專利名稱：一種超高麥芽糖漿的制備方法及其專用酶制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種超高麥芽糖漿的制備方法及其專用酶制劑，更詳細地說是涉及一 種超高濃度麥芽糖漿的制備方法及其專用酶制劑的基本特性和制備方法，屬于淀粉糖生成 技術和微生物基因工程技術領域。
背景技術：
麥芽糖漿是以淀粉質為原料，經(jīng)酶、或酸與酶結合的方法水解而成的以麥芽糖為 主的糖漿，根據(jù)麥芽糖的含量不同大致可以分為飴糖(麥芽糖含量20%-30%)、高麥芽糖漿 (麥芽糖含量40%-60%)、超高麥芽糖漿(麥芽糖含量大于65%)和結晶麥芽糖等。高麥芽糖漿的甜度低而溫和，可口性強，在高溫和酸性條件下比較穩(wěn)定，具有熬煮 溫度高、不易發(fā)生美拉德反應等優(yōu)點。在食品行業(yè)，對面包、糕點、烘焙食品等加工過程具有 防止淀粉老化、保濕、延長保質期等作用；在蜜餞、方便食品、醬油、糖果、口服液、保健飲品、 麥乳精、冷凍食品等食品行業(yè)作為營養(yǎng)甜味劑、填充劑得到廣泛應用；在醫(yī)藥行業(yè)，可添加 至多種中藥中使用，具有潤肺、補虛、止咳、治療腰痛等作用。此外，超高麥芽糖漿在加氫氫 化后可生成麥芽糖醇，麥芽糖醇是一種甜度和蔗糖相當而熱量值較低的甜味劑，也是制備 另一種功能性食品原料麥芽糖酮糖和低聚異麥芽糖的原料。目前，歐美各國大多采用真菌a_淀粉酶(結合b_淀粉酶和普魯蘭酶)做為糖化劑 來生產高麥芽糖漿，得到的麥芽糖漿其組成中麥芽糖占40%-60%，麥芽三糖約10%-20%，其 它為葡萄糖及其它低聚糖和糊精等。對超高麥芽糖漿的生產，在糖化過程中則需要b—淀粉 酶、支鏈淀粉酶、異淀粉酶或麥芽糖生成酶等酶制劑的協(xié)同作用。目前，國內外在制備高麥芽糖漿的過程中所使用的真菌a_淀粉酶均為米曲霉 (A. oryzae)所生產，使用此酶的缺點是必須結合其它酶種一起使用，且在所制備的高麥芽 糖漿中仍含有較高濃度的麥芽三糖(約10%_20%)。在超高麥芽糖漿生產中，糖化過程中必須 有多種酶制劑協(xié)同作用，工藝復雜。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種制備超高麥芽糖漿的方法及其專用酶制劑的基本特性 和制備方法，以達到簡化超高麥芽糖漿制備工藝的目的。本發(fā)明提供的一種制備超高麥芽糖漿的方法，是能以多種淀粉質(大米淀粉、玉米 淀粉、木薯淀粉、小麥淀粉、馬鈴薯淀粉)為原料，經(jīng)液化后通過單一酶種進行糖化，直接制 備超高麥芽糖漿，麥芽糖含量可達65%_75%。本發(fā)明提供的一種專用酶制劑的制備方法，是一種特殊的真菌a_淀粉酶RoAmy， 通過基因工程手段從米根霉(ATCC9363)基因組中獲得真菌a_淀粉酶RoAmy編碼基因，并 在黑曲霉菌株或酵母菌株中實現(xiàn)過量表達，通過微濾、超濾等手段獲得液態(tài)酶制劑。本發(fā)明的技術方案一種制備超高麥芽糖漿的專用酶制劑真菌淀粉酶RoAmy， 其通過基因工程手段構建重組體細胞實現(xiàn)來源于米根霉(ATCC9363)的一種真菌a-淀粉酶基因的過量表達，其基因編碼為SEQ ID NO: 1。一種利用所述真菌a-淀粉酶RoAmy制備超高麥芽糖漿的方法，以植物淀粉質為原 料，利用真菌a-淀粉酶RoAmy進行糖化而直接獲得超高麥芽糖漿；工藝為
1)液化在質量濃度為10%-30%，pH為4.5-6. 5的淀粉乳中加入耐高溫酸性淀粉酶， 酸性a-淀粉酶用量為2-8 LU/g干淀粉，于95-105°C液化10-25分鐘，135°C滅酶5分鐘， DE值控制在1-8之間；
2)糖化液化后冷卻至55-65°C，加入真菌a-淀粉酶RoAmy，用量為4_15U/g干淀粉， 糖化30-60小時，經(jīng)脫色、離子交換、真空濃縮，得到質量濃度65%-75%的超高麥芽糖漿，其 中葡萄糖含量為7%-13%，幾乎不含麥芽三糖和其它低聚糖。本發(fā)明提供的一種專用酶制劑真菌a-淀粉酶RoAmy的制備方法包括以下步驟 (1)使用反轉錄PCR試劑盒提取米根霉(ATCC9363，"Lactate and Ethanol
