專利名稱：檢測(cè)多刺曼陀羅的核酸組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)和植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用分子生物學(xué)檢測(cè)技 術(shù)快速準(zhǔn)確地檢測(cè)多刺曼陀羅(D. ferox)的核酸組合物，采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)，該組 合物適用于口岸檢驗(yàn)檢疫、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和植物保護(hù)等領(lǐng)域當(dāng)中。
背景技術(shù)：
曼陀羅屬(Datura L.)，為茄科植物。世界上每年都會(huì)發(fā)生曼陀羅中毒事件，另 外，由于曼陀羅屬許多種被廣泛地用于藥物學(xué)和園藝學(xué)，因此，該屬許多種在世界各地和 我國(guó)均有大量栽培，導(dǎo)致該屬在世界范圍內(nèi)廣泛分布。在進(jìn)口貨物如大豆中，經(jīng)常有截獲 有毒和有害雜草曼陀羅屬種子的報(bào)道，且種子鑒定易發(fā)生混淆。目前在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中常 出現(xiàn)的曼陀羅屬的植物名稱有多刺曼陀羅(D. ferox)，櫟葉曼陀羅(D. quercifolia)， 曼陀羅(D. stramonium)，木本曼陀羅(D. arborea)，美麗曼陀羅(D. Candida)，濕地曼陀 羅(D. ceratocaula)，異色曼陀羅(D. discolor)，無刺曼陀羅(D. inermis)，毛曼陀羅 (D. inoxia)，光曼陀羅(D. Ieichhardtii)，洋金花(D. metel)，紫花曼陀羅(D. tatula)，柏 哈地曼陀羅(D.bernhardii)，紅花曼陀羅(D. sanguinea)等，其中多刺曼陀羅的異名為 D. quercifolia。實(shí)際工作中，農(nóng)產(chǎn)品中夾雜的曼陀羅雜草種子的外觀特征往往會(huì)因運(yùn)輸受到磨損 與變形，同時(shí)由于環(huán)境、氣候、栽培條件的影響、種子成熟度的不同等引起的個(gè)體差異，更為 形態(tài)鑒定增加了難度，而細(xì)胞生物學(xué)方法等需要的周期比較長(zhǎng)且難以準(zhǔn)確鑒定。目前，細(xì)胞學(xué)研究表明曼陀羅(D. stramonium)和多刺曼陀羅(D. ferox)的隨體 和二價(jià)體形狀和數(shù)目最接近；生物化學(xué)的研究表明曼陀羅(D. stramonium)和多刺曼陀羅 (D. ferox)的同工酶最近似；在分子水平，利用AFLP技術(shù)發(fā)現(xiàn)曼陀羅(D. stramonium)和多 刺曼陀羅(D. ferox)的相似距離最近，在進(jìn)化樹上歸為同一組。迄今為止，尚未有分子水 平的研究成果可用于鑒定多刺曼陀羅(D. ferox)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)中關(guān)于形態(tài)鑒定和細(xì)胞生物學(xué)方法存 在的困難，提出采用分子生物學(xué)的方法，對(duì)核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(InternalTranscribed Spacers, ITS)序列差異設(shè)計(jì)多刺曼陀羅(D. ferox)的檢測(cè)用核酸組合物。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，建立多刺曼陀羅(D. ferox)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法， 將核酸組合物用于口岸檢驗(yàn)檢疫、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和植物保護(hù)等領(lǐng)域當(dāng)中，以達(dá)到快速和準(zhǔn)確的 檢測(cè)鑒定。本發(fā)明提供的檢測(cè)多刺曼陀羅(D. ferox)的核酸組合物是基于多刺曼陀羅 (D. ferox)與其近似種在rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列上的差異設(shè)計(jì)的。18S 26S核核糖體 DNA(nrDNA)的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS分為ITSl和ITS2兩部分。ITS區(qū)在植物核基因組中是高 度重復(fù)的。全部nrDNA重復(fù)單位包括4萬(wàn)個(gè)拷貝以串聯(lián)重復(fù)(tandemr印eats)方式出現(xiàn)在
