專利名稱：一種減少l-亮氨酸發(fā)酵過程中副酸的方法
一種減少L-亮氨酸發(fā)酵過程中副酸的方法技術領域：
本發(fā)明涉及一種減少L-亮氨酸發(fā)酵過程中副酸的方法，本發(fā)明屬于 生化工程領域。背景技術：
黃色短桿菌是工業(yè)發(fā)酵生產L-亮氨酸的常用菌株。在L-亮氨酸生 產過程中HAc、L-纈氨酸和L-丙氨酸是主要的副酸，這些副酸的大量積累嚴重抑制菌體活 力，使亮氨酸產量下降，同時這些副酸的存在也對亮氨酸的分離提取造成不利影響。近年來，代謝工程領域的研究結果表明，丙酮酸和乙酰輔酶A是黃色短桿菌合成 L-亮氨酸代謝網絡的關鍵節(jié)點，另外HAc、L-纈氨酸和L-丙氨酸是L-亮氨酸分批發(fā)酵過 程的主要副產物。當EMP流量超出TCA及L-亮氨酸生物合成途徑的代謝能力時，丙酮酸代 謝受阻，從而通過其它途徑進一步代謝，導致副產物的生成。因此分批發(fā)酵生產L-亮氨酸 的過程中，減弱EMP途徑代謝流量，降低副產物HAc、L-纈氨酸和L-丙氨酸的生成以及控制 TCA循環(huán)流量是提高L-亮氨酸得率的關鍵。
發(fā)明內容本發(fā)明采用在培養(yǎng)基中添加一定量的檸檬酸或其鹽的方法來減少黃 色短桿菌生產L-亮氨酸過程中副產物HAc、L-纈氨酸和L-丙氨酸的生成。檸檬酸或其鹽能夠抑制丙酮酸激酶活性，導致磷酸烯醇式丙酮酸積累，而磷酸烯 醇式丙酮酸又會強烈抑制磷酸果糖激酶，同時檸檬酸可以通過加強ATP的抑制效應抑制磷 酸果糖激酶的活力。由于丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶是EMP途徑的關鍵酶，所以發(fā)酵培養(yǎng) 基中添加適量檸檬酸鈉可以使得EMP途徑代謝流量減弱，從而減少副產物的生成。另外發(fā) 酵中后期菌體處于穩(wěn)定期，HMP途徑的主要作用是為L-亮氨酸合成途徑的乙酰羥基酸還原 異構酶催化的反應提供還原力NADPH，因此進入HMP途徑的碳架最終在GAP節(jié)點重新進入 EMP途徑。HMP途徑流量增加，從而還原力NADPH生成量增加，有利于L-亮氨酸的生成。適 當控制TCA循環(huán)流量對于增加L-亮氨酸的合成是必要的。因為檸檬酸合成酶是TCA循環(huán) 的限速酶，添加檸檬酸鈉會競爭性抑制檸檬酸合成酶的活性。所以添加適量檸檬酸鈉可以 限制TCA代謝流量，減少碳架的浪費，從而提高乙酰輔酶A進入L-亮氨酸生物合成的代謝 流，提高了 L-亮氨酸的產量。此方法在不增加額外設備和人力投入的情況下，實現(xiàn)了發(fā)酵過程中副酸的減少和 L-亮氨酸產量的提高，適合于工業(yè)化生產。本發(fā)明的目的是通過如下技術方案實現(xiàn)的本發(fā)明提供的一種減少L-亮氨酸發(fā)酵過程中副酸的方法，其特征是在發(fā)酵培養(yǎng) 基中添加檸檬酸或其鹽，使其在培養(yǎng)基中的濃度均為0. 01 16g/L，優(yōu)選0. 05 10g/L，更 優(yōu)選0. 1 5g/L。其中所說的檸檬酸鹽為檸檬酸鈉或檸檬酸鉀。本發(fā)明根據調整代謝流分配的原理提出了減少黃色短桿菌生產L-亮氨酸過程中 副產物HAc、L-纈氨酸和L-丙氨酸的生成的方法，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量檸檬酸鈉可以 抑制EMP途徑關鍵酶丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的活力，使得EMP途徑代謝流量減弱，從而 減少副產物的生成。
具體實施方式下面通過實施例對本發(fā)明作進一步的說明，所舉之例并不限制本發(fā)明的保護范 圍實施例1:采用的菌株為黃色短桿菌；種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖30，玉米漿IOmL,豆餅水解液20mL,尿素2. 0，KH2PO4 1. 0，MgSO4 0. 4，MnSO4 0. 01，Met 0. 4，VB1 300 μ g，VH 200 μ g。ρΗ 7· 0 7. 2,0. 075MPa, 20min發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖80，玉米漿 43. 5mL，NH4Ac 16. 7，(NH4)2S0417，KH2PO4
