專利名稱：一株鄰苯二甲酸酯類化合物降解菌及其菌劑的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株分離自活性污泥的能高效降解環(huán)境激素鄰苯二甲酸酯類化合物的菌株(DiaphorcAacter sp. QH-6)，及其菌劑的生產(chǎn)方法。技術(shù)背景
鄰苯二甲酸酯類又稱酞酸酯類，是大約30種化合物的總稱，由鄰苯二甲酸和相應(yīng)的醇化合而成，一般為無色油狀粘稠液體，難溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，常溫下不易揮發(fā)，成本較低，品種多，產(chǎn)量大，常用來做增塑劑提高塑料的可塑性能。目前使用的增塑劑主要是酞酸酯類化合物。酞酸酯類增塑劑應(yīng)用最多的是酞酸二異辛酯(DEHP)，其次是酞酸二酯。 我國常用的品種有鄰苯二甲酸二辛酯(DOP)、鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二壬酯(DNP)等。近年來，隨著工業(yè)生產(chǎn)和塑料制品的使用，塑料垃圾的大量增加，鄰苯二甲酸酯不斷進(jìn)入環(huán)境，已成為全球性最普遍的污染物之一，廣泛存在于空氣及大氣降塵物、水體、土壤、底泥、生物體等自然環(huán)境中， 成為環(huán)境中無所不在的污染物。
由于鄰苯二甲酸酯類化合物在自然界中光解和水解速率很慢，微生物降解是其礦化的主要途徑。篩選高效降解菌具有重要的實(shí)踐意義。鄰苯二甲酸酯降解微生物篩選常用的方法是從鄰苯二甲酸酯污染地區(qū)采集樣品，經(jīng)富集培養(yǎng)、平板劃線等操作，分離得到單菌落，然后經(jīng)馴化培養(yǎng)，或紫外化學(xué)誘變等方法獲取高效降解菌株，或通過細(xì)胞工程、基因工程等技術(shù)手段構(gòu)建工程菌株。例如中國發(fā)明專利(申請?zhí)?00710(^6366)公開了一株降解鄰苯二甲酸酯的乙酸鈣不動(dòng)桿菌。
城市污水處理廠的處理水來源復(fù)雜，有機(jī)污染物程度較高。其中，鄰苯二甲酸酯是生活污水中的主要污染物之一。污水處理中，有機(jī)污染物的去除主要是通過活性污泥中的微生物降解而得以完成，從而達(dá)到污水凈化的目的。然而，隨著塑料工業(yè)的發(fā)展，鄰苯二甲酸酯的污染也不斷加劇，在污水處理廠的出水口也可以檢測到鄰苯二甲酸酯類化合物的存在，因此，從污水處理廠采集污泥，通過富集培養(yǎng)，梯度壓力法馴化，獲得高效降解菌并應(yīng)用于實(shí)踐，對于降低鄰苯二甲酸酯在環(huán)境中的危害具有現(xiàn)實(shí)意義。
本專利是從活性污泥分離出的一株高效降解鄰苯二甲酸二丁酯的菌株，命名為 Diaphorobacter sp. QH-6，實(shí)驗(yàn)表明該菌能利用鄰苯二甲酸二丁酯作為唯一碳源和能源生長繁殖，在純培養(yǎng)條件下，該菌12h能將無機(jī)鹽培養(yǎng)基中500mg/L鄰苯二甲酸二丁酯降解完全，且在較寬PH范圍內(nèi)均能較好的降解DBP;該菌同時(shí)對鄰苯二甲酸二甲酯，鄰苯二甲酸二己酯，鄰苯二甲酸正辛酯和鄰苯二甲酸異辛酯等均具有良好的利用能力。表明該菌可用于治理鄰苯二甲酸酯污染。目前尚未發(fā)現(xiàn)從活性污泥分離出降解鄰苯二甲酸酯的 DiaphorcAacter屬菌株及其菌劑生產(chǎn)方法的文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株分離自活性污泥的能夠高效降解鄰苯二甲酸酯類化合物的菌株，并提供該菌劑的生產(chǎn)方法。
本發(fā)明所提供的降解鄰苯二甲酸酯類化合物的菌株是由我們實(shí)驗(yàn)室從活性污泥中分離篩選出來的。該菌株的分類命名為DiaphorcAacter sp.，菌株編號QH_6 ；于2010 年11月16日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號=CGMCC No. 4345，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101。該菌株的16S rDNA基因序列已經(jīng)遞交到了 GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為 HQ588349。在http://www. ncbi. nlm. nih. gov/網(wǎng)站上用blast程序與已登錄細(xì)菌菌株的 16S rDNA基因序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明與DiaphorcAacter sp.相似性最高，可以達(dá)到99% 以上。
本發(fā)明所述的菌劑的生產(chǎn)方法如下
1、培養(yǎng)基配制
1)菌種保藏培養(yǎng)基(固體，1L)蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉5g，瓊脂20g，加水至 1L，pH 7. 0-75 ；
2)菌種活化培養(yǎng)基(液體，1L):蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉5g，加水至1L，pH 7. 0-75 ；
