專利名稱：染色體制備方法及所需培養(yǎng)基及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)、生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中一種有效的染色體分子試劑材料， 具體涉及染色體疾病診斷的一種染色體制備方法及所需培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
染色體是遺傳物質(zhì)即基因的載體，人類每個細胞中有46條染色體，其中44條常染色體，2條性染色體。無論是常染色體，還是性染色體，它們都攜帶著上千個基因，所以，染色體數(shù)目或微小的結(jié)構(gòu)異常，都將引起許多基因的增加或缺失，而產(chǎn)生多種畸形或異常的綜合征。染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常所引起的疾病叫做染色體病，染色體病常以綜合征的形式存在。染色體病是一種常見的遺傳病，無論是染色體數(shù)目異常還是染色體結(jié)構(gòu)異常都可導(dǎo)致先天畸形、智力低下、流產(chǎn)、不孕、生長發(fā)育障礙等，嚴重地危害著人們的身心健康。染色體檢查主要用于病情診斷。臨床凡是發(fā)現(xiàn)有明顯的生長發(fā)育異常、多發(fā)畸形、 皮膚紋理異常、生殖系統(tǒng)發(fā)育異常等，需要明確是不是染色體存在缺陷或者異常；懷疑有唐氏綜合征的個體及其雙親，由遺傳引起的智力低下者；原因不明的反復(fù)的自然流產(chǎn)、胎兒發(fā)育畸形、胚胎或者胎兒停止發(fā)育、曾經(jīng)出生的新生兒死亡，這樣的夫婦需要檢查染色體；從來沒有月經(jīng)來潮，長期不能正常懷孕、幼稚子宮、先天性睪丸發(fā)異常、無精子癥或者精子發(fā)育等嚴重異常、生殖器官發(fā)育異常等，需要檢查染色體確診。染色體檢查比較簡單，目前我國一般的縣以上醫(yī)院都可以檢查。檢查的方法是采用細胞培養(yǎng)顯帶技術(shù)。當懷疑雙方都有可能存在問題時夫婦兩人都要檢查。檢查結(jié)果男性應(yīng)該為46XY，而女性則是46XX，除此之外的結(jié)果都是異常的、病態(tài)的。目前臨床常用染色體檢查方法有熒光原位雜交技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、引物原位標記技術(shù)、核型分析技術(shù)。鑒于核型分析技術(shù)成本低、準確性高等特點，為大、中型醫(yī)院廣為所用。但是，國內(nèi)各醫(yī)院和實驗室進行染色體檢查所用的培養(yǎng)基沒有統(tǒng)一標準，質(zhì)量極不穩(wěn)定，由其培養(yǎng)的染色體分裂相數(shù)目少且染色體不夠細長，不便于臨床染色體檢查分析以及科研，常導(dǎo)致無法進行染色體分析，影響疾病的診斷。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種質(zhì)量穩(wěn)定，由其培養(yǎng)的染色體分裂相數(shù)目眾多且染色體細長，便于臨床染色體檢查分析以及科研使用的用于染色體制備的培養(yǎng)基及其制備方法。為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種用于染色體制備的培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟步驟一，制備初始溶液，所述初始溶液配方如下RPMI1640 10-1 lg/L、肝素鈉6400_7000IU、HEPES :1. 19-4. 05g/L、L-谷氨酰胺0.5-0. 6g/L、NaHC03 l_2g/L、青霉素 G 鉀0. 05-0. lg/L、硫酸鏈霉素0. 06-0. lg/L、牛血清100-200ml/L、注射用水加至1L，攪拌均勻至澄清溶液；步驟二，過濾除菌，用濾膜將上述初始溶液進行過濾除菌；步驟三，配制植物血球凝集素PHA溶液，用注射用水配制2%植物血球凝集素PHA 溶液，備用；步驟四，培養(yǎng)基配制，在過濾后的初始溶液中加入所述植物血球凝集素PHA溶液 50-200mg/L,攪拌均勻，制得培養(yǎng)基。