專利名稱：不結(jié)球白菜葉綠素降解代謝調(diào)控相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種葉綠素降解代謝調(diào)控相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及不結(jié)球白菜的葉綠素降解代謝調(diào)控相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
葉綠素是光合作用中捕獲光的主要成分，在植物生長(zhǎng)發(fā)育后期、葉片衰老或果實(shí)成熟時(shí)，葉綠素被大規(guī)模降解。葉綠素降解對(duì)葉片衰老過(guò)程中蛋白質(zhì)氮的循環(huán)再利用具有重要意義(Hortensteiner S, Annu Rev Plant Biol, 57: 55-77，2006)；同時(shí)葉綠素降解是衰老葉肉細(xì)胞的一種解毒方式(Matile et al. Plant Physiology and Biochemistry, 27: 595-604， 1989; Matile et al. Plant Physiology, 112: 1403-1409， 1996)。最新的葉綠素降解途徑為葉綠素首先脫去鎂離子，生成脫鎂葉綠素(Pheophytin)，然后脫鎂葉綠素在 PPH (Pheophytin Pheophorbide Hydrolase) [Silvia Schelbert, et al. The Plant Cell, 21: 767 - 785，2009]，又稱 CRNl (Co-regulated with NYE1) [Ren G, et al. Journal of Integrative Plant Biology, 52(5) :496-504, 2010]的作用下被脫去植醇形成脫鎂葉綠酸(Phaeophorbide a, Pheide) 0脫鎂葉綠酸是葉綠素降解中最后的綠色色素，它的卟啉大環(huán)在脫鎂葉綠酸加氧酶(Pheophorbide a oxygenase, PaO)和紅色葉綠素降解物還原酶(red chlorophyll catabolite reductase, RCCR)的作用下經(jīng)過(guò)兩步反應(yīng)被氧化開(kāi)環(huán)。由于卟啉環(huán)裂解與葉片色素(綠色)喪失有關(guān)，因此這一步是葉片衰老時(shí)葉色黃化的關(guān)鍵步驟。該氧化過(guò)程的中間產(chǎn)物是紅色葉綠素代謝產(chǎn)物(RCC)，最終產(chǎn)物是原初熒光葉綠素降解產(chǎn)物(primer fluorescent Chl catabolite, pFCC)，它是有熒光的四吡咯線性分子。然后PFCC被運(yùn)出葉綠體，其C (82)位被羥基化并運(yùn)送入液泡。在液泡里因?yàn)?PH值偏酸性，修飾過(guò)的FCCs的D環(huán)和γ次甲基橋上發(fā)生非酶催化的異構(gòu)，最后生成葉綠素最終代謝產(chǎn)物非熒光葉綠素代謝產(chǎn)物(non- fluorescent Chl catabolite, NCCs)。葉綠素降解途徑中的許多酶都已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。通過(guò)突變體(nyel-Ι)篩選和圖位克隆，本實(shí)驗(yàn)室在國(guó)際上率先分離鑒定出了一個(gè)葉綠素降解代謝的關(guān)鍵調(diào)控基因AtNYEl (At4g22920, GenBank accession number :DQ437531) (Ren et al. Plant Physiol, 2007, 144: 1429-1441.)。擬南芥滯綠突變體 nyel-1，在黑暗處理6天后，還保持了 50%的葉綠素含量，與此同時(shí)處理的野生型植株僅含有不到10%的葉綠素，然而在nyel-Ι中光合作用和衰老相關(guān)的過(guò)程均未受到明顯影響，因此滯綠突變體nyel-Ι屬于滯綠突變體類型中的C型即非功能性的滯綠突變體。過(guò)量表達(dá) AtNYEl可導(dǎo)致植株葉片黃化，甚至出現(xiàn)白化苗。AtNYEl受各種衰老信號(hào)誘導(dǎo)，編碼一個(gè)新的葉綠體蛋白。NYEl在植物中高度保守，在其它植物物種也鑒定出了 AtNYEl的同源基因，這些基因的突變體植株在衰老時(shí)均具有葉片或子葉滯綠的特征，統(tǒng)稱為衰老誘導(dǎo)的葉綠體滯綠相關(guān)蛋白基因(Senescence-inducible chloroplast stay-green protein, SGR)。