) 堿通過(guò)嵌合抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I (Topo I)攻擊腫瘤細(xì)胞，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，是理 想的抗癌藥物。喜樹(shù)堿系列衍生物抗癌藥物是附加值極高的高技術(shù)產(chǎn)品，對(duì)胰腺癌、前列腺 癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、腸癌、子宮頸癌、胃癌和血液腫瘤等均有效，加之可以口服，且對(duì) 心、肺、肝、腎和神經(jīng)毒性較小，已成為世界抗腫瘤藥物市場(chǎng)上主要品種。喜樹(shù)堿的原料來(lái)源主要有兩種，一是喜樹(shù)，二是馬比木。從目前的研究情況和國(guó)內(nèi) 外的研究趨勢(shì)來(lái)看，喜樹(shù)堿及類似物主要是靠從喜樹(shù)中分離獲得，至今已從喜樹(shù)中分離出 來(lái)的30余種成分中，喜樹(shù)堿及其類似物已有10余種。喜樹(shù)堿及類似物的提取與分離主要是 利用這些物質(zhì)不溶于水而溶于乙醇、氯仿等有機(jī)劑等方面的特性，通過(guò)滲漉使其溶于這些 溶劑中，此后回收溶劑、結(jié)晶即可得到最終產(chǎn)品。但由于喜樹(shù)的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，通常要8-15 年才能結(jié)果，喜樹(shù)果中喜樹(shù)堿的最高含量也只萬(wàn)分之七左右。此外，由于喜樹(shù)主要分布在人 為活動(dòng)區(qū)，面臨以毀林開(kāi)田為目的的砍伐，優(yōu)良的野生喜樹(shù)資源較少，其相關(guān)的藥用研究和 開(kāi)發(fā)也受到一定限制。馬比木為茶茱萸科植物海桐假柴龍樹(shù)(Nothapodytes Pittosporoides (Oliv.) sleum.)的根皮，其含有喜樹(shù)堿(camptothecine)及喜樹(shù)堿的甲氧基衍生物，馬比木根莖中 所含喜樹(shù)堿的含量最高可達(dá)萬(wàn)分之十四，是喜樹(shù)堿的另一個(gè)原料主要來(lái)源。臭馬比木，名 稱青脆枝，學(xué)名為Nothapodytes ηimmoniana (Graham) MabIerley，原產(chǎn)地為蘭嶼，也屬于 茶茱萸科，分布我國(guó)于甘肅、湖北、湖南、廣東、海南、廣西、四川、貴州等地，臭馬比木全株含 有喜樹(shù)堿。據(jù)植物提取產(chǎn)業(yè)信息網(wǎng)了解，馬比木來(lái)源的99%喜樹(shù)堿價(jià)格要比喜樹(shù)來(lái)源的低 一萬(wàn)元左右，價(jià)格上的優(yōu)勢(shì)使馬比木成為了喜樹(shù)堿提取的另一個(gè)關(guān)注熱點(diǎn)。目前，喜樹(shù)堿的獲得途徑要有由植物中提取、生物合成、化學(xué)全合成。由植物中 提取喜樹(shù)堿的方法，主要是利用喜樹(shù)堿不溶于水而溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑的特性，通過(guò) 滲濾使其溶解于溶劑中，然后再回收溶劑、結(jié)晶得到喜樹(shù)堿產(chǎn)品。由于利用了有機(jī)溶劑，此 方法產(chǎn)生的環(huán)境污染較大，且提取步驟繁瑣、成本較高。喜樹(shù)堿的生物合成途徑來(lái)自單帖吲 哚生物堿途徑，吲哚生物堿的生物合成則來(lái)源于莽草酸途徑和甲羥戊酸途徑。生物技術(shù)為 傳統(tǒng)中藥研究提供了新的技術(shù)手段，但由于我國(guó)在這一方面研究的深度仍不夠，喜樹(shù)堿是 生物合成途徑中，酶的調(diào)節(jié)規(guī)律和酶基因的調(diào)控和相互作用仍是亟待解決的問(wèn)題。喜樹(shù)堿 的化學(xué)全合成方法基于喜樹(shù)堿的五環(huán)結(jié)構(gòu)，通過(guò)不同的建環(huán)方法進(jìn)行合成，例如拆分法、不 對(duì)稱氧化法等。多數(shù)的化學(xué)全合成方法存在路線過(guò)長(zhǎng)，總產(chǎn)率過(guò)低等不足，要得到產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用仍存有很大的改進(jìn)余地。植物內(nèi)生菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各種組 織和器官內(nèi)部或細(xì)胞間隙的真菌或細(xì)菌。植物內(nèi)生菌可通過(guò)自身的代謝產(chǎn)物或借助于信號(hào) 傳導(dǎo)作用對(duì)植物體產(chǎn)生影響，如內(nèi)生菌對(duì)植物的固氮作用、促進(jìn)植物生產(chǎn)的作用和增強(qiáng)宿 主植物抗逆境、抗病蟲害等作用。由于內(nèi)生菌分布在宿主植物組織內(nèi)部，比暴露于外部環(huán)境 的附生菌和腐生菌具有更加穩(wěn)定的生存環(huán)境，更易于發(fā)揮作用，且植物內(nèi)生菌具有一定的 宿主專一性，因此具有優(yōu)良的開(kāi)發(fā)特性。隨著人們對(duì)喜樹(shù)堿類抗癌藥物需求的增加，單純靠從喜樹(shù)中提取喜樹(shù)堿已經(jīng)無(wú)法 滿足人們的需求，同時(shí)也會(huì)造成資源的浪費(fèi)和環(huán)境的破壞。