優(yōu)選的，增加以下步驟步驟五分裝將步驟四所述的溶液分裝到西林瓶中，加蓋密封。步驟六貼簽將步驟五所述的產(chǎn)品貼簽，即形成染色體培養(yǎng)基。一種用于染色體制備的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基的配方為RPMI1640 :10_llg/L、肝素鈉:6400-7000IU,HEPES :1. 19-4. 05g/L、L_ 谷氨酰胺0. 5-0. 6g/L、NaHC03 :l_2g/L、青霉素 G鉀0. 05-0. lg/L、硫酸鏈霉素0. 06-0. lg/L、牛血清100_200ml/L、植物血球凝集素PHA 50-200mg/L、注射用水加至1L。優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基的配方為=RPMI 1640 10. 2-10. 6g/L、肝素鈉:6400_6500IU、 HEPES :2-4g/L、L-谷氨酰胺0. 5-0. 6g/L、NaHC03 :l_2g/L、青霉素 G 鉀0. 05-0. lg/L、硫酸鏈霉素0. 07-0. 09g/L、牛血清150-200ml/L、植物血球凝集素PHA :50_200mg/L、注射用水加至IL0優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基的配方為RPMI1640 :10. 4g/L、肝素鈉6400IU、HEPES
1.19-4. 05g/L、L-谷氨酰胺0. 6g/L、NaHC03 :2g/L、青霉素 G 鉀0. lg/L、硫酸鏈霉素 0. 08g/L、牛血清200ml/L、植物血球凝集素PHA :50-200mg/L、注射用水加至1L。一種染色體制備方法，包括以下步驟步驟一，培養(yǎng)基制備，按照權(quán)利要求1所述方法制備培養(yǎng)基；步驟二，細胞培養(yǎng)，將人體外周血0. 3ml-0. 4ml種入所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在終止培養(yǎng)前2. 5小時加入濃度為0. lug/ml的秋水仙酰胺，使細胞停止于分裂中期，經(jīng)過68-72小時細胞培養(yǎng)后收獲細胞；步驟三，制備細胞懸液，再經(jīng)過0. 075mol/L的KCL低滲液低滲40min，預(yù)固定后經(jīng)三次固定，制備細胞懸液，用于染色體制備；步驟四，制片，即制備染色體標本，用滴管打勻細胞懸液，吸取少量從20-30cm高處滴至經(jīng)冰水浸泡過的潔凈無脂的玻片上，每片滴2-3滴，滴完后在酒精燈火焰上來回數(shù)次，使其干燥，制得染色體標本；步驟五，根據(jù)診斷需要將上述染色體標本進行染色體顯帶分析或非顯帶分析。優(yōu)選的，所述細胞培養(yǎng)包括以下步驟第一步，采血，人體靜脈取血，肝素抗凝；第二步，種血，準備染色體培養(yǎng)基，恢復(fù)至室溫，將注射器的針頭穿過培養(yǎng)瓶的膠塞向每瓶培養(yǎng)基中加入0. 3-0. 4ml全血，立即搖勻，放入37°C恒溫培養(yǎng)箱，第三步，細胞培養(yǎng)，種血后每天早晚各搖勻一次，細胞培養(yǎng)后第三天終止培養(yǎng)，整個培養(yǎng)時間為68-7 ；第四步，阻留中期分裂相，終止培養(yǎng)前2. 5h加入秋水仙酰胺，秋水仙酰胺終濃度為0. lug/ml搖勻，繼續(xù)放入37°C恒溫培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)至68h_72h ；第五步，收獲細胞，從37°C恒溫培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)基，搖勻，將培養(yǎng)物倒入尖底離心管，1000轉(zhuǎn)/min，離心lOmin，離心結(jié)束后，吸去上清液，只保留血液標本Iml左右。