專利名稱：微生物來源的炎癥因子受體拮抗劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物來源的炎癥因子受體拮抗劑及其制備方法，其中所述炎癥因子 受體拮抗活性劑為一種腫瘤壞死因子受體(TNFR)拮抗劑A，其包括Al和A2兩種形式。本 發(fā)明還涉及一種產(chǎn)生所述腫瘤壞死因子受體拮抗劑A的球孢白僵菌Al。本發(fā)明還涉及所述 腫瘤壞死因子受體(TNFR)拮抗劑A用于制備治療與天然腫瘤壞死因子受體配基過量相關(guān) 疾病的藥物的用途。
背景技術(shù)：
炎癥是機體對各種損傷的反應(yīng)，細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)加重、修復(fù)和慢性化上均起 重要作用。已知腫瘤壞死因子(TNF)是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)。腫瘤壞死因子通過與細(xì)胞表 面的受體結(jié)合，由信號傳導(dǎo)系統(tǒng)將信息傳入細(xì)胞內(nèi)而發(fā)揮其生物學(xué)活性。腫瘤壞死因子有兩種受體，其基因已被分離純化，闡明了結(jié)構(gòu)。已知這兩種受體蛋 白質(zhì)分子量分別為55Kd和75kD，分別稱為P55R(TNFR I)和P75R(TNFR II)。細(xì)胞表面的 TNFR經(jīng)蛋白酶水解下來的受體片段，存在于人的各種體液中，即可溶性TNF受體，與膜表面 相對應(yīng)，來源于TNFR I的稱為sTNFR I，來源于TNFR II的稱為sTNFRII。sTNFR對TNF有 高親和力，一旦與TNF結(jié)合，阻斷TNF與TNFR的結(jié)合，從而間接抑制TNF的活性。sTNFR的 作用有兩方面在高濃度時sTNFR可拮抗TNF作用；在低濃度時對TNF的結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作 用。鑒于細(xì)胞因子的受體參與機體的多種生理和/或病理過程，是藥物作用的重要靶 點。近年來，隨著分子生物學(xué)在藥理學(xué)領(lǐng)域中的發(fā)展，尤其是人類基因組計劃的開展，針對 細(xì)胞因子的新的受體和亞型不斷被發(fā)現(xiàn)，所述受體(亞型)的功能以及在疾病發(fā)展過程中 的作用也逐漸被闡明。這驅(qū)使藥物研究工作者能夠從尋找相應(yīng)的受體拮抗劑或激動劑出 發(fā)，一方面通過所述受體的拮抗劑或激動劑研究這些信使物質(zhì)的生物學(xué)功能，另一方面也 能夠從特異性受體的拮抗劑或激動劑中獲得調(diào)節(jié)機體功能的新的藥物。已知人源sTNFR可以作為天然TNF的拮抗劑，用于治療與其相應(yīng)的配基過量有關(guān) 的疾病，所述疾病包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、敗血癥休克、急慢性髓性敗血病、動脈粥樣硬化、自身 免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)等。因此，不同來源的TNFR的拮抗劑長期以來一直受到廣泛關(guān) 注。本發(fā)明人利用TNFR拮抗劑篩選模型，多年來不斷對大量微生物來源的代謝產(chǎn)物 進行反復(fù)篩選，再次獲得新的微生物來源的炎癥因子受體拮抗劑A。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一個方面，利用TNFR受體拮抗劑篩選模型跟蹤各個純化階段的樣品，獲得 了一種微生物來源的腫瘤壞死因子受體拮抗劑A，其通過如下方法制備在適于產(chǎn)生所述 受體拮抗劑A的條件下培養(yǎng)球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Al,以及從球孢白僵菌Al的 發(fā)酵液中獲得所述受體拮抗劑A。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述受體拮抗劑A采用如下方法制備
1)粗品制備將經(jīng)過濾的球孢白僵菌Al發(fā)酵液通過大孔吸附樹脂，丙酮洗脫，收集洗脫液并揮 干，得深棕色粗品；2)純化對于步驟1)中的粗品用甲醇溶解并充分離心后所得到的沉淀，經(jīng)去離子水溶解 后，利用TNFR受體拮抗劑篩選模型追蹤分析各純化階段的樣品，依次用DEAE-kphadex A25柱梯度洗脫組分；用⑶X-104型大孔吸附樹脂柱處理的洗脫組分經(jīng)冷干得白色絮狀固 體，即本發(fā)明所述受體拮抗劑A的一種形式一腫瘤壞死因子受體拮抗劑Al ；對于步驟1)中的粗品用甲醇溶解并充分離心后所得到的上清液，濃縮后進行 0DS/C-18反相柱色譜(IcmX 30cm)不連續(xù)梯度洗脫，利用TNFR受體拮抗劑篩選模型追蹤分 析各純化階段的樣品，將活性最高的組分冷干得白色固體，即本發(fā)明所述受體拮抗劑A的 另一種形式一腫瘤壞因子受體拮抗劑A2。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述粗品制備包括將經(jīng)過濾的發(fā)酵液通過 GDX-104型大孔吸附樹脂，棄去流出液，用30%丙酮洗脫，收集洗脫液并揮干，得深棕色粗
