專利名稱：一種β-葡萄糖苷酶及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種β-葡萄糖苷酶及其編碼基因與應用，屬于酶基因工程及酶工程領域。
背景技術：
纖維素是地球上最豐富的可再生資源，是多個葡萄糖殘基以β-1，4_糖苷鍵連接而成的多聚物(Schwarz WH，Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001，56 :634-649)。纖維素通過內切葡聚糖酶(EC 3. 2. 1. 4)和外切葡聚糖酶(纖維二糖水解酶，EC 3. 2. 1. 91)水解生成纖維二糖，葡萄糖苷酶(EC 3.2. 1.21)最終把纖維二糖水解為單個葡萄糖。β-葡萄糖苷酶在纖維素的水解中起著非常重要的作用，因為纖維二糖能內切和外切葡聚糖酶的活性，而β-葡萄糖苷酶能夠將纖維二糖水解成葡萄糖，從而解除產(chǎn)物對內切和外切葡聚糖酶的抑制作用。飼料中添加葡萄糖苷酶能夠明顯提高纖維素的降解率，從而提高飼料營養(yǎng)的利用率Chang et al. J. Anim. Sci. 1996，74 :394-402)。β _葡萄糖苷酶在黃酮類和異黃酮類糖苷化合物的水解中也有重要作用，這些酚和植物雌激素糖苷廣泛存在于自然界中的水果、蔬菜、茶、紅酒以及大豆中，被葡萄糖苷酶水解后釋放出的糖苷配基部分具有一些潛在的生物學活性，在醫(yī)學領域里的抗腫瘤藥物、基礎的生化研究以及食品領域具有重要的應用價值(Matsuda et al. J. Ferment. Bioeng. 1994,77 :439-441 ； Ridgway et al. Biothchnol. Genet. Eng. Rev. 1997,14 :165-190 ；Gueguenet al. J. Appl. Microbiol. 1997,82 :469-476)。β -葡萄糖苷酶還可用于苦澀物質脫苦、脫毒等。另外， β -葡萄糖苷酶的轉糖苷活性可以應用于一些化合物的生物合成，如低聚糖和糖綴合物等 (Bhatia et al. Crit. Rev. Biotechnol. 2002,22(4) :375-407)。按照水解底物特異性不同可將β -葡萄糖苷酶分為三類(I)芳基β -葡萄糖苷酶；(II)纖維二糖酶；(III)具有較寬水解特異性，能夠水解多種不同底物的β-葡萄糖苷酶。迄今，大部分報道的β -葡萄糖苷酶都屬于第三類。根據(jù)糖苷水解酶的氨基酸序列和分子折疊的相似性，將2000多種糖苷鍵水解酶進行分類(Henrissat and Bairoch,Biochem. J. 1996,316 :695-696),最后形成118個家族，該系統(tǒng)被廣泛應用并持續(xù)更新(http:// afmb. cnrs mrs.fr/-pedroo/CAZY/dt.html.)。除酸性 β -葡萄糖苷酶被歸類在第 30 家族外，其它葡萄糖苷酶都被劃分為第1或第3家族糖苷水解酶。第1家族包含有來自細菌、植物和動物的60多種葡萄糖苷酶，大多數(shù)第1家族的葡萄糖苷酶同時具有 β-半乳糖苷酶活性。第3家族糖苷水解酶主要來自于細菌、真菌和酵母的40多種β-葡萄糖苷酶和氨基己糖苷酶組成。β -葡萄糖苷酶分布較為廣泛，特別是植物的種子和微生物中尤為普遍。微生物 β -葡萄糖苷酶的研究主要集中在酵母、細菌、真菌和鏈霉菌等，已從多種的微生物中分離得到葡萄糖苷酶。迄今，對中溫菌葡萄糖苷酶研究較多，而對于嗜熱真菌葡萄糖苷酶的研究相對較少，如 Chaetomium thermophilum var. coprophiIum(Venturi et al.J. Basic Microbiol. 2002,42(1) :55-66. ),Humicola grisea var. thermoidea(Peraltaet al. FEMS Microbiol. Lett. 1997，146 :291-295)，Scytalidium thermophilum(Zanoelo et al. FEMS Microbiol. Lett. 2004,240 (2) :137-142), Thermomyces lanuginosus (Lin et al. Biotechnol. Appl. Biochem. 1999,30 :81-87)，Thermoascus aurantiacus(Parry et al.，Biochem. J. 2001，353 :117-127)，Talaromces thermophilus (Nakkharat et al.，J.Biotechnol. 2006,123(3) :304-313)禾口 Paecilomyces thermophila(Yang et al. J. Agric. Food Chem. 2008，56 :602-608)等。β-葡萄糖苷酶的基因國內外已有一些專利和文獻報道，如Oenococcus oeni (Herbertet al.World J Microbiol Biotechnol. 2010,26 :1281-1289), Rhizomucor miehei(Miklos etal. Antonie van Leeuwenhoek. 2010,97 :1-10), Bacillus licheniformis(Choi et al. J WoodSci. 2009, 55 :329-334)，Thermotoga maritima(Xue et al. World J Microbiol Biotechnol. 2009,25 :2165-2172) , Phanerochaete chrysosporium(Takeshi et al. Appl MicrobiolBiotechnol· 2006，73 :807_814)。胃 Jf 大學馮露等從嗜熱脫氮芽孢桿菌分離出一種糖苷水解酶3家族的嗜堿性β-葡萄糖苷酶基因，該酶最適溫度70°C，最適ρΗ 8.0，純化后該酶最佳比活力85. 