優(yōu)選的，所述制備細胞懸液包括以下步驟第一步，低滲，在上述離心管中加入預(yù)溫至37°C的0. 075mol/LKCL低滲液液6 8ml，用滴管吹打均勻后置37°C水浴鍋低滲40min ；第二步，預(yù)固定，按照冰醋酸甲醇=1 3配制固定液，低滲結(jié)束后，沿著離心管壁加入固定液1ml，吹打混勻后，1000轉(zhuǎn)/min,離心IOmin ；第三步，第一次固定，吸去上清液，沿著離心管壁加入7ml固定液，用滴管吹打混勻后放置30分鐘以上，1000轉(zhuǎn)/min，離心IOmin ；第四步，第二次固定，吸去上清液，保留1. 5ml。加入7ml固定液，用滴管吹打混勻后放置15分鐘以上，1000轉(zhuǎn)/min，離心IOmin ；第五步，第三次固定，倒掉上清液，加入7ml固定液，用滴管吹打混勻后放置15分鐘以上，1000轉(zhuǎn)/min，離心IOmin ；第六步，細胞懸液的制備和保存，吸去上清液，加入固定液適量，輕輕打勻，制成濃度適宜的細胞懸液。采用本技術(shù)方案的有益效果是生產(chǎn)的培養(yǎng)基質(zhì)量穩(wěn)定，由其培養(yǎng)的染色體分裂相數(shù)目眾多且染色體細長，便于臨床染色體檢查分析以及科研使用。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖
和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細的說明。實施例1，一種用于染色體制備的培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟步驟一，制備初始溶液，所述初始溶液配方如下RPMI1640 :10g/L、肝素鈉:7000IU、HEPES :1. 19g/L、L_ 谷氨酰胺0. 6g/L、NaHC03 lg/L、青霉素G鉀0. lg/L、硫酸鏈霉素0. 06g/L、牛血清200ml/L、注射用水加至1L，攪拌均勻至澄清溶液；步驟二，過濾除菌，用濾膜將上述初始溶液進行過濾除菌；步驟三，配制植物血球凝集素PHA溶液，用注射用水配制2 %植物血球凝集素PHA 溶液，備用；步驟四，培養(yǎng)基配制，在過濾后的初始溶液中加入所述植物血球凝集素PHA溶液 50mg/L,攪拌均勻，制得培養(yǎng)基。步驟五分裝將步驟四所述的溶液分裝到西林瓶中，加蓋密封。步驟六貼簽將步驟五所述的產(chǎn)品貼簽，即形成染色體培養(yǎng)基。實施例2，
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一種用于染色體制備的培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟步驟一，制備初始溶液，所述初始溶液配方如下RPMI1640 :llg/L、肝素鈉6400IU、HEPES :4. 05g/L、L_ 谷氨酰胺0. 5g/L、NaHC03 2g/L、青霉素G鉀0. 05g/L、硫酸鏈霉素0. lg/L、牛血清100ml/L、注射用水加至1L，攪拌均勻至澄清溶液；步驟二，過濾除菌，用濾膜將上述初始溶液進行過濾除菌；步驟三，配制植物血球凝集素PHA溶液，用注射用水配制2 %植物血球凝集素PHA 溶液，備用；步驟四，培養(yǎng)基配制，在過濾后的初始溶液中加入所述植物血球凝集素PHA溶液 200mg/L,攪拌均勻，制得培養(yǎng)基。步驟五分裝將步驟四所述的溶液分裝到西林瓶中，加蓋密封。步驟六貼簽將步驟五所述的產(chǎn)品貼簽，即形成染色體培養(yǎng)基。實施例3，一種用于染色體制備的培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟步驟一，制備初始溶液，所述初始溶液配方如下RPMI1640 :10. 5g/L、肝素鈉6600IU、HEPES :3g/L、L_ 谷氨酰胺0. 55g/L、NaHC03 1.5g/L、青霉素G鉀0. 08g/L、硫酸鏈霉素0. 