P
ΡΠ O在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述受體拮抗劑A純化過程中對于步驟1)中粗 品用甲醇溶解并充分離心后所得到的沉淀，采用如下步驟純化沉淀部分用去離子水溶解，上DEAE-S^hadex A25柱，依次用H20、0. 5N NH4C1、 0. IN HCl梯度洗脫，收集0. IN HCl的洗脫液，用NaOH中和至中性，上⑶X-104型大孔吸附 樹脂柱，用去離子水洗脫至檢測不到Cl_離子，接著用30%丙酮洗脫，收集洗脫液，揮去丙酮 后冷干，得白色絮狀固體，即腫瘤壞死因子受體拮抗劑Al。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述受體拮抗劑A純化過程中對于步驟1)中粗 品用甲醇溶解并充分離心后所得到的上清液，采用如下步驟純化上清液濃縮后進行0DS/C-18反相柱色譜(lCmX30Cm)，以水-甲醇系統(tǒng)自100% 水至100%甲醇不連續(xù)梯度洗脫，流速;3ml/15min，每份:3ml，共得90份，組分20-25冷干，即 得白色粉末腫瘤壞死因子受體拮抗劑A2。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述球孢白僵菌Al的發(fā)酵液通過如下方法制 備以YM斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)7天的球孢白僵菌Al作為菌種，接種于IOOml種子培 養(yǎng)基中(500ml三角燒瓶裝)J6°C振蕩培養(yǎng)48小時，然后轉(zhuǎn)種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為 2%，26°C振蕩培養(yǎng)96小時，得到含有本發(fā)明所述受體拮抗劑A的發(fā)酵液。在本發(fā)明中，所述YM斜面培養(yǎng)基為酵母粉0.4%，麥芽浸膏粉1.0%，葡萄糖 .斗^，瓊脂^^，？??！二？^，川磅消毒。所述IOOml種子培養(yǎng)基為每500ml三角燒瓶裝 甘油1%，葡萄糖2%，蔗糖1%，黃豆餅粉0.2%，蛋白胨(F403)l%,KH2PO4 0.03%，聚乙二 醇(6000)0. 25%, NaNO3 0. 3%, (NH4)2SO4 0. 3%，pH = 6. 0，15 磅消毒。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的 組成同種子培養(yǎng)基。本發(fā)明又一方面，還涉及一種產(chǎn)生所述受體拮抗劑A的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Al。為滿足專利審查要求，本發(fā)明人將所述球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Al 于2010年11月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，100101)，保藏號CGMCC No. 4294。本發(fā)明又一方面，涉及利用所述保藏號為CGMCC4294的球孢白僵菌Al制備所述腫 瘤壞死因子受體拮抗劑A的方法，包括1)粗品制備將經(jīng)過濾的球孢白僵菌Al發(fā)酵液通過大孔吸附樹脂，丙酮洗脫，收集洗脫液并揮 干，得深棕色粗品；2)受體拮抗劑A的純化對于步驟1)中的粗品用甲醇溶解并充分離心后所得到的沉淀，經(jīng)去離子水溶解 后，利用TNFR受體拮抗劑篩選模型追蹤分析各純化階段的樣品，依次用DEAE-kphadex A25柱梯度洗脫組分；用⑶X-104型大孔吸附樹脂柱處理的洗脫組分經(jīng)冷干得白色絮狀固 體，即腫瘤壞死因子受體拮抗劑Al ；對于步驟1)中的粗品用甲醇溶解并充分離心后所得到的上清液，濃縮后進行 0DS/C-18反相柱色譜(IcmX 30cm)不連續(xù)梯度洗脫，利用TNFR受體拮抗劑篩選模型追蹤分 析各純化階段的樣品，將活性最高的組分冷干得白色固體，即腫瘤壞死因子受體拮抗劑A2。