3)種子培養(yǎng)基(液體，10L)酵母膏 2g，DBP lg, K2HPO4 58g，KH2PO4 30g， (NH4) 2S0420g, MgCl2 1. 6g, CaCl2 0. 2g, Na2MoO4 ‘ 2H20 0. 024g, FeCl3 0. 018g, MnCl2 · 2H200. 015g, pH = 6. 8-7. 5 ；
4)發(fā)酵培養(yǎng)基(液體，200L) =K2HPO4 600g，KH2PO4 300g，(NH4)2SO4 200g， MgCl216g, CaCl2 2g, Na2MoO4 · 2H20 0. 24g, FeCl3 0. 18g, MnCl2 · 2H20 0. 15g，酵母膏 200g， 糖蜜 300g，加水至 200L, pH 6. 8-7. 5 ；
以上培養(yǎng)基均在121°C滅菌15_30min。
2、菌種活化挑取鄰苯二甲酸酯降解菌的菌種，在保藏培養(yǎng)基平板劃線，于30°C 培養(yǎng)，待長出明顯的單菌落后，挑取單菌落在菌種活化培養(yǎng)基中，于30°C，150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)12_24h ；
3、液體種子制備向裝有高溫滅菌的種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5% -10%的接種量接種鄰苯二甲酸酯降解菌，于25-37°C，通空氣培養(yǎng)12-24h，得到液體種子。
4、液態(tài)發(fā)酵向裝有高溫滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5% -10%的接種量接種鄰苯二甲酸酯降解菌，于25-37°C，通空氣培養(yǎng)18-60h，得到活菌體培養(yǎng)物。
5、菌劑制備培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌計(jì)數(shù)后，超濾濃縮，調(diào)節(jié)至101(lCFU/mL，灌裝， 于4°C保藏。使用時(shí)用水稀釋50-1000倍。
具體實(shí)施例方式
由本發(fā)明技術(shù)方案生產(chǎn)的鄰苯二甲酸酯降解菌劑能夠有效降解環(huán)境中的鄰苯二甲酸酯類化合物。以下通過具體實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施，目的在于幫助讀者更好地理解本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)，但不作為對本發(fā)明實(shí)施范圍的限定。
實(shí)施例1 鄰苯二甲酸酯降解菌劑的生產(chǎn)
1、培養(yǎng)基配制
2)菌種保藏培養(yǎng)基(固體，1L):蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉5g，瓊脂20g，加水至 1L，pH 7. 0-7. 5 ；
5)菌種活化培養(yǎng)基(液體，1L):蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉5g，加水至1L，pH 7. 0-75 ；
6)種子培養(yǎng)基(液體，10L)酵母膏 2g，DBP lg, K2HPO4 58g，KH2PO4 30g， (NH4) 2S0420g, MgCl2 1. 6g, CaCl2 0. 2g, Na2MoO4 ‘ 2H20 0. 024g, FeCl3 0. 018g, MnCl2 · 2H200. 015g, pH = 6. 8-75 ；
7)發(fā)酵培養(yǎng)基(液體，200L) =K2HPO4 600g，KH2PO4 300g，(NH4)2SO4 200g， MgCl216g, CaCl2 2g, Na2MoO4 · 2H20 0. 24g, FeCl3 0. 18g, MnCl2 · 2H20 0. 15g，酵母膏 200g， 糖蜜 300g，加水至 200L, pH 6. 8-75 ；
以上培養(yǎng)基均在121°C滅菌20min。
2、菌種活化挑取鄰苯二甲酸酯降解菌的菌種，在保藏培養(yǎng)基平板劃線，于30°C 培養(yǎng)，待長出明顯的單菌落后，挑取單菌落在菌種活化培養(yǎng)基中，于30°C，150r/min搖床振蕩培養(yǎng)24h ；
3、液體種子制備向裝有高溫滅菌的種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照7%的接種量接種鄰
苯二甲酸酯降解菌，于30°C，通空氣培養(yǎng)16h，得到液體種子。
4、液態(tài)發(fā)酵向裝有高溫滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5%的接種量接種鄰苯二甲酸酯降解菌，于30°C，通空氣培養(yǎng)14h，得到活菌體培養(yǎng)物。
5、菌劑制備培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌計(jì)數(shù)后，超濾濃縮，調(diào)節(jié)至1010CFU/mL，灌裝，于4°C保藏。
實(shí)施例2 鄰苯二甲酸酯降解菌劑對鄰苯二甲酸二丁酯的降解效果
1)在IOOmL含有500mg/L鄰苯二甲酸二丁酯的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中接種ImL菌劑；不接種的作為對照