08g/L、牛血清150ml/L、注射用水加至1L， 攪拌均勻至澄清溶液；步驟二，過濾除菌，用濾膜將上述初始溶液進行過濾除菌；步驟三，配制植物血球凝集素PHA溶液，用注射用水配制2%植物血球凝集素PHA 溶液，備用；步驟四，培養(yǎng)基配制，在過濾后的初始溶液中加入所述植物血球凝集素PHA溶液 120mg/L,攪拌均勻，制得培養(yǎng)基。步驟五分裝將步驟四所述的溶液分裝到西林瓶中，加蓋密封。步驟六貼簽將步驟五所述的產(chǎn)品貼簽，即形成染色體培養(yǎng)基。實施例4，—種用于染色體制備的培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟步驟一，制備初始溶液，所述初始溶液配方如下所述培養(yǎng)基的配方為RPMI1640:10. 4g/L、肝素鈉:6400IU、HEPES :1. 19-4. 05g/ L、L-谷氨酰胺:0. 6g/L、NaHC03 :2g/L、青霉素G鉀0. lg/L、硫酸鏈霉素0. 08g/L、牛血清 200ml/L、注射用水加至1L，攪拌均勻至澄清溶液；步驟二，過濾除菌，用濾膜將上述初始溶液進行過濾除菌；步驟三，配制植物血球凝集素PHA溶液，用注射用水配制2 %植物血球凝集素PHA 溶液，備用；步驟四，培養(yǎng)基配制，在過濾后的初始溶液中加入所述植物血球凝集素PHA溶液50-200mg/L,攪拌均勻，制得培養(yǎng)基。步驟五分裝將步驟四所述的溶液分裝到西林瓶中，加蓋密封。步驟六貼簽將步驟五所述的產(chǎn)品貼簽，即形成染色體培養(yǎng)基。本實施例是最優(yōu)的方案。實施例5，一種用于染色體制備的培養(yǎng)基配方為RPMI1640 :10g/L、肝素鈉7000IU、HEPES 1. 19g/L、L-谷氨酰胺0. 6g/L、NaHC03 :lg/L、青霉素 G 鉀0. lg/L、硫酸鏈霉素0. 06g/L、 牛血清200ml/L、植物血球凝集素PHA :50mg/L、注射用水加至1L。本發(fā)明的培養(yǎng)基使用方便，操作簡單，成本低，患者檢測費低，適合于各級醫(yī)院用于遺傳診斷、不孕不育及產(chǎn)前診斷。實施例6，一種用于染色體制備的培養(yǎng)基配方為RPMI1640 :1 lg/L、肝素鈉6400IU、HEPES 4. 05g/L、L-谷氨酰胺0. 5g/L、NaHC03 :2g/L、青霉素 G 鉀0. 05g/L、硫酸鏈霉素:0. lg/L、 牛血清100ml/L、植物血球凝集素PHA :200mg/L、注射用水加至1L。實施例7，一種用于染色體制備的培養(yǎng)基配方為=RPMI 1640 :10. 5g/L、肝素鈉:6600IU、 HEPES :3g/L、L-谷氨酰胺0. 55g/L、NaHC03 :1. 5g/L、青霉素 G 鉀:0. 08g/L、硫酸鏈霉素 0. 08g/L、牛血清150ml/L、植物血球凝集素PHA 150mg/L、注射用水加至1L。實施例8，一種用于染色體制備的培養(yǎng)基配方為=RPMI 1640 :10. 2g/L、肝素鈉:6500IU、 HEPES :2g/L、L-谷氨酰胺0. 6g/L、NaHC03 lg/L、青霉素 G 鉀0. lg/L、硫酸鏈霉素0. 07g/ L、牛血清200ml/L、植物血球凝集素PHA :50mg/L、注射用水加至1L。實施例9，一種用于染色體制備的培養(yǎng)基配方為RPMI1640 :10. 6g/L、肝素鈉6400IU、 HEPES :4g/L、L-谷氨酰胺:0. 5g/L、NaHC03 :2g/L、青霉素 G 鉀0. 05g/L、硫酸鏈霉素 0. 09g/L、牛血清150ml/L、植物血球凝集素PHA :200mg/L、注射用水加至1L。實施例10，一種用于染色體制備的培養(yǎng)基配方為RPMI1640 :10. 4g/L、肝素鈉6450IU、 HEPES :3g/L、L-谷氨酰胺:0. 55g/L、NaHC03 :1. 5g/L、青霉素 G 鉀:0. 055g/L、硫酸鏈霉素 0. 08g/L、牛血清180ml/L、植物血球凝集素PHA 180mg/L、注射用水加至1L。實施例11，一種用于染色體制備的培養(yǎng)基配方為RPMI1640 :10. 4g/L、肝素鈉6400IU、 HEPES :1. 19-4. 05g/L、L-谷氨酰胺:0. 6g/L、NaHC03 :2g/L、青霉素 G 鉀:0. lg/L、硫酸鏈霉素0. 08g/L、牛血清200ml/L、植物血球凝集素PHA :50-200mg/L、注射用水加至1L。實施例12，一種染色體制備方法，包括以下步驟步驟一，培養(yǎng)基制備，按照權(quán)利要求1所述方法制備培養(yǎng)基；
