專利名稱：一種人工誘導臭馬比木內生菌合成喜樹堿糖衍生物的技術方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種合成喜樹堿衍生物的技術方法，尤其是一種人工誘導臭馬比木內 生菌合成喜樹堿糖衍生物的技術方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
喜樹堿(camptothecimCPT)是從珙桐科植物喜樹中分離得到的一種天然生物堿。 喜樹堿及其衍生物具有獨特的作用機制——唯一具有選擇性抑制DNA拓撲異構酶I (Topo I )，因此近20多年來成為了抗腫瘤藥物研究的熱點之一。由于喜樹堿的水溶性和脂溶 性均較差，其鈉鹽的抗癌活性較低，臨床應用收到了嚴格限制。其后人們從喜樹中分離出 10-羥基喜樹堿，合成了毒性小、抗腫瘤作用更強的喜樹堿衍生物，在腫瘤防治中起到了重 大作用。目前已經應用于臨床的喜樹堿類衍生物，例如于1994年在日本批準上市用于治療 結腸直腸腫瘤伊立替康(Irin0tecan)、1996年美國FDA批準上市的拓撲替康(Topotecan) 和2004年韓國批準上市的貝諾替康等，相關的藥理實驗證明，其他一些喜樹堿類衍生物在 臨床上顯示了良好的抗腫瘤活性。喜樹堿衍生物天然存在于喜樹堿中的含量非常低，因此目前主要是以喜樹堿為原 料經過生物轉化法、化學全合成以及化學半合成的方法來獲得?；瘜W全合成的方法由于反 應步驟過多，合成總收率低，成本高，而無法實現(xiàn)產業(yè)化。而一些生物合成的方法雖然具有 一定的經濟效益，但仍存在轉化率較低、菌株培養(yǎng)技術要求高，分離步驟多等缺點，因此其 發(fā)展受到了限制。由于植物內生菌分布廣，種類多，且易培養(yǎng)、易控制和生長快等特點，還可 以產生具有生物活性的代謝產物，因此，通過人工的方式，誘導植物內生菌合成喜樹堿衍生 物，可作為喜樹堿及其衍生物這一類抗癌成分的合成途徑，為喜樹堿及其抗癌作用、抗癌藥 物的研究提供參考。臭馬比木今年來是除了喜樹之外的喜樹堿的另一主要來源，因其全樹富含喜樹 堿而引起了關注，已有開展相關研究，如專利“從馬比木分離的喜樹堿骨架化合物及其作 為新藥物及治療劑的合成子的用途”(ZL97194492. X)、“從臭馬比木中提取喜樹堿的方法” (200810028740. 0)、《喜樹與喜樹堿開發(fā)利用進展》馮建燦等，《林業(yè)科學》，2000年，36卷第 5期)等，但鮮見通過人工誘導臭馬比木內生菌合成喜樹堿及其衍生物的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種人工誘導臭馬比木內生菌合成喜樹堿糖衍生物的技術 方法，該方法通過將臭馬比木未成熟的細胞按照一定比例，置于特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在細胞 指數(shù)生長初期，加入組合誘導子和糖，再加入糖化試劑和催化劑，進行糖化反應，最后在細 胞指數(shù)生長中期，再加入組合誘導子對臭馬比木內生菌進行誘導，實現(xiàn)喜樹堿糖衍生物的 合成。本發(fā)明所采用的技術方案是(1)制備擴增培養(yǎng)基，即在MS基本培養(yǎng)基的基礎上添加萘乙酸5(Γ80μ mol/L、6-芐氨 基嘌呤5 ΙΟμπιοΙ/L、蔗糖或葡萄糖3(T50g/L、瓊脂1. 5 2g/L ；pH5. 5 6 ；將臭馬比木未成熟 的細胞按照接種量為5(T200g/L濕重的比例，置于擴增培養(yǎng)基中，在25 30°C中培養(yǎng)；
(2)制備組合誘導子由0.02、. 04mol臭馬比木內生菌誘導子、6(T80g/L水楊酸， 20^60過氧化氫和8(Γ100 μ mol/L甲基茉莉酮酸組成；
(3)誘導培養(yǎng)在細胞指數(shù)生長初期，加入濃度為廣2000μ mol/L的組合誘導子和 2(T50g/L的糖；加入糖化試劑和催化劑，進行糖化反應；在細胞指數(shù)生長中期，再加入濃度 為廣2000 μ mol/L的組合誘導子進行誘導。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術的優(yōu)點在于采用人工誘導的方式，利用產喜樹堿植物臭 馬比木內生菌的特性，實現(xiàn)喜樹堿衍生物的合成，可解決目前一些生物合成的方法仍存在 轉化率較低、菌株培養(yǎng)技術要求高，分離步驟多等問題，可為喜樹堿及其抗癌作用、抗癌藥 物的研究提供參考。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發(fā)明，并 不限制本發(fā)明的范圍。實施例1
(1)培養(yǎng)基制備僅5基本培養(yǎng)基中添加萘乙酸5(^!1101/1、6-芐氨基嘌呤5411101/1、蔗 糖或葡萄糖30g/L、瓊脂1. 5g/L ；pH5. 5 6 ；
(2)接種培養(yǎng)將臭馬比木未成熟的細胞按照接種量為100g/L濕重的比例，置于25°C 搖床，轉速80rpm，暗培養(yǎng)；
(3)組合誘導子由0.02mol臭馬比木內生菌誘導子、60g/L水楊酸，20μ1/L過氧化氫 和80 μ mol/L甲基茉莉酮酸組成；
(4)聯(lián)合誘導、糖化反應培養(yǎng)過程中利用誘導劑培養(yǎng)，在接種培養(yǎng)基后5天，加入濃 度為300 μ mol/L的誘導子，并補糖30g/L ；加入3g/L全乙酰溴代半乳糖，15 μ l/LBu4NBr ；接 種培養(yǎng)基后10天，再加入濃度為500 μ mol/L的組合誘導子；