如草地羊茅(Festuca pratensis) sid/Bf993 (Armstead et al. , New Phytologist , 172: 592-597，2006)，7jC稻(Oryza sativa)sgr (Jiang et al. Plant J，52:197—209·，2007; Park et al. Plant Cell, 19: 1649-1664，2007)，辣椒(Capsicum annuum)cl (Barry et al. , Plant Physiology，147: 179-187 2008)，豌豆(Pisum sativum)JI2775 (Armstead et al. , Science, 315: 73-73 2007),西紅棉(Solanum lycopersicon) gf [ (Barry et al. , Plant Physiology，147: 179-187 2008)]等。不結(jié)球白菜(Brassica campestris L ssp. chinensis)原產(chǎn)中國(guó)，是我們南方人民十分喜愛(ài)的蔬菜，為人們提供每天健康所需的植物性蛋白、維生素、膳食纖維、可溶性糖及微量元素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是不可多得的健康食物來(lái)源。由于不結(jié)球白菜的食用部分多為鮮嫩葉片，從植物體上采摘后極易失綠變黃，常常導(dǎo)致不結(jié)球白菜在采后運(yùn)輸、貯藏、貨架銷售過(guò)程中的可食用性生物量的損失。伴隨著葉綠素的降解，葉片中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如維生素 C等也快速流失，同時(shí)亞硝酸銨等有毒物質(zhì)含量也隨之增加。延緩不結(jié)球白菜中葉綠素降解，使葉片保持更長(zhǎng)久的綠色，對(duì)于延長(zhǎng)不結(jié)球白菜貨架期具有重要的意義。長(zhǎng)期以來(lái)，不結(jié)球白菜新品種的培育基本上都是依靠傳統(tǒng)育種方法。雖然許多性狀已經(jīng)得到長(zhǎng)足改進(jìn)，但其局限性也日益明顯。遺傳工程在改良不結(jié)球白菜性狀方面已顯示出了難以比擬的優(yōu)越性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種不結(jié)球白菜葉綠素降解代謝調(diào)控相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的不結(jié)球白菜葉綠素降解代謝調(diào)控相關(guān)蛋白，是具有SEQ ID N0. 2 所示氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。不結(jié)球白菜葉綠素降解代謝調(diào)控相關(guān)蛋白的編碼基因，是下列核苷酸之一。1) SEQ ID NO. 1 所示的 DNA 序列。2)編碼SEQ ID N0. 2所示氨基酸序列的多核苷酸。SEQ ID NO. 1由963個(gè)堿基組成，該基因的讀碼框?yàn)樽?’端第12位至818位堿基；SEQ ID N0. 2由268個(gè)氨基酸殘基組成。本發(fā)明還包括含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體和細(xì)胞系。本發(fā)明還包括上述基因在不結(jié)球白菜滯綠研究中的應(yīng)用，以及在植物葉綠素降解途徑中中的應(yīng)用。


圖1為中間片斷擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜。圖2為3’端擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜。圖3為5’端擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜。圖4為基因全長(zhǎng)凝膠電泳圖譜。圖5為不結(jié)球白菜葉綠素降解調(diào)控相關(guān)蛋白BcNYEl與其他植物葉綠素降解調(diào)控相關(guān)蛋白NYE同源性分析。
圖6為不結(jié)球白菜葉綠素降解調(diào)控相關(guān)蛋白BcNYEl與其他植物葉綠素降解調(diào)控相關(guān)蛋白NYE親緣關(guān)系進(jìn)化樹(shù)分析。圖7為黑暗處理4天下野生型擬南芥和互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株離體葉片的表型。圖8為正常生長(zhǎng)45天的狀態(tài)下野生型，滯綠突變體(/7_FW-7)，互補(bǔ)轉(zhuǎn)基因植株的表型。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、不結(jié)球白菜葉綠素降解代謝調(diào)控相關(guān)蛋白編碼基因ifcMSY的獲得。1.1 RNA 提取