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步驟二，細胞培養(yǎng)，包括以下五步第一步，采血，人體靜脈取血，肝素抗凝；第二步，種血，準備染色體培養(yǎng)基，恢復(fù)至室溫，將注射器的針頭穿過培養(yǎng)瓶的膠塞向每瓶培養(yǎng)基中加入0. 3ml全血，立即搖勻，放入37°C恒溫培養(yǎng)箱，第三步，細胞培養(yǎng)，種血后每天早晚各搖勻一次，細胞培養(yǎng)后第三天終止培養(yǎng)，整個培養(yǎng)時間為68h ；第四步，阻留中期分裂相，終止培養(yǎng)前2. 5h加入秋水仙酰胺，秋水仙酰胺終濃度為0. lug/ml搖勻，繼續(xù)放入37°C恒溫培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)至68h ；第五步，收獲細胞，從37°C恒溫培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)基，搖勻，將培養(yǎng)物倒入尖底離心管，1000轉(zhuǎn)/min，離心lOmin，離心結(jié)束后，吸去上清液，只保留血液標本Iml左右。步驟三，制備細胞懸液，所述制備細胞懸液包括以下步驟第一步，低滲，在上述離心管中加入預(yù)溫至37°C的0. 075mol/LKCL低滲液液6ml， 用滴管吹打均勻后置37°C水浴鍋低滲40min ；第二步，預(yù)固定，按照冰醋酸甲醇=1 3配制固定液，低滲結(jié)束后，沿著離心管壁加入固定液1ml，吹打混勻后，1000轉(zhuǎn)/min,離心IOmin ；第三步，第一次固定，吸去上清液，沿著離心管壁加入7ml固定液，用滴管吹打混勻后放置30分鐘以上，1000轉(zhuǎn)/min，離心IOmin ；第四步，第二次固定，吸去上清液，保留1.5ml。加入7ml固定液，用滴管吹打混勻后放置15分鐘以上，1000轉(zhuǎn)/min，離心IOmin ；第五步，第三次固定，倒掉上清液，加入7ml固定液，用滴管吹打混勻后放置15分鐘以上，1000轉(zhuǎn)/min，離心IOmin ；第六步，細胞懸液的制備和保存，吸去上清液，加入固定液適量，輕輕打勻，制成濃度適宜的細胞懸液。步驟四，制片，即制備染色體標本，用滴管打勻細胞懸液，吸取少量從20cm高處滴至經(jīng)冰水浸泡過的潔凈無脂的玻片上，每片滴2滴，滴完后在酒精燈火焰上來回數(shù)次，使其干燥，制得染色體標本；步驟五，根據(jù)診斷需要將上述染色體標本進行染色體顯帶分析或非顯帶分析。實施例13，一種染色體制備方法，包括以下步驟步驟一，培養(yǎng)基制備，按照權(quán)利要求1所述方法制備培養(yǎng)基；步驟二，細胞培養(yǎng)，包括以下五步第一步，采血，人體靜脈取血，肝素抗凝；第二步，種血，準備染色體培養(yǎng)基，恢復(fù)至室溫，將注射器的針頭穿過培養(yǎng)瓶的膠塞向每瓶培養(yǎng)基中加入0. 4ml全血，立即搖勻，放入37°C恒溫培養(yǎng)箱，第三步，細胞培養(yǎng)，種血后每天早晚各搖勻一次，細胞培養(yǎng)后第三天終止培養(yǎng)，整個培養(yǎng)時間為72h ；第四步，阻留中期分裂相，終止培養(yǎng)前2. 5h加入秋水仙酰胺，秋水仙酰胺終濃度為0. lug/ml搖勻，繼續(xù)放入37°C恒溫培養(yǎng)箱，繼培養(yǎng)至72h ；第五步，收獲細胞，從37°C恒溫培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)基，搖勻，將培養(yǎng)物倒入尖底離心管，1000轉(zhuǎn)/min，離心lOmin，離心結(jié)束后，吸去上清液，只保留血液標本Iml左右。