Productions by Rhizopus oryzae ATCC 9363 and Activities of Related Pyruvate Branch Point Enzymes” JOURNAL of BI0SCHENCE AND BIOENGINEERING Vol 102，No. 5， 464-466，2006.已公開)菌絲組織總RNA并擴增得到大小為1. 4 kb的RoAmy基因的 cDNA片段，回收并克隆入pMD19 (大連寶公司)，在大腸桿菌JM 109中構建得到重組質粒 pMD-W耶，提取重組質粒并使用T-載體通用引物測序，獲得淀粉酶的編碼基因序列SEQ ID NO: 1。其中ATG為起始密碼子，TAA為終止密碼子。根據(jù)以上核苷酸序列，獲得該淀粉酶氨基酸組成為SEQ ID NO: 2。該淀粉酶由462個氨基酸組成，從蛋白質一級結構分析，該蛋白質前20個氨基酸 為信號肽序列，成熟肽含有三個糖基化位點Asn和淀粉酶所具有的四個典型的保守區(qū)域 Asp Val Val Ala Asn His、Asp Gly Leu Arg lie Asp Thr Val Lys His Val.Gly Glu Val Leu Ser 禾口 Phe lie Asp Asn His Asp。(2)將該淀粉酶編碼基因插入表達載體(pPIC9K-W jO，通過電轉化方式導入相 應的表達宿主(黑曲霉或酵母菌株)中得到相應的重組體細胞；
(3)對重組體細胞進行發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)微孔濾膜過濾去除菌體，微濾液再通過超濾膜濃 縮，以制備真菌a-淀粉酶RoAmy。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下特點
1、本發(fā)明在制備超高麥芽糖漿過程中，在糖化步驟中只使用一種真菌a-淀粉酶 RoAmy,麥芽糖濃度可達65%-75%，幾乎不含有麥芽三糖和其它低聚糖，與常規(guī)超高麥芽糖漿 的制備工藝相比，不需要其它酶制劑的協(xié)同作用，具有工藝簡單、生產成本低等特點。2、本發(fā)明中提供了一種特殊的米根霉來源的真菌a-淀粉酶RoAmy的制備方法，通 過該酶制劑將淀粉質糖化后，可直接制備超高麥芽糖漿，且產物中幾乎不含有麥芽三糖和 其它低聚糖，與傳統(tǒng)麥芽糖漿制備工藝中使用的米曲霉來源的真菌淀粉酶相比，具有麥 芽糖生成能力強，產物相對單一等特點。


圖1 酵母表達真菌a-淀粉酶RoAmy的表達載體；
圖2 重組酵母表達真菌a_淀粉酶RoAmy的蛋白質電泳圖譜；
4圖3 重組真菌a-淀粉酶RoAmy的最適反應溫度； 圖4 重組真菌a-淀粉酶RoAmy的最適反應pH ； 圖5 重組真菌a-淀粉酶RoAmy的熱穩(wěn)定性測定； 圖6 重組真菌a-淀粉酶RoAmy的pH穩(wěn)定性測定。
具體實施例方式實施例1 超高麥芽糖漿的制備
液化將100千克玉米淀粉，調制成濃度為10%-30%的淀粉乳，調整PH為4. 5-6. 5，加 熱至95-105°C，添加耐高溫酸性a-淀粉酶，淀粉酶用量為2_8 LU/g干淀粉，液化10-25分 鐘，135°C滅酶5分鐘，控制DE值在1-8之間；
糖化液化后冷卻至55-65°C，加入真菌a_淀粉酶RoAmy，用量為4_15 U/g干淀粉，期 間使用高壓液相色譜(HPLC)法測定葡萄糖、麥芽糖及其它低聚糖生成量，糖化30-60小時 后，經(jīng)脫色、離子交換、真空濃縮至濃度70%-80%，制得125-140千克麥芽糖含量為65%_75% 的超高麥芽糖糖漿。實施例2 真菌a-淀粉酶RoAmy的克隆 提取米根霉組織總RNA，以如下寡核苷酸為引物
上游引物5，-ATCATGAAGTCTTTCTTAAGTCTCCTTTGCA-3，， 下游引物5，-CTGCCCGGGTTATTTCTTTTGGAA-3，
使用反轉錄PCR試劑盒擴增得到大小為1. 4 kb的RoAiw基因的cDNA片段，回收并克 隆入pMD19，在大腸桿菌JM109中構建得到重組質粒pMD_W _F，提取重組質粒并使用T-載 體通用引物測序，確定基因cDNA序列，為SEQ ID N0:1。實施例3 酵母表達真菌a_淀粉酶RoAmy載體的構建 以重組質粒pMD-/fo▲嘆為模板，以如下寡核苷酸為引物
上游引物5，-ATCATGAAGTCTTTCTTAAGTCTCCTTTGCA-3，， 下游引物5，-CTGCCCGGGTTATTTCTTTTGGAA-3，