(5)提取由獲得的培養(yǎng)物分離，提取，獲得的生產率最為34. 38mg/(L · d)，最高產量 為 826. 18mg/L。實施例2
(1)培養(yǎng)基制備僅5基本培養(yǎng)基中添加萘乙酸5(^!1101/1、6-芐氨基嘌呤5411101/1、蔗 糖或葡萄糖30g/L、瓊脂1. 5g/L ；pH5. 5 6 ；
(2)接種培養(yǎng)將臭馬比木未成熟的細胞按照接種量為100g/L濕重的比例，置于25°C 搖床，轉速lOOrpm，暗培養(yǎng)；
(3)組合誘導子由0.02mol臭馬比木內生菌誘導子、60g/L水楊酸，20μ1/L過氧化氫 和80 μ mol/L甲基茉莉酮酸組成；
(4)聯(lián)合誘導、糖化反應培養(yǎng)過程中利用誘導劑培養(yǎng)，在接種培養(yǎng)基后7天，加入濃 度為600 μ mol/L的誘導劑，并補糖30g/L ；加入6g/L全乙酰溴代半乳糖，15 μ l/LBu4NBr接 種培養(yǎng)基后10天，再加入濃度為1000 μ mol/L的組合誘導子；
(5)提取由獲得的培養(yǎng)物分離，提取，獲得的生產率最為38.48mg/(L· d)，最高產量為 958. 20mg/L。
實施例3
(1)培養(yǎng)基制備MS基本培養(yǎng)基中添加萘乙酸80ymol/L、6-芐氨基嘌呤5ymol/L、蔗 糖或葡萄糖30g/L、瓊脂1. 5g/L ；pH5. 5 6 ；
(2)接種培養(yǎng)將臭馬比木未成熟的細胞按照接種量為100g/L濕重的比例，置于25°C 搖床，轉速80rpm，暗培養(yǎng)；
(3)組合誘導子由0.03mol臭馬比木內生菌誘導子、70g/L水楊酸，20μ1/L過氧化氫 和80 μ mol/L甲基茉莉酮酸組成；
(4)聯(lián)合誘導、糖化反應培養(yǎng)過程中利用誘導劑培養(yǎng)，在接種培養(yǎng)基后5天，加入濃 度為300 μ mol/L的誘導劑，并補糖30g/L ；；加入12g/L全乙酰溴代半乳糖，15 μ l/LBu4NBr ； 接種培養(yǎng)基后10天，再加入濃度為500 μ mol/L的組合誘導子；
(5)提取由獲得的培養(yǎng)物分離，提取細胞部分和吸附部分的喜樹堿。獲得的生產率最 高可達45. 29mg/ (L · d)，最高產量可達到1015. 0mg/L。
權利要求
1.一種人工誘導臭馬比木內生菌合成喜樹堿糖衍生物的技術方法，其特征在于由以下 步驟組成將臭馬比木未成熟的細胞按照接種量為5(T200g/L濕重的比例，置于擴增培養(yǎng) 基中，在25 30°C中培養(yǎng)；在細胞指數(shù)生長初期，加入濃度為廣2000ymol/L的組合誘導子 和2(T50g/L的糖；加入糖化試劑和催化劑，進行糖化反應；在細胞指數(shù)生長中期，再加入濃 度為廣2000 μ mol/L的組合誘導子進行誘導。
2.根據(jù)權利要求1所述的生長調節(jié)劑，其特征在于所述的擴增培養(yǎng)基為MS基本培 養(yǎng)基的基礎上添加了萘乙酸5(Γ80 μ mol/L、6-芐氨基嘌呤5 10 μ mol/L、蔗糖或葡萄糖 30 50g/L、瓊月旨 1. 5 2g/L ；ρΗ5· 5 6。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的組合誘導子由0.02、. 04mol臭馬比 木內生菌誘導子、6(T80g/L水楊酸，2(Γ60過氧化氫和8(Γ 00μπιΟ1/1甲基茉莉酮酸組成。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的糖化試劑為3 12g/L全乙酰溴代半 乳糖，所述催化劑為15 30μ1/ Βιι4ΝΒι·。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的糖為蔗糖或葡萄糖。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的細胞指數(shù)生長初期為接種培養(yǎng)基后 的5 10天；所述細胞指數(shù)生長中期為接種培養(yǎng)基后的1(Γ20天。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人工誘導臭馬比木內生菌合成喜樹堿糖衍生物的技術方法。本發(fā)明的方法由以下步驟組成將臭馬比木未成熟的細胞按照接種量為50~200g/L濕重的比例，置于擴增培養(yǎng)基中，在25~30℃中培養(yǎng)；在細胞指數(shù)生長初期，加入濃度為1~2000μmol/L的組合誘導子和20~50g/L的糖；加入糖化試劑和催化劑，進行糖化反應；在細胞指數(shù)生長中期，再加入濃度為1~2000μmol/L的組合誘導子進行誘導。本發(fā)明的方法采用人工誘導的方式，利用產喜樹堿植物臭馬比木內生菌的特性，實現(xiàn)喜樹堿衍生物的合成，可解決目前一些生物合成的方法仍存在轉化率較低、菌株培養(yǎng)技術要求高，分離步驟多等問題，可為喜樹堿及其抗癌作用、抗癌藥物的研究提供參考。
文檔編號C12P17/18GK102080110SQ20101057462
公開日2011年6月1日 申請日期2010年12月6日 優(yōu)先權日2010年12月6日
發(fā)明者張苑金 申請人:張苑金