步驟三，制備細胞懸液，所述制備細胞懸液包括以下步驟第一步，低滲，在上述離心管中加入預(yù)溫至37°C的0. 075mol/LKCL低滲液液6 8ml，用滴管吹打均勻后置37°C水浴鍋低滲40min ；第二步，預(yù)固定，按照冰醋酸甲醇=1 3配制固定液，低滲結(jié)束后，沿著離心管壁加入固定液1ml，吹打混勻后，1000轉(zhuǎn)/min,離心IOmin ；第三步，第一次固定，吸去上清液，沿著離心管壁加入7ml固定液，用滴管吹打混勻后放置30分鐘以上，1000轉(zhuǎn)/min，離心IOmin ；第四步，第二次固定，吸去上清液，保留1. 5ml。加入7ml固定液，用滴管吹打混勻后放置15分鐘以上，1000轉(zhuǎn)/min，離心IOmin ；第五步，第三次固定，倒掉上清液，加入7ml固定液，用滴管吹打混勻后放置15分鐘以上，1000轉(zhuǎn)/min，離心IOmin ；第六步，細胞懸液的制備和保存，吸去上清液，加入固定液適量，輕輕打勻，制成濃度適宜的細胞懸液。步驟四，制片，即制備染色體標本，用滴管打勻細胞懸液，吸取少量從30cm高處滴至經(jīng)冰水浸泡過的潔凈無脂的玻片上，每片滴3滴，滴完后在酒精燈火焰上來回數(shù)次，使其干燥，制得染色體標本；步驟五，根據(jù)診斷需要將上述染色體標本進行染色體顯帶分析或非顯帶分析。實施例14，一種染色體制備方法，包括以下步驟步驟一，培養(yǎng)基制備，按照權(quán)利要求1所述方法制備培養(yǎng)基；步驟二，細胞培養(yǎng)，包括以下五步第一步，采血，人體靜脈取血，肝素抗凝；第二步，種血，準備染色體培養(yǎng)基，恢復(fù)至室溫，將注射器的針頭穿過培養(yǎng)瓶的膠塞向每瓶培養(yǎng)基中加入0. 35ml全血，立即搖勻，放入37°C恒溫培養(yǎng)箱，第三步，細胞培養(yǎng)，種血后每天早晚各搖勻一次，細胞培養(yǎng)后第三天終止培養(yǎng)，整個培養(yǎng)時間為70h ；第四步，阻留中期分裂相，終止培養(yǎng)前2. 5h加入秋水仙酰胺，秋水仙酰胺終濃度為0. lug/ml搖勻，繼續(xù)放入37°C恒溫培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)至70h ；第五步，收獲細胞，從37°C恒溫培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)基，搖勻，將培養(yǎng)物倒入尖底離心管，1000轉(zhuǎn)/min，離心lOmin，離心結(jié)束后，吸去上清液，只保留血液標本Iml左右。步驟三，制備細胞懸液，所述制備細胞懸液包括以下步驟第一步，低滲，在上述離心管中加入預(yù)溫至37°C的0. 075mol/LKCL低滲液液7ml， 用滴管吹打均勻后置37°C水浴鍋低滲40min ；第二步，預(yù)固定，按照冰醋酸甲醇=1 3配制固定液，低滲結(jié)束后，沿著離心管壁加入固定液1ml，吹打混勻后，1000轉(zhuǎn)/min,離心IOmin ；第三步，第一次固定，吸去上清液，沿著離心管壁加入7ml固定液，用滴管吹打混勻后放置30分鐘以上，1000轉(zhuǎn)/min，離心IOmin ；第四步，第二次固定，吸去上清液，保留1. 5ml。加入7ml固定液，用滴管吹打混勻后放置15分鐘以上，1000轉(zhuǎn)/min，離心IOmin ；第五步，第三次固定，倒掉上清液，加入7ml固定液，用滴管吹打混勻后放置15分鐘以上，1000轉(zhuǎn)/min，離心IOmin ；第六步，細胞懸液的制備和保存，吸去上清液，加入固定液適量，輕輕打勻，制成濃度適宜的細胞懸液。步驟四，制片，即制備染色體標本，用滴管打勻細胞懸液，吸取少量從20-30cm高處滴至經(jīng)冰水浸泡過的潔凈無脂的玻片上，每片滴2-3滴，滴完后在酒精燈火焰上來回數(shù)次，使其干燥，制得染色體標本；步驟五，根據(jù)診斷需要將上述染色體標本進行染色體顯帶分析或非顯帶分析。