使用高保真DNA聚合酶(/￥i/DNA polymerase)擴增得到基因片段，回收基 因片段，以平端方式正向插入PPIC9K載體(來自Invitrogen公司)的位點，得到酵母 表達載體pPIC9K-W _F。實施例4 表達真菌淀粉酶RoAmy重組酵母的構建
接種畢赤酵母菌株 PicAia pas tor is GS115 (來自 Invitrogen 公司)于 100 mL YEPD 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0D_=1. 5，離心收集菌體并使用冰預冷的無菌水洗滌兩次，再使用冰預冷 的1 M山梨醇洗滌兩次。離心后使用0.3 mL冰預冷的1 M山梨醇懸浮置于冰上，作為感 受態(tài)細胞備用。提取重組質粒pPIC9K_W _F，使用份《I酶切線性化，使用質粒純化試劑盒純化酶 切產物。取2-10 mL純化后的線性化質粒加入50 mL感受態(tài)細胞，冰上放置5-10分鐘后使 用BTX電轉化儀電擊，條件為7. 5 Kv, 25 mF, 10 ms。電擊后立即加入1 mL預冷的1 M山 梨醇，取200 mL涂布MD培養(yǎng)基(1. 34%YNB，2%葡萄糖)，30°C培養(yǎng)至轉化子出現(xiàn)。挑取轉化 子并點種至MD-G418培養(yǎng)基(在MD培養(yǎng)基中加入抗生素G418至終濃度為5 mg/mL),30°C 培養(yǎng)48小時后分別點種至MMS-G418培養(yǎng)基(1. 34%ΥΝΒ, 0. 5%甲醇，0. 5%可溶性淀粉)，培養(yǎng)
548小時后使用稀碘液染色，選取生長情況良好并具有較強透明圈形成能力的菌落進行產真 菌a-淀粉酶RoAmy搖瓶發(fā)酵實驗，以進一步篩選淀粉酶高產菌株。實施例5 重組真菌a_淀粉酶RoAmy的制備
通過搖瓶發(fā)酵篩選出一株高表達真菌淀粉酶RoAmy的重組酵母，在15 L氣升式 發(fā)酵罐中發(fā)酵，種子及發(fā)酵用培養(yǎng)基成分為1%酵母膏，2%蛋白胨，1%-4%甘油，接種量為 6%-10%。發(fā)酵過程中，溫度控制在28-30°C，pH控制在5. 5-6. O，通過控制溶氧(彡20%)調 整甲醇流加速度，以誘導重組淀粉酶表達。發(fā)酵至100-140小時結束發(fā)酵。收集發(fā)酵液，經(jīng) 0. 45 mm微孔濾膜除去酵母菌體，經(jīng)10 kDa超濾膜濃縮，制備獲得重組真菌a_淀粉酶RoAmy 制品。實施例6 重組真菌a_淀粉酶RoAmy酶學特性研究 重組酶的最適反應溫度
將重組酶稀釋至合適濃度，在0.04 M，pH 5.0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖體系中，分別在 20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70°C溫度下測定酶活力，計算相對酶活力確定酶反應最 適溫度。在該反應條件下測定得到重組酶的最適反應溫度為60°C。重組酶的最適反應pH
將重組酶稀釋至合適濃度，在50°C溫度下，分別在0.04 M甘氨酸-鹽酸緩沖液 (pH 3. 0、3. 5)，0. 04 M 檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH 4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、6. 5)，0. 04 M Tris-鹽酸緩沖液(pH 7.0、7.5、8.0)中進行酶活力測定，計算相對酶活力，確定該酶的最 適反應PH為4. 5-6. 5。重組酶熱穩(wěn)定性測定
用0. 04 Μ,ρΗ 5. 0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液將重組酶稀釋至合適濃度，分別在40、50、 55、60、70°C溫度下保溫0-20分鐘，立即取出冰上放置30分鐘后測定酶活力，計算相對酶活 力確定該酶的熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)該酶在55°C以下相對比較穩(wěn)定。重組酶pH穩(wěn)定性測定
分別使用0.2 M甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH 3. 0,3. 5), 0.2 M檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH
4.0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、6. 5)，0. 2 M Tris-鹽酸緩沖液(pH 7. 0、7. 5、8. 0)將重組酶稀釋至 合適濃度，在50°C溫度下保溫20分鐘，立即取出冰上放置30分鐘，使用0. 2 M檸檬酸-磷 酸鹽緩沖液稀釋10倍后測定酶活力，計算相對酶活力確定該酶的pH穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)該酶在pH
5.0-6. 0之間穩(wěn)定性較好。實施例7 重組真菌a_淀粉酶RoAmy與商品真菌a_淀粉酶水解淀粉產麥芽糖的 比較
使用0. 04 M, pH 5. 0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液配制2%玉米淀粉乳，煮沸糊化后冷卻 至50°C，分別取1 mL糊化淀粉并分別加入0. 1 U真菌a-淀粉酶RoAmy及0. 1 U商品真菌 a-淀粉酶，于50°C溫度下保溫10-20 h，使用高壓液相色譜(HPLC)法測定產物中各組分比 例。表 1如表1所示，當使用真菌a-淀粉酶RoAmy水解時，隨著水解時間的延長，反應液中麥芽 三糖量逐漸減少至消失，同時麥芽糖量逐漸積累；當使用商品真菌a-淀粉酶水解時，隨著 水解時間的延長，反應液中麥芽三糖量出現(xiàn)增加趨勢，但是麥芽糖量逐漸減少，同時有大量
葡萄糖生成。
序 列 表
<110>江蘇銳陽生物科技有限公司<120>一種超高麥芽糖漿的制備方法及其專用酶制劑<160>4<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>1atcatgaagt ctttcttaag tctcctttgca31<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>2ctgcccgggt tatttctttt ggaa24<210>3，SEQ ID NO:1<211>1389<212>DNA<213>米根霉<220><221>gene<222>(1). · (1389)<400>3atgaagtctt tcttaagtct cctttgcagcgtcttccttttacccttagtcgtacaatct60gtgcctgtca tcaagcgagc ctcggccagcgactgggagaacagagtcatttaccaattg120ttaactgatc gatttgcaaa atcgactgatgataccaatggctgctctaacctgagtgat180tactgtggcg gaacatttca aggaatcattaatcacttggattacattgccggaatggga240tttgatgctatctggatatcacctatccccaaaaatgtgaatggaggttaccatggctat300tgggcttctgacttttctcaaataaatgagcattttggaactgctgatgacttgaaaaag360ttggttgcggctgctcatgcaaagaacatgtacgttatgctggacgttgttgctaatcat420gctggcactccttcatcaggcggcgactattctggctacacgttcggtcaaagctctgaa480taccacagagcctgtgatatC 3.3.3. C 3.3. Cgaccagaactctattgaacagtgctggatt540tctggtttgcctgatatcaacactgaagactcggccattgttagcaaattgaattcgatt600gtttctggttgggtatctgactatggctttgatggtcttcgaatcgatactgtgaagcac660gttcgtaaagatttctgggatggttatgtctctgctgctggtgtatttgctaccggagaa720gtgcttagcggcgatgtttcttatgtctcaccctatcagcagcatgttccttctttaatc780aactatccattgtattatccagtctatgatgtattcaccaaatcccgtaccatgagccgt840ttaagttctggcttttctga 3. 