取衰老的不結(jié)球白菜葉片材料約0. lg。液氮充分研磨后，轉(zhuǎn)移到1. 5ml離心管，加1 mlTRIZj 1 # ( invitrogen 公司
)，混勻后，室溫放置15分鐘，加0. 2ml氯仿異戊醇(24:1)，劇烈搖動(dòng)15秒后室溫放置5 分鐘，13000rpm，4°C離心15分鐘。取上清液并加入等體積異丙醇，小心混勻，室溫放置15 分鐘，13000rpm，4°C離心15分鐘。70%乙醇洗滌沉淀，室溫干燥15分鐘。溶解于適量的經(jīng) 0. 1% DEPC處理過(guò)的CldH2O水中，貯存于-80°c備用。1. 2 cDNA第一鏈合成和反轉(zhuǎn)錄PCR
采用上海申能博彩生物技術(shù)公司(SHBC)的cDNA第一鏈合成試劑盒，按照操作指南將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件分別為2μ g制備的總RNA，0. 5μ 1 Rnase inhibitor，加 DEPC 處理過(guò)的去離子水至 8. 5 μ 1，2 μ 1 的 Oligo (dT) 18 primer. 65°C，5min,室溫放置 lOmin，13000rpm 簡(jiǎn)短離心5s。再依次加入4μ1 5XFirst-Strand buffer,0.5 μ 1 RNase Inhibitor,2 μ 1 IOOmM DTT, 2μ 1 dNTP, 1 μ 1 MMLV Reverse Transcriptase ο小心混勻；37°C反轉(zhuǎn)錄1小時(shí)，90°C 5分鐘；冰上冷卻；13000rpm短暫離心5秒鐘，存放于-20°C待用。1. 3 RT-PCR 擴(kuò)增 BcNYEl 中間片斷
根據(jù)以往在其他植物中克隆到的NYEl蛋白基因的保守序列，設(shè)計(jì)了兩條同源兼并引物 BRASF (5， -GCAGCCGTTGA(C/T)GA (C/G)AAGAAGCATCC-3，)和 BRASR (5， -GGCC(A/T) CCGCT(A/T)ATGTG(A/G)CAATGAAC-3，)(SEQ ID NO. 3)作為 PCR 反應(yīng)的引物。PCR 反應(yīng)體系為50μ 1，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性40s，63°C復(fù)性45s，72°C延伸45s，循環(huán)35次。72°C充分延伸lOmin。將所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離獲得一段約 214bp的片斷?；厥詹⑶彝ㄟ^(guò)TA克隆至TAKARA pMD_19_T載體后，由上海英駿公司測(cè)序，獲 ^BcNYEI的中間序列。1. 4 BcNYEl全序列的獲得
1.4. 1 BcNYEl的3’末端序列的擴(kuò)增
BcNYEl的3’末端序列擴(kuò)增使用Clontech公司的BD-SMARTTMRACE試劑盒。根據(jù)已經(jīng)獲得的保守序列設(shè)計(jì)了一個(gè)特異性引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。BcNYE1 3，RACE F 5，-GGCGA ATGTC(C/G/T)CTTCA(C/T)GTTCATTG-3，
反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為95°C變性30sec，55°C退火45sec，72°C延伸45sec，最后在72°C延伸IOmin。將所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %電泳檢測(cè)， 獲得約的片段，割膠回收并克隆至克隆載體進(jìn)行測(cè)序，獲得ifcMSV的3’末端序列。
1. 5 5’ RACE法擴(kuò)增召cMSY的末端序列
按照Takara 5，F(xiàn)ULL-RACE (Code :D6122)方法自行合成以下5個(gè)引物 BcNYEl 5，末端 P 標(biāo)記反轉(zhuǎn)錄引物5，- (P) CTGAGTCCCAGAGTA-3， (SEQ ID NO. 4)