2U/mg(專利號ZL 200510116748.9)。殷瑜等從根瘤土壤桿菌克隆得到β _葡萄糖苷酶基因，該酶可高效轉化有效霉素A得到有效霉亞基胺A產(chǎn)物(申請?zhí)?00610025503.Χ)。中科院微生物研究所薛燕芬等從高溫厭氧菌jThermoanaercAactertengcongensis克隆、表達一 β-葡萄糖苷酶基因，該酶作用溫度60-80°C，ρΗ 6.0-7.0(專利號21^02148776.6)。上海農(nóng)科院熊愛生通過基因體外定向分子進化和定點突變相結合獲得耐高溫葡萄糖苷酶基因并在植物基因轉化中得到應用(申請?zhí)?00710047380. 4)。江南大學吳敏等從黑曲霉中克隆得到具有轉糖苷作用的葡萄糖苷酶基因，并利用該酶合成龍膽低聚糖(申請?zhí)?200910(^9055.4)。國外也有不少關于β _葡萄糖苷酶基因克隆表達與應用的專利，如專利 (申請?zhí)朥S 6022725, US7582462B2)從 Trichoderma reesei，專利(申請?zhí)朥S 6184018 Bi)從Orpinomyces sp. PC2分別克隆得到β-葡萄糖苷酶基因等。微生物產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶種類較多，不同微生物來源的β-葡萄糖苷酶的性質差異較大，從而導致各具特色的應用范圍，因此開發(fā)耐熱、具有新特性的β -葡萄糖苷酶，使之更好地滿足工業(yè)需求具有重要的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種葡萄糖苷酶，來源于嗜熱擬青霉 (Paecilomycesthermophila)0本發(fā)明提供的蛋白，是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；幻將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-葡萄糖苷酶活性的由1)衍生的蛋白質。其中，序列表中的序列2由479個氨基酸組成，分子量約為55. OkDa0為了使1)中的蛋白便于純化，可在由序列表中1)的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1.標簽的序列
權利要求
1.一種蛋白，是如下1)或幻的蛋白質1)由序列表中序列2的第1-479所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有葡萄糖苷酶活性的由1)衍生的蛋白質。
2.權利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.如權利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述蛋白的編碼基因為如下1)-4)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列1自5’端第1-1437位的核苷酸序列；2)其編碼序列是序列表中序列1；3)在高嚴謹條件下與1)或2、的基因雜交且編碼權利要求1所述蛋白的基因；4)與1)或2)的基因具有90%以上的同源性且編碼權利要求1所述蛋白的基因。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組載體。
5.如權利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體是將權利要求2或3所述的基因插入PPIC9K的多克隆位點得到的重組表達載體。
6.含有權利要求2或3所述基因的表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
7.如權利要求6所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是將權利要求2或3所述的基因通過權利要求4或5所述的重組表達載體導入畢赤酵母中，得到的轉基因重組菌。
8.權利要求1所述蛋白的制備方法，是將權利要求6或7所述的重組菌進行發(fā)酵得到。
9.如權利要求8所述的制備方法，其特征在于所述發(fā)酵分基礎培養(yǎng)、甘油分批補料培養(yǎng)和甲醇誘導三個階段，所述三個階段的培養(yǎng)條件為溫度為30°C，溶氧DO > 20%，三個階段的PH分別控制在4. 0,5. 0和6. 0。
10.權利要求1所述的蛋白質或權利要求2或3所述的基因在降解纖維素寡糖、聚糖降解或合成寡糖中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種β-葡萄糖苷酶及其編碼基因與應用。本發(fā)明提供的β-葡萄糖苷酶是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有β-葡萄糖苷酶活性的由1)衍生的蛋白質。實驗證明該重組酶在畢赤酵母中高效分泌表達高達190.2U/mL，該重組酶最適pH和最適溫度分別為pH 6.0和55℃，具有較寬的底物作用范圍和良好的熱穩(wěn)定性，且可水解纖維多糖、大麥葡聚糖、地衣多糖和昆布多糖。該重組酶具有一定的轉糖苷能力，利用纖維二糖為底物，可以生成纖維三糖、龍膽二糖等，在食品、飼料、生物化工及醫(yī)藥行業(yè)中具有很大的應用潛力。
文檔編號C12N1/21GK102477417SQ20101055721
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月24日 優(yōu)先權日2010年11月24日
發(fā)明者華承偉, 李一男, 楊紹青, 江正強, 閆巧娟 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學