利用植物組織培養(yǎng)的方法是一 種有效的手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人工誘導(dǎo)臭馬比木內(nèi)生菌合成喜樹(shù)堿的技術(shù)方法，該方 法通過(guò)將臭馬比木未成熟的細(xì)胞置于添加了一定濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)，在細(xì)胞 指數(shù)生長(zhǎng)初期，加入誘導(dǎo)劑和糖，然后在細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)中期，再加入誘導(dǎo)劑，采用人工的方 式，誘導(dǎo)臭馬比木內(nèi)生菌合成喜樹(shù)堿。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是將臭馬比木未成熟的細(xì)胞按照接種量為5(T200g/L 濕重的比例，置于添加了 5(Γ80 μ mol/L濃度的萘乙酸(NAA)或5-10 μ mol/L濃度的芐氨基 嘌呤(BA)的培養(yǎng)基中，在25-30°C中培養(yǎng)；在細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)初期，加入濃度為1-2000 μ mol/ L的誘導(dǎo)劑和20-50g/L的糖；在細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)中期，再加入濃度為1-2000 μ mol/L的非生 物誘導(dǎo)劑。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于
(1)利用富含喜樹(shù)堿的植物臭馬比木，通過(guò)人工誘導(dǎo)，組織培養(yǎng)的方法實(shí)現(xiàn)喜樹(shù)堿的合 成，利用了內(nèi)生菌易培養(yǎng)、易控制和生長(zhǎng)快等特點(diǎn)，可以獲得生理活性與植物來(lái)源一致的喜 樹(shù)堿；
(2)本發(fā)明的培養(yǎng)條件可以使細(xì)胞快速、良好地生長(zhǎng)，并具有均一性；
(3)本發(fā)明的方法可提高喜樹(shù)堿的產(chǎn)量；
(4)隨著人們對(duì)喜樹(shù)堿類抗癌藥物需求的增加，單純靠從喜樹(shù)中提取喜樹(shù)堿已經(jīng)無(wú)法 滿足人們的需求，同時(shí)也會(huì)造成資源的浪費(fèi)和環(huán)境的破壞。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，這些實(shí)施例僅用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，并 不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1
(1)培養(yǎng)基制備MS基本培養(yǎng)基中添加50μ mol/L濃度的萘乙酸(NAA)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑；
(2)接種培養(yǎng)將臭馬比木未成熟的細(xì)胞按照接種量為100g/L濕重的比例，置于25°C 搖床，轉(zhuǎn)速80rpm，暗培養(yǎng)；
(3)聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中利用誘導(dǎo)劑培養(yǎng)，在接種培養(yǎng)基后5天，加入濃度為 300 μ mol/L的誘導(dǎo)劑，并補(bǔ)糖30g/L ；接種培養(yǎng)基后10天，再加入濃度為500 μ mol/L的非生物誘導(dǎo)劑；
(4)提取由獲得的培養(yǎng)物分離，提取細(xì)胞部分和吸附部分的喜樹(shù)堿。獲得的生產(chǎn)率最 為 68. 58mg/(L · d)，最高產(chǎn)量為 1289. 24mg/L0實(shí)施例2
(1)培養(yǎng)基制備MS基本培養(yǎng)基中添加65ymol/L濃度的萘乙酸(NAA)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑；
(2)接種培養(yǎng)將臭馬比木未成熟的細(xì)胞按照接種量為100g/L濕重的比例，置于25°C 搖床，轉(zhuǎn)速lOOrpm，暗培養(yǎng)；
(3)聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中利用誘導(dǎo)劑培養(yǎng)，在接種培養(yǎng)基后7天，加入濃度為 600 μ mol/L的誘導(dǎo)劑，并補(bǔ)糖30g/L ；接種培養(yǎng)基后10天，再加入濃度為1000 μ mol/L的非 生物誘導(dǎo)劑；
(4)提取由獲得的培養(yǎng)物分離，提取細(xì)胞部分和吸附部分的喜樹(shù)堿。獲得的生產(chǎn)率最 為 72. 95mg/(L · d)，最高產(chǎn)量為 1301. 59mg/L。實(shí)施例3
(1)培養(yǎng)基制備MS基本培養(yǎng)基中添加80μ mol/L濃度的萘乙酸(NAA)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑；