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述受體拮抗劑A的制備方法中，所述粗品制 備步驟包括將經(jīng)過濾的發(fā)酵液通過GDX-104型大孔吸附樹脂，棄去流出液，用30%丙酮洗 脫，收集洗脫液并揮干，得深棕色粗品。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述受體拮抗劑A的制備方法中，所述受體拮 抗劑A純化過程中步驟1)中粗品用甲醇溶解并充分離心后所得到的沉淀，采用如下步驟純 化沉淀部分用去離子水溶解，上DEAE-S^hadex A25柱，依次用H20、0. 5N NH4C1、 0. IN HCl梯度洗脫，收集0. IN HCl的洗脫液，用NaOH中和至中性，上⑶X-104型大孔吸附 樹脂柱，用去離子水洗脫至檢測不到Cl_離子，接著用30%丙酮洗脫，收集洗脫液，揮去丙酮 后冷干，得白色絮狀固體，即腫瘤壞死因子受體拮抗劑Al。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述受體拮抗劑A的制備方法中，所述受體拮 抗劑A純化過程中步驟1)中粗品用甲醇溶解并充分離心后所得到的上清液，采用如下步驟 純化上清液濃縮后進行0DS/C-18反相柱色譜(IcmX 30cm)，以水-甲醇系統(tǒng)自100% 水至100%甲醇不連續(xù)梯度洗脫，流速;3ml/15min，每份:3ml，共得90份，組分20-25冷干得 白色粉末，即腫瘤壞死因子受體拮抗劑A2。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述受體拮抗劑A的制備方法中，其中所述球 孢白僵菌Al的發(fā)酵液通過如下方法制備以YM斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)7天的球孢白僵菌Al作為菌種，接種于IOOml種子培 養(yǎng)基中(500ml三角燒瓶裝)J6°C振蕩培養(yǎng)48小時，然后轉(zhuǎn)種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為 2%，26°C振蕩培養(yǎng)96小時，得到含有本發(fā)明所述受體拮抗劑A的發(fā)酵液。本發(fā)明的再一方面，涉及所述受體拮抗劑A用于制備治療與天然腫瘤壞死因子受 體(TNFR)配基過量相關(guān)疾病的藥物的用途。在本發(fā)明中，所述疾病包括但不限于急性炎 癥，例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、敗血癥休克、急慢性髓性敗血病、動脈粥樣硬化、自身免疫性疾病、 移植排斥反應(yīng)。
以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明所述受體拮抗劑及其制備方法和生物活性進一步加以 闡述。實施例1微生物來源的腫瘤壞死因子受體拮抗劑A的制備在本發(fā)明中，采用以下檢測抗急性炎癥活性的常規(guī)方法對微生物代謝產(chǎn)物樣品的 受體拮抗活性進行跟蹤分析。1、腫瘤壞死因子受體拮抗劑的篩選模型和活性跟蹤方法1. 1包被重組人腫瘤壞死因子(TNF)以0. 5 μ g/ml的濃度溶解于pH7. 2的磷酸 鹽緩沖液(PBS)中，按每孔100 μ 1量包被96孔板，4°C放置12小時。1. 2封閉吸去包被液，以3% BSA的PBS溶液每孔250 μ 1封閉96孔板，4°C放置 12小時。1. 3洗板吸去封閉液，用PBS洗板2次。1. 4樣品的測定將hsTNFR按lmg/ml溶于PBS，取60 μ 1與待測樣品(調(diào) ρΗ7. 0)60 μ 1等體積混合，IOOOOr pm，按每孔100 μ 1加入酶標(biāo)板，4°C放置12小時。同時設(shè) 兩組對照孔，對照1 除不加待測樣品外，其他步驟同前。對照2 :PBS加顯色劑。1. 5洗板用含有0. 1 % Tween20的PBS洗板2次，再以PBS洗2次。1.6加入山羊抗人hs TNFR抗體，按1 2000稀釋在1 % BSA的PBS中，每孔加 100μ 1，4°C放置1小時。1. 7洗板用含有0. 1 % Tween20的PBS洗板2次，再以PBS洗2次。1. 8加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的馬抗山羊I gG抗體，按1 1000稀釋在BSA 的PBS中，每孔加100μ 1，4°C放置1小時。1. 9洗板用含有0. 1 % Tween20的PBS洗板2次，再以PBS洗2次。1. 10顯色每孔加入顯色底物TMB，室溫放置45分鐘，可觀察到樣品孔逐漸變藍。1. 11顯色終止與檢測每孔加入2N HCllOOy 1以終止顯色，立即檢測吸光度。檢 測波長為450nm。
權(quán)利要求