采用本技術(shù)方案的有益效果是生產(chǎn)的培養(yǎng)基質(zhì)量穩(wěn)定，由其培養(yǎng)的染色體分裂相數(shù)目眾多且染色體細長，便于臨床染色體檢查分析以及科研使用。以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1. 一種用于染色體制備的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟一，制備初始溶液，所述初始溶液配方如下RPMI1640 :10-llg/L、肝素鈉6400_7000IU、HEPES :1. 19-4. 05g/L、L-谷氨酰胺 0. 5-0. 6g/L、NaHC03 l_2g/L、青霉素 G 鉀0. 05-0. lg/L、硫酸鏈霉素0. 06-0. lg/L、牛血清100-200ml/L、注射用水加至1L，攪拌均勻至澄清溶液； 步驟二，過濾除菌，用濾膜將上述初始溶液進行過濾除菌；步驟三，配制植物血球凝集素PHA溶液，用注射用水配制2%植物血球凝集素PHA溶液，步驟四，培養(yǎng)基配制，在過濾后的初始溶液中加入所述植物血球凝集素PHA溶液: 50-200mg/L,攪拌均勻，制得培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于染色體制備的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于，增加以下步驟步驟五分裝將步驟四所述的溶液分裝到西林瓶中，加蓋密封。步驟六貼簽將步驟五所述的產(chǎn)品貼簽，即形成染色體培養(yǎng)基。
3.一種用于染色體制備的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的配方為RPMI1640 10-llg/L、肝素鈉6400-7000IU、HEPES :1. 19-4. 05g/L、L_ 谷氨酰胺0. 5-0. 6g/L、NaHC03 l-2g/L、青霉素 G 鉀0. 05-0. lg/L、硫酸鏈霉素0. 06-0. lg/L、牛血清100_200ml/L、植物血球凝集素PHA :50-200mg/L、注射用水加至1L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于染色體制備的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的配方為RPMI1640 10. 2-10. 6g/L、肝素鈉:6400_6500IU、HEPES :2_4g/L、L-谷氨酰胺 0. 5-0. 6g/L、NaHC03 :l_2g/L、青霉素 G 鉀:0. 05-0. lg/L、硫酸鏈霉素0. 07-0. 09g/L、牛血清150-200ml/L、植物血球凝集素PHA :50_200mg/L、注射用水加至1L。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于染色體制備的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的配方為RPMI1640 10. 4g/L、肝素鈉:6400IU、HEPES :1. 19-4. 05g/L、L-谷氨酰胺0. 6g/L、 NaHC03 :2g/L、青霉素G鉀0. lg/L、硫酸鏈霉素0. 08g/L、牛血清200ml/L、植物血球凝集素PHA :50-200mg/L、注射用水加至1L。