3.3.3.3.3. ggaaactttaaaaacattgatgtcttggtc900aactttattgacaatcacgatcaacctcgcttgttatccaaagctgatcaaagtctcgtc960aagaatgctcttgcttattctttcatggtccaaggtatccctgtcttgtactatggtaca1020gagcaatctttcaagggtggtaacgatccaaacaacagagaggtcttatggaccactggt1080tactcgaccacgtctgatatgtacaagtttgtcactactcttgtcaaggcacgcaagggc1140tcaaactccacagtaaatatgggaattgctcaaaccgataacgtctatgtgttccaaaga1200ggcggctctctggttgttgtC 3.3. C 3.3. C 3. ggtcaaggatC 3.3. C 3.3.3. C 3. Caattactgta1260aaggctggctcgttctctaatggagatactttgactgatgtgttctccaacaaatctgtt1320actgttcaaaataatcagatcacattccaattgcagaatggaaaccctgccatattccaa1380aagaactaa1389
<210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <400> Met Lys
4，SEQ ID NO:2
462
PRT
RoAmy
preprotien (1).. (462)
4
Ser Phe Leu 15
Leu Val Val Gln Ser 20
Asp Trp Glu Asn Arg 35
Ala Lys Ser Thr Asp 50
Tyr Cys Gly Gly Thr 65
Ser Leu Leu Cys Val Pro Val lie Val lie Tyr Gln Asp Thr Asn Gly Phe Gln Gly lie
Ser 10 Lys 25 Leu 40 Cys 55 lie 70
Val Arg Leu Ser Asn
Phe Ala Thr Asn His
Leu Ser Asp Leu Leu
Leu Ala Arg Ser Asp
Pro 15 Ser 30 Phe 45 Asp 60 Tyr 75Ile Lys Ser Leu Val Ser Asp Ser Lys Asp Trp Val Val Val Ile Asn Asp Gln Gly
Ala Asn Gln Val Val Gly Ile Gly Leu Gly Asp Leu Pro Phe Ser Phe Gln Gly Gly
Gly Met Val Asn lie Asn Ala Ala Ala Asn Tyr Thr Asn Tyr Leu Pro Asn Ser Leu Arg Gly Tyr Ser Gly Ser Leu Thr Lys Asp Lys lie Asp Ser Leu lie Pro Asn Asp
Gly 80 Gly 95 Glu 110 Ala 125 His 140 Phe 155 Asn 170 Asp 185 lie 200 lie 215 Val 230 Asp 245 lie 260 Ser 275 Asn 290 Asn 305 Val 320 Val 335 Pro 350
Phe Gly His His Ala Gly Asp lie Val Asp Ser Val Asn Arg Gly His Lys Leu Asn
Asp Tyr Phe Ala Gly Gln Gln Asn Ser Thr Ala Ser Tyr Thr Asn Asp Asn Tyr Asn
Ala lie His Gly Gly Thr Lys Asn Thr Pro Ser Ser Asn Ser Thr Glu Gly Trp Val Lys Ala Gly Tyr Val Pro Leu Met Ser Phe Lys Gln Pro Ala Leu Tyr Gly Arg Glu