1st PCR Al: 5' -GCAGTTGTTGTTTCCCACC-3‘ 1st PCR Si: 5，-TGCTTCTTGCAACTCAGGAT-3，(SEQ ID NO. 5) 2nd PCR A2: 5’ -GGTCCCATAGTCTTAGCAACG-3’ 2nd PCR S2: 5，-TTGCGAAGAGATCTAAAAGG AA-3，(SEQ ID NO. 6) 按照 Takara5，F(xiàn)ULL-RACE (Code :D6122)方法，依次經(jīng)過(guò) cDNA 第一鏈的合成，Hybrid RNA的分解，連接反應(yīng)(單鏈cDNA環(huán)化或形成首尾連接物)，以及兩輪PCR反應(yīng)，再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離獲得50!3bp的PCR片斷。最后經(jīng)割膠回收，克隆至克隆載體，測(cè)序，最終獲得 BcNYEl的5’末端序列。第一輪PCR反應(yīng)條件94 °C預(yù)變性5min，94 °C變性40s，53 °C復(fù)性60s，72 °C延伸 60s，循環(huán)；35次。72°C充分延伸IOmin。第二輪PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min，94°C變性40s，55°C復(fù)性60s，72 °C延伸 60s，循環(huán)；35次。72°C充分延伸IOmin。根據(jù)已經(jīng)獲得的ifcMS73’和5’末端序列以及中間序列拼接獲得了 BcNYEl的全長(zhǎng)序列。實(shí)施例2 不結(jié)球白菜葉綠素降解調(diào)控相關(guān)蛋白功能分析。2. 1序列比較分析
用Genedoc軟件分析了 BcNYEl與其他物種的同源性。分析結(jié)果表明BcNYEl與其他物種的NYEl蛋白具有極大的同源性。釙SGR (高粱，AAW82958)，ZmSGRl (玉米， ΝΡ_001105770), ZmSGR2 (玉米，NP_001105771)，OsSGR (水稻，EAZ09856)，HvSGR (大麥，MW^955), AtNYEl (擬南芥，NP_567673)，AtNYE2 (擬南芥，ABD77556)，LeSGRl (番茄，AAY98500), GmSGRl (大豆 AAW8^59)，PsSGR (豌豆，BAF76!352)。為了分析BcNYE 1同其他物種NYE蛋白的親緣關(guān)系，使用MEGA軟件建立了 BcNYEl同其他物種NYE蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明BcNYEl同AtNYEl的親緣關(guān)系最近。進(jìn)化樹(shù)中各物種NYE蛋白的序列登錄號(hào)分別為AtNYEl/At4gM920 (擬南芥 Arabidopsis, DQ437531);AtNYE2/At4gl1910(擬南芥，Arabidopsis, NM_117261. 5)； LeSGR/SlSGRl (番茄，iTomato, AY850152) ；GmSGRl (大豆，Soybean, AY850141) ； GmSGR2 (大豆，Soybean, AY850142) ； ZjSGRl (結(jié)縷草，Zoysia, AY850154. 1) ； HvSGRl (大麥，H. vulgare, AY850135. 1) ； OsSGRl (水稻，Rice, AY850134. 1) ； ZmSGRl (玉米，Maize, AY850138. 1) ； ZmSGR2 (玉米，Maize, AY850139. 1) ； SbSGRl (高粱， S. bicolor, AY850140. 1)。2. 2召cMSY基因功能分析
2. 2. 1互補(bǔ)擬南芥載體構(gòu)建
利用引物AtNYElPF禾Π AtNYElPR擴(kuò)增出擬南芥的啟動(dòng)子,并克隆至pMD19_T Vector(Takara)，測(cè)序無(wú)誤之后。使用EcoRI和McI雙酶切，回收純化目的片斷，并連接到經(jīng)過(guò)同樣兩個(gè)酶酶切，純化的PCHF3載體上。命名為Μ Λ^Υ- pCHF3利用引物BcNYEIF 和BcNYEIR 擴(kuò)增出BcNYEl的cDNA，并克隆至pMD19_T Vector(Takara),測(cè)序無(wú)誤之后。使用BamHI和Mil雙酶切，回收純化目的片斷，并連接到經(jīng)過(guò)同樣兩個(gè)酶酶切，純化的VAtMEl- pCHF3載體上，獲得互補(bǔ)載體，命名為 PA tNAP-BcNYEl -pCHF3。AtNYElPF 5' CTGGAATTCAAATCCCTACATA 3' AtNYElPR 5' CTCTGAGCTCTTGAAACCCA 3' (SEQ ID NO. 7) BCNYEIF 5' ATAGGATCCATGTGTAGTTTGTCGGCGA 3'
BcNYEIR 5' GCGTCGACTCAATAGAGTTTCTCTGGACTAGG 3' (SEQ ID NO. 8)。2. 2. 2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。2. 2. 2. 1 LBA4404農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備