6.一種染色體制備方法，其特征在于，包括以下步驟步驟一，培養(yǎng)基制備，按照權(quán)利要求1所述方法制備培養(yǎng)基；步驟二，細胞培養(yǎng)，將人體外周血0. 3ml-0. 4ml種入所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在終止培養(yǎng)前 2. 5小時加入濃度為0. lug/ml的秋水仙酰胺，使細胞停止于分裂中期，經(jīng)過68-72小時細胞培養(yǎng)后收獲細胞；步驟三，制備細胞懸液，再經(jīng)過0. 075mol/L的KCL低滲液低滲40min，預(yù)固定后經(jīng)三次固定，制備細胞懸液，用于染色體制備；步驟四，制片，即制備染色體標本，用滴管打勻細胞懸液，吸取少量從20-30cm高處滴至經(jīng)冰水浸泡過的潔凈無脂的玻片上，每片滴2-3滴，滴完后在酒精燈火焰上來回數(shù)次，使其干燥，制得染色體標本；步驟五，根據(jù)診斷需要將上述染色體標本進行染色體顯帶分析或非顯帶分析。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種染色體制備方法，其特征在于，所述細胞培養(yǎng)包括以下步驟第一步，采血，人體靜脈取血，肝素抗凝；第二步，種血，準備染色體培養(yǎng)基，恢復(fù)至室溫，將注射器的針頭穿過培養(yǎng)瓶的膠塞向每瓶培養(yǎng)基中加入0. 3-0. 4ml全血，立即搖勻，放入37°C恒溫培養(yǎng)箱，第三步，細胞培養(yǎng)，種血后每天早晚各搖勻一次，細胞培養(yǎng)后第三天終止培養(yǎng)，整個培養(yǎng)時間為68-7 ；第四步，阻留中期分裂相，終止培養(yǎng)前2. 5h加入秋水仙酰胺，秋水仙酰胺終濃度為 0. lug/ml搖勻，繼續(xù)放入37°C恒溫培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)至68h_72h ；第五步，收獲細胞，從37°C恒溫培養(yǎng)箱取出培養(yǎng)基，搖勻，將培養(yǎng)物倒入尖底離心管， 1000轉(zhuǎn)/min，離心lOmin，離心結(jié)束后，吸去上清液，只保留血液標本Iml左右。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的一種染色體制備方法，其特征在于，所述阻留中期分裂相包括以下步驟第一步，低滲，在上述離心管中加入預(yù)溫至37°C的0. 075mol/L KCL低滲液液6 8ml， 用滴管吹打均勻后置37°C水浴鍋低滲40min ；第二步，預(yù)固定，按照冰醋酸甲醇=1 3配制固定液，低滲結(jié)束后，沿著離心管壁加入固定液1ml，吹打混勻后，1000轉(zhuǎn)/min，離心IOmin ；第三步，第一次固定，吸去上清液，沿著離心管壁加入7ml固定液，用滴管吹打混勻后放置30分鐘以上，1000轉(zhuǎn)/min，離心IOmin ；第四步，第二次固定，吸去上清液，保留1.5ml。加入7ml固定液，用滴管吹打混勻后放置15分鐘以上，1000轉(zhuǎn)/min，離心IOmin ；第五步，第三次固定，倒掉上清液，加入7ml固定液，用滴管吹打混勻后放置15分鐘以上，1000 轉(zhuǎn) /min,離心 IOmin ；第六步，細胞懸液的制備和保存，吸去上清液，加入固定液適量，輕輕打勻，制成濃度適宜的細胞懸液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種為解決染色體核型分析而提供的一種染色體制備方法及所需培養(yǎng)基及其制備方法，培養(yǎng)基是由RPMI1640、肝素鈉、HEPES、L-谷氨酰胺、NaHCO3、青霉素G鉀、硫酸鏈霉素、牛血清、植物血球凝集素(PHA)組成，其檢測方法為將人體外周血0.3ml-0.4ml種入該培養(yǎng)基后，在終止培養(yǎng)前2-4h加入秋水仙酰胺使細胞停止于分裂中期，細胞培養(yǎng)至68-72h收獲細胞，再經(jīng)過低滲40mi n，三次固定，顯帶，染色等處理，在顯微鏡下進行染色體分析，以確定外周血提供者是否存在染色體異常。本發(fā)明的培養(yǎng)基使用方便，操作簡單，成本低，患者檢測費低，適合于各級醫(yī)院用于遺傳診斷、不孕不育及產(chǎn)前診斷。
文檔編號C12Q1/68GK102443623SQ20101050047
公開日2012年5月9日 申請日期2010年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月9日
發(fā)明者費敏 申請人:蘇州蘇大賽爾免疫生物技術(shù)有限公司