Trp 85 Tyr 100 Ala 115 Met 130 Ser 145 Glu 160 lie 175 Asp 190 Val 205 His 220 Val 235 Ser 250 Tyr 265 Arg 280 Asn 295 Arg 310 Ala 325 Thr 340 Val 355
lie Trp Asp Tyr Ser Tyr Glu Ser Ser Val Phe Pro Tyr Leu lie Leu Tyr Glu Leu
Ser Ala Asp Val Gly His Gln Ala Asp Arg Ala Tyr Pro Ser Asp Leu Ser Gln Trp
Pro lie Ser Asp Leu Lys Met Leu Gly Asp Arg Ala Cys Trp lie Val Tyr Gly Lys Asp Thr Gly Gln Gln Val Tyr Ser Gly Val Leu Ser Lys Phe Met Ser Phe Thr Thr
Pro 90 Phe 105 Lys 120 Asp 135 Tyr 150 Cys 165 lie 180 Ser 195 Phe 210 Phe 225 Glu 240 His 255 Asp 270 Phe 285 Val 300 Ala 315 Val 330 Lys 345 Gly 360TyrSerThrThrSerAspMet Tyr Lys PheValThrThrLeuVal365370375LysAlaArgLysGlySerAsn Ser Thr ValAsnMetGlylieAla380385390GlnThrAspAsnValTyrVal Phe Gln ArgGlyGlySerLeuVal395400405ValValAsnAsnTyrGlyGln Gly Ser ThrAsnThrlieThrVal410415420LysAlaGlySerPheSerAsn Gly Asp ThrLeuThrAspValPhe425430435SerAsnLysSerValThrVal Gln Asn AsnGlnlieThrPheGln440445450LeuGlnAsnGlyAsnProAla lie Phe GlnLysAsn455460462
10
權利要求
一種制備超高麥芽糖漿的專用酶制劑真菌a 淀粉酶RoAmy，其特征在于，通過基因工程手段構建重組體細胞實現(xiàn)來源于米根霉ATCC9363的一種真菌a 淀粉酶基因的過量表達，其基因編碼為SEQ ID NO: 1。
2.一種利用權利要求1所述真菌淀粉酶RoAmy制備超高麥芽糖漿的方法，其特征 在于以植物淀粉質為原料，利用真菌淀粉酶RoAmy進行糖化而直接獲得超高麥芽糖漿； 工藝為1)液化在質量濃度為10%-30%、pH為4.5-6. 5的淀粉乳中加入耐高溫酸性淀粉酶， 酸性a-淀粉酶用量為2-8 LU/g干淀粉，于95-105°C液化10-25分鐘，135°C滅酶5分鐘， DE值控制在1-8之間；2)糖化液化后冷卻至55-65°C，加入真菌a-淀粉酶RoAmy，用量為4_15U/g干淀粉， 糖化30-60小時，經(jīng)脫色、離子交換、真空濃縮，得到質量濃度65%-75%的超高麥芽糖漿，其 中葡萄糖含量為7%-13%，幾乎不含麥芽三糖和其它低聚糖。
全文摘要
一種超高麥芽糖漿的制備方法及其專用酶制劑，屬于淀粉糖生成技術和微生物基因工程技術領域。用本發(fā)明提供的真菌a-淀粉酶RoAmy，以各種植物淀粉質為原料，淀粉乳經(jīng)耐高溫酸性a-淀粉酶液化后，冷卻至55-65℃，調整pH為4.5-6.5，加入真菌a-淀粉酶RoAmy，保溫30-60小時，制得65%-75%的超高麥芽糖漿；所用真菌a-淀粉酶RoAmy，其基因來源于米根霉，通過基因工程手段獲得重組的真菌a-淀粉酶RoAmy。本發(fā)明還提供了RoAmy基因用酵母進行高效制備的方法。用真菌a-淀粉酶RoAmy對淀粉進行糖化獲得超高麥芽糖漿，與傳統(tǒng)的超高麥芽糖制備方法相比較，具有工藝簡單，成本低廉，利于放大等優(yōu)點。
文檔編號C12N15/56GK101974501SQ20101050676
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月14日 優(yōu)先權日2010年10月14日
發(fā)明者李松, 王正祥, 石貴陽 申請人:江蘇銳陽生物科技有限公司