1)在含利福霉素40yg/ml，鏈霉素100yg/ml的YEB固體培養(yǎng)基上劃線，培養(yǎng) 48h-72h ；
2)挑單菌落到含利福霉素40μ g/ml，鏈霉素100yg/ml的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至 OD6tltl 0. 5 ；
3)冰上冷卻菌液，5000rpm，4°C10分鐘收集菌體；
4)ImM Hepes pH 7. O洗滌3次，再用10%甘油洗滌一次；
5)懸浮菌體于:3ml10%甘油中，分裝到1.5ml離心管中，每管40 μ 1。2. 2. 2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
1)200ng質(zhì)粒DNA，W 40 μ 1農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞混勻后按以下條件進(jìn)行電轉(zhuǎn)化； U 1. 8 KV
R 200 W C 25 uF
2)電擊后添加800μ 1 SOC液體培養(yǎng)基，280C培養(yǎng)Ih ；
3)4000rpm, 10分鐘收集菌體，懸浮于200 μ 1 SOC中，涂在含100 μ g/ml壯觀霉素， 利福平40 μ g/ml,鏈霉素100 μ g/ml LB固體培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)48h_72h。2. 2. 3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)化。2. 2. 3. 1擬南芥基質(zhì)培養(yǎng)
基質(zhì)組分蛭石黑土 珍珠巖9 3 0. 5 營(yíng)養(yǎng)液組分
權(quán)利要求
1.一種不結(jié)球白菜葉綠素降解代謝調(diào)控相關(guān)蛋白BcNYEl，其特征在于為SEQ ID NO. 2 所示氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
2.不結(jié)球白菜葉綠素降解代謝調(diào)控相關(guān)蛋白BcNYEl編碼基因，其特征在于其DNA序列為SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，或者為編碼SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的多核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于該基因的編碼框?yàn)樽?’端第12位到第 818位堿基的DNA序列。
4.含有如權(quán)利要求2或3所述不結(jié)球白菜葉綠素降解代謝調(diào)控相關(guān)蛋白BcNYEl的編碼基因的表達(dá)載體。
5.含有如權(quán)利要求2或3所述不結(jié)球白菜葉綠素降解代謝調(diào)控相關(guān)蛋白BcNYEl的編碼基因的細(xì)胞系。
6.如權(quán)利要求2或3所述不結(jié)球白菜葉綠素降解代謝調(diào)控相關(guān)蛋白的編碼基因在植物滯綠性狀改良中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體公開(kāi)一種不結(jié)球白菜葉綠素降解代謝調(diào)控相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的葉綠素降解代謝調(diào)控相關(guān)蛋白，來(lái)源于不結(jié)球白菜，品種“夏冬青”，蛋白名稱為BcNYE1，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。不結(jié)球白菜葉綠素降解代謝調(diào)控相關(guān)蛋白BcNYE1的編碼基因，其核苷酸序列為SEQIDNO:1所示，或者為編碼SEQIDNO2氨基酸序列的多核苷酸序列。本發(fā)明的基因可用于不結(jié)球白菜葉綠素降解分子機(jī)制研究，并用于植物滯綠性狀改良，包括延緩植物葉片葉綠素降解及葉片衰老。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102276709SQ20101051908
公開(kāi)日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2010年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月26日
發(fā)明者梁寧菁, 蒯本科, 邱凱, 魏強(qiáng) 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)