(2)接種培養(yǎng)將臭馬比木未成熟的細(xì)胞按照接種量為150g/L濕重的比例，置于25°C 搖床，轉(zhuǎn)速lOOrpm，暗培養(yǎng)；
(3)聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中利用誘導(dǎo)劑培養(yǎng)，在接種培養(yǎng)基后7天，加入濃度為 600 μ mol/L的誘導(dǎo)劑，并補(bǔ)糖40g/L ；接種培養(yǎng)基后15天，再加入濃度為1200 μ mol/L的非 生物誘導(dǎo)劑；
(4)提取由獲得的培養(yǎng)物分離，提取細(xì)胞部分和吸附部分的喜樹(shù)堿。獲得的生產(chǎn)率最 為 76. 02mg/ (L · d)，最高產(chǎn)量為 1272. 06mg/L。實(shí)施例4
(1)培養(yǎng)基制備MS基本培養(yǎng)基中添加5μ mol/L濃度的芐氨基嘌呤(BA)；
(2)接種培養(yǎng)將臭馬比木未成熟的細(xì)胞按照接種量為100g/L濕重的比例，置于25°C 搖床，轉(zhuǎn)速80rpm，暗培養(yǎng)；
(3)聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中利用誘導(dǎo)劑培養(yǎng)，在接種培養(yǎng)基后5天，加入濃度為 300 μ mol/L的誘導(dǎo)劑，并補(bǔ)糖30g/L ；接種培養(yǎng)基后10天，再加入濃度為500 μ mol/L的非 生物誘導(dǎo)劑；
(4)提取由獲得的培養(yǎng)物分離，提取細(xì)胞部分和吸附部分的喜樹(shù)堿。獲得的生產(chǎn)率最 高可達(dá)59. 4lmg/ (L · d)，最高產(chǎn)量可達(dá)到945. 58mg/L。
權(quán)利要求
1.一種人工誘導(dǎo)臭馬比木內(nèi)生菌合成喜樹(shù)堿的技術(shù)方法，其特征在于由以下步 驟組成將臭馬比木未成熟的細(xì)胞按照接種量為5(T200g/L濕重的比例，置于添加了 一定濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中，在25 30°C中培養(yǎng)；在細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)初期，加入濃 度為HOOOymol/L的誘導(dǎo)劑和2(T50g/L的糖；在細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)中期，再加入濃度為 1 2000ymol/L的誘導(dǎo)劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為萘乙酸(NAA)或芐氨 基嘌呤(BA)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，其特征在于生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑萘乙酸(NAA)或芐氨基 嘌呤(BA)的濃度分別為50 80 μ mol/L和5 10 μ mol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的誘導(dǎo)劑為硝酸銀和水楊酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的糖為蔗糖或葡萄糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)初期為接種培養(yǎng)基后 的5 10天；所述細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)中期為接種培養(yǎng)基后的1(Γ20天。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人工誘導(dǎo)臭馬比木內(nèi)生菌合成喜樹(shù)堿的技術(shù)方法。本發(fā)明的方法由以下步驟組成將臭馬比木未成熟的細(xì)胞按照接種量為50~200g/L濕重的比例，置于添加了50~80μmol/L的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑萘乙酸(NAA)或5~10μmol/L芐氨基嘌呤(BA)的MS基本培養(yǎng)基中，在25~30℃中培養(yǎng)；在細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)初期，加入濃度為1~2000μmol/L的非生物誘導(dǎo)劑和20~50g/L的蔗糖或葡萄糖；在細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)中期，再加入濃度為1~2000μmol/L的非生物誘導(dǎo)劑。本發(fā)明利用了富含喜樹(shù)堿的植物臭馬比木，通過(guò)人工誘導(dǎo)，組織培養(yǎng)的方法實(shí)現(xiàn)喜樹(shù)堿的合成，在一定程度上可提高喜樹(shù)堿的產(chǎn)量，本發(fā)明的培養(yǎng)條件可以使細(xì)胞快速、良好地生長(zhǎng)，并具有均一性。
文檔編號(hào)C12P17/18GK102071233SQ201010574700
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月6日
發(fā)明者張?jiān)方?申請(qǐng)人:張?jiān)方?br>