2) 12h后，取樣萃取，利用高效液相色譜測定鄰苯二甲酸二丁酯的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種組檢測不到鄰苯二甲酸二丁酯的存在，降解率約為100%，而對照組鄰苯二甲酸二丁酯的含量幾乎沒有變化。
本發(fā)明所提供的鄰苯二甲酸酯降解菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2010年11月16日，分類命名=DiaphorcAacter sp.，保藏編號CGMCCNo. 4345，保藏地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100101。
權(quán)利要求
1.一株能夠高效降解鄰苯二甲酸酯類化合物的細(xì)菌菌株，其特征在于該菌株分類命名為Diaphorokicter sp.，菌株編號QH_6，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No 4345。
2.權(quán)利要求1所述的DiaphorcAactersp. QH-6菌株，其特征在于該菌株的16S rDNA 基因序列已經(jīng)遞交到了 GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為HQ588349。
3.用權(quán)利要求1所述芽孢桿菌的菌劑生產(chǎn)方法，其特征在于，生產(chǎn)步驟包括(1)培養(yǎng)基配制菌種保藏培養(yǎng)基(固體，1L)蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉5g，瓊脂20g，加水至1L， pH 7. 0-7. 5 ；菌種活化培養(yǎng)基(液體，1L)蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉5g，加水至1L， pH 7. 0-7. 5 ；種子培養(yǎng)基(液體，10L)酵母膏 2g，DBP lg, K2HPO4 58g，KH2PO4 30g， (NH4) 2S0420g, MgCl2 1. 6g, CaCl2 0. 2g, Na2MoO4 · 2H20 0. 024g, FeCl3 0. 018g, MnCl2 · 2H20 0. 015g, pH = 6. 8-75 ；發(fā)酵培養(yǎng)基(液體，200L) =K2HPO4 600g, KH2PO4 300g，(NH4)2SO4 200g, MgCl2 16g, CaCl2 2g，Na2MoO4 · 2H20 0. 24g，F(xiàn)eCl3 0. 18g，MnCl2 · 2H20 0. 15g，酵母膏 200g,糖蜜 300g,加水至 200L, pH 6. 8-7. 5 ；以上培養(yǎng)基均在121°C滅菌15-30min ；(2)菌種活化挑取鄰苯二甲酸酯降解菌的菌種，在保藏培養(yǎng)基平板劃線，于30°C培養(yǎng)，待長出明顯的單菌落后，挑取單菌落在菌種活化培養(yǎng)基中，于30°C，150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)12_24h ；(3)液體種子制備向裝有高溫滅菌的種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5%-10%的接種量接種鄰苯二甲酸酯降解菌，于25-37°C，通空氣培養(yǎng)12-24h，得到液體種子；(4)液態(tài)發(fā)酵向裝有高溫滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，按照5%-10%的接種量接種鄰苯二甲酸酯降解菌，于25-37°C，通空氣培養(yǎng)18-60h，得到活菌體培養(yǎng)物；(5)菌劑制備培養(yǎng)好的發(fā)酵液經(jīng)細(xì)菌計(jì)數(shù)后，超濾濃縮至101(lCFU/mL，灌裝，于4°C保藏；使用時(shí)用水稀釋50-1000倍。
全文摘要
本發(fā)明提供一株分離自活性污泥的能夠高效降解鄰苯二甲酸酯類化合物的細(xì)菌菌株，并提供其菌劑的生產(chǎn)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。經(jīng)鑒定這株菌為Diaphorobacter sp.，并將其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.4345，該菌株的16S rDNA基因序列已經(jīng)遞交到了GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為HQ588349。其菌劑的生產(chǎn)方法包括5個(gè)步驟培養(yǎng)基配制、菌種活化、液體種子制備、液態(tài)發(fā)酵、菌劑制備。由本發(fā)明技術(shù)方案生產(chǎn)的鄰苯二甲酸酯降解菌劑能高效降解環(huán)境中的常見環(huán)境激素——鄰苯二甲酸酯類化合物。
文檔編號C12R1/07GK102477403SQ20101055430
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月23日
發(fā)明者呂作鵬, 莊國強(qiáng), 王萍, 白志輝, 金德才 申請人:中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心