1.一種微生物來源的腫瘤壞死因子受體拮抗劑A，其通過如下方法制備在適于產(chǎn)生 所述受體拮抗劑A的條件下培養(yǎng)球孢白僵菌(Beauveria bassianaMl，以及從球孢白僵菌 Al的發(fā)酵液中獲得所述受體拮抗劑A。
2.權(quán)利要求1所述腫瘤壞死因子受體拮抗劑A，其采用如下方法制備1)粗品制備將經(jīng)過濾的球孢白僵菌Al發(fā)酵液通過大孔吸附樹脂，丙酮洗脫，收集洗脫液并揮干， 得深棕色粗品；2)受體拮抗劑A的純化對于步驟1)中的粗品用甲醇溶解并充分離心后所得到的沉淀，經(jīng)去離子水溶解后，利 用TNFR受體拮抗劑篩選模型追蹤分析各純化階段的樣品，依次用DEAE-S^hadex A25柱梯 度洗脫組分；用GDX-104型大孔吸附樹脂柱處理的洗脫組分經(jīng)冷干得白色絮狀固體，即腫 瘤壞死因子受體拮抗劑Al ；對于步驟1)中的粗品用甲醇溶解并充分離心后所得到的上清液，濃縮后進行ODS/ C-18反相柱色譜(IcmX 30cm)不連續(xù)梯度洗脫，利用TNFR受體拮抗劑篩選模型追蹤分析各 純化階段的樣品，將活性最高的組分冷干得白色固體，即腫瘤壞死因子受體拮抗劑A2。
3.權(quán)利要求2所述腫瘤壞死因子受體拮抗劑A，其中所述粗品制備包括將經(jīng)過濾的發(fā) 酵液通過GDX-104型大孔吸附樹脂，棄去流出液，用30%丙酮洗脫，收集洗脫液并揮干，得 深棕色粗品。
4.權(quán)利要求2所述腫瘤壞死因子受體拮抗劑A，其中所述受體拮抗劑A純化過程中，對 于步驟1)中粗品用甲醇溶解并充分離心后所得到的沉淀，采用如下步驟純化沉淀部分用去離子水溶解，上DEAE-S^hadex A25柱，依次用H20、0. 5N NH4C 1,0. IN HCl梯度洗脫，收集0. IN HCl的洗脫液，用NaOH中和至中性，上⑶X-104型大孔吸附樹脂 柱，用去離子水洗脫至檢測不到Cl_離子，接著用30%丙酮洗脫，收集洗脫液，揮去丙酮后冷 干，得白色絮狀固體，即腫瘤壞死因子受體拮抗劑Al。
5.權(quán)利要求2所述腫瘤壞死因子受體拮抗劑A，其中所述受體拮抗劑A純化過程中，對 于步驟1)中粗品用甲醇溶解并充分離心后所得到的上清液，采用如下步驟純化上清液濃縮后進行0DS/C-18反相柱色譜(IcmX30cm)，以水-甲醇系統(tǒng)自100%水至 100%甲醇不連續(xù)梯度洗脫，流速;3ml/15min，每份:3ml，共得90份，組分20-25冷干得白色 粉末，即腫瘤壞死因子受體拮抗劑A2。
6.權(quán)利要求1所述腫瘤壞死因子受體拮抗劑A，其中所述球孢白僵菌Al的發(fā)酵液通過 如下方法制備以YM斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)7天的球孢白僵菌Al作為菌種，接種于IOOml種子培養(yǎng)基 中(500ml三角燒瓶裝)，^TC振蕩培養(yǎng)48小時，然后轉(zhuǎn)種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為2%， 26°C振蕩培養(yǎng)96小時，得到含有權(quán)利要求1所述受體拮抗劑A的發(fā)酵液。
7.—種產(chǎn)生權(quán)利要求1所述腫瘤壞死因子受體拮抗劑A的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)Al，其保藏號為 CGMCC No. 4294
8.權(quán)利要求1所述腫瘤壞死因子受體拮抗劑A用于制備治療與天然腫瘤壞死因子受體 (TNFR)配基過量相關(guān)疾病的藥物的用途。
9.權(quán)利要求8所述的用途，其中所述疾病包括但不限于急性炎癥，例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、敗血癥休克、急慢性髓性敗血病、動脈粥樣硬化、自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物來源的炎癥因子受體拮抗劑及其制備方法，其中所述炎癥因子受體拮抗活性劑為一種腫瘤壞死因子受體(TNFR)拮抗劑A，其包括A1和A2兩種形式。本發(fā)明還涉及一種產(chǎn)生所述腫瘤壞死因子受體拮抗劑A的球孢白僵菌A1。本發(fā)明還涉及所述腫瘤壞死因子受體(TNFR)拮抗劑A用于制備治療與天然腫瘤壞死因子受體配基過量相關(guān)疾病的藥物的用途。
文檔編號C12P21/02GK102080117SQ20101057223
公開日2011年6月1日 申請日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者吳劍波, 姜蓉, 張洋, 李元, 石蓮英, 郭連宏, 陳晶 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所