1.25，MgSO4 0. 5，MnSO4 0. 01，F(xiàn)eSO4 0. 01，Met 0. 7，Glu 0. 42，lie 0. 06，VB1 160 μ g, VH 50 μ g, CaCO3 20 (分消)，ρΗ 7· 0 7· 2，0. 075MPa, 20min培養(yǎng)方法從生長良好的活化斜面刮一滿環(huán)菌苔轉入裝有40mL種子培養(yǎng)基的 500mL無擋板三角瓶中，9層紗布封口，置巡回式搖床(180r/min)上，28°C下振蕩培養(yǎng)20h。 按10%的接種量接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基(含有0. lg/L檸檬酸鈉)的5L自動控制發(fā)酵罐中，控 制發(fā)酵液溫度為28°C，通入適當空氣，調節(jié)適當攪拌轉速，采用分階段供氧模式控制溶氧 0 30h為30 %，30h以后為20 %，通過自動流加液氨控制ρΗ在7. 0，通過流加適量泡敵消 泡，并通過流加濃度為800g/L的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃?. 0 2. 0%，發(fā)酵至64h停止。 在44h和64h測得L-丙氨酸含量分別為0. 76g/L，3. 94g/L，分別比對照實驗(44hL_丙氨酸 含量 0.86g/L，64hL-丙氨酸含量 4. 75g/L)降低了 11. 6%和 17. 1%。實施例2:采用的菌株為黃色短桿菌；種子、發(fā)酵培養(yǎng)基(同實施例1)，發(fā)酵培養(yǎng)基中中添加 5. Og/L檸檬酸鈉；培養(yǎng)方法同實施例1。在44h和64h測得L-纈氨酸含量分別為1. OOg/ L，4. 36g/L，分別比對照實驗(44hL-纈氨酸含量1. 58g/L，64hL_纈氨酸含量7. 46g/L)降低 了 36. 7%和 41. 6%。實施例3:采用的菌株為黃色短桿菌；種子、發(fā)酵培養(yǎng)基(同實施例1)，發(fā)酵培養(yǎng)基中中添 加5. Og/L檸檬酸鈉；培養(yǎng)方法同實施例1。在44h和64h測得HAc含量分別為0. 84g/L，
2.62g/L，分別比對照實驗(44hHAc 含量 2. 16g/L,64hHAc 含量 10. 09g/L)降低了 61. 和 74. 0%。
權利要求
一種減少L 亮氨酸發(fā)酵過程中副酸的方法，其主要步驟為采用黃色短桿菌發(fā)酵生產L 亮氨酸過程中在培養(yǎng)基中加入檸檬酸或其鹽來減少副酸的產生，其特征在于，在培養(yǎng)基中添加檸檬酸或其鹽使其在培養(yǎng)基中的濃度為0.01～16g/L。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是其中所說的檸檬酸鹽為檸檬酸鈉或檸檬酸鉀。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征是其中所說的檸檬酸或其鹽的濃度為0.05 10g/L。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征是其中所說的檸檬酸或其鹽的濃度為0.1 5g/L。
全文摘要
一種減少L-亮氨酸發(fā)酵過程中副酸的方法。本發(fā)明涉及一種減少發(fā)酵法制備L-亮氨酸過程中的副酸的方法。本發(fā)明根據調整細胞代謝流分配的原理，采用在培養(yǎng)基中添加檸檬酸或其鹽的方法，來有效減少L-亮氨酸發(fā)酵過程中HAc、L-纈氨酸和L-丙氨酸等副酸的形成。
文檔編號C12P13/06GK101962662SQ201010527450
公開日2011年2月2日 申請日期2010年11月2日 優(yōu)先權日2010年11月2日 公開號201010527450.8
發(fā)明者劉淑云, 史建明, 徐慶陽, 謝希賢, 陳寧 申請人:天津科技大學