3一個(gè)或多個(gè)染色體基因位點(diǎn)上(Hamby R K, Zimer E A. Ribosomal RNA as a phylogenetic tool in plant systematics of plants[M]. Chapman and Hall,New York,NY. 1992,50 91.)。在被子植物中，ITS區(qū)既具有核苷酸序列的高度變異性又有長(zhǎng)度上的保守性，說明這 些間隔區(qū)的序列很容易在近緣類群間排序，而且豐富的變異可在較低的分類階元上(如 屬間和種間)解決植物系統(tǒng)發(fā)育問題。屈良鵠和陳月琴(1999)(生物分子分類檢索表—— 原理與方法，中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)[J]. 1999，38(1) 1-6)通過對(duì)不同生物類群的 ITS序列(自生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù))的比較得出被子植物大多數(shù)科屬的ITS序列的種間差異值 為1. 2% 10. 2%，屬間差異值為9. 6% 28. 8%，這對(duì)系統(tǒng)發(fā)育研究來說都是較合適的范 圍。本發(fā)明提供的一種檢測(cè)多刺曼陀羅(D. ferox)的核酸組合物，包括核酸引物F、核 酸引物R和核酸分子探針P。核酸引物F，即上游引物，其5’端至3’端序列為AGGGAGACGCACGGAGGA。核酸引物R，即上游引物，其5’端至3’端序列為CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGA。核酸分子探針P為Tagman熒光探針，其5’端至3’端序列為 CCGAAGCACAGCCCGCGC。熒光基團(tuán)，如羧基熒光素(FAM)結(jié)合于探針的5’末端，淬滅劑，如 羧基四甲基落羅丹明(TAMRA)結(jié)合于探針3’末端。根據(jù)核苷酸堿基配對(duì)規(guī)則可以推知，與本發(fā)明提供的核酸引物F、核酸引物R和核 酸分子探針P核酸序列完全互補(bǔ)的核酸鏈組成的一組核酸組合物也適用于本發(fā)明當(dāng)中。提取目標(biāo)樣品的總DNA后，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)就可完成對(duì)目標(biāo)樣品的擴(kuò) 增，隨著PCR循環(huán)數(shù)的增加，所能檢測(cè)的熒光信號(hào)亦隨之增加，從而通過熒光標(biāo)識(shí)判斷目標(biāo) 樣品是否為多刺曼陀羅(D. ferox)。本發(fā)明是在提取單粒種子的DNA后，利用核酸引物F/R和核酸分子探針P進(jìn)行實(shí) 時(shí)熒光PCR檢測(cè)。PCR擴(kuò)增后的陽(yáng)性樣品能檢測(cè)到熒光信號(hào)，PCR擴(kuò)增后的陰性樣品及空白 對(duì)照無法檢測(cè)到有熒光信號(hào)的增加，由此可以區(qū)分多刺曼陀羅(D. ferox)和其它曼陀羅屬 的樣品。傳統(tǒng)的鑒定方法是利用種子形態(tài)學(xué)特征、細(xì)胞生物學(xué)特征等。外觀形態(tài)鑒定作為 能便捷地辨別不同植物的外部特征對(duì)不同種植物進(jìn)行分類而成為口岸檢疫雜草的重要手 段之一。但是，由于進(jìn)口的農(nóng)產(chǎn)品中因脫落、干燥、儲(chǔ)運(yùn)、裝卸等原因，夾雜的雜草種子的外 觀特征往往會(huì)因此受到磨損與變型，同時(shí)由于環(huán)境、氣候、栽培條件的影響、種子成熟度的 不同等引起的個(gè)體差異也是難免的，這樣就給外表形態(tài)鑒定帶來了困難。而細(xì)胞生物學(xué)方 法等不僅需要較長(zhǎng)的周期，而且僅依據(jù)染色體的形態(tài)仍難以鑒定。多刺曼陀羅(D. ferox)的近似品種較多，如曼陀羅(D. stramonium)，木 本曼陀羅(D. arborea)，美麗曼陀羅(D. Candida)，濕地曼陀羅(D. ceratocaula)， 異色曼陀羅(D. discolor)，無刺曼陀羅(D. inermis)，毛曼陀羅(D. inoxia)，光曼 陀羅(D. Ieichhardtii)，洋金花(D. metel)紫花曼陀羅(D. tatula)，柏哈地曼陀 羅(D. bernhardii)，紅花曼陀羅(D. sanguinea)等。這些植物的籽實(shí)與多刺曼陀羅 (D. ferox)極為相似，但是其危害性及檢疫地位各有不同。本發(fā)明采用核酸引物F、核酸引 物R和核酸分子探針P及其互補(bǔ)核酸鏈形成的核酸組合物，采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)實(shí) 現(xiàn)對(duì)多刺曼陀羅(D. ferox)的特異性區(qū)分，有利于口岸檢驗(yàn)檢疫、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和植物保護(hù)等領(lǐng)域?qū)δ繕?biāo)樣品的快速準(zhǔn)確的檢測(cè)鑒定。
具體實(shí)施例方式下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。1.樣品DNA提取單粒種子研磨粉碎，按照以下步驟提取1)液氮中研細(xì)后轉(zhuǎn)入離心管中，加入500 800 μ L TES[100mM Tris (pH8. 0), IOmM EDTA,2% SDS]；加50 100 μ g蛋白激酶K混勻，置于55°C 60°C水浴60 90min，期間 輕輕混勻幾次；2)調(diào)節(jié)鹽濃度，加1/10體積的10%十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)，置于65°C水 浴 10 20min ；3)加入等體積的SEVGA(氯仿異戊醇=24 1)混勻，0°C孵育30min ；4)離心，取上清，加 3 6 μ L RNase A, 37°C水浴 30min，去除 RNA ；6)加預(yù)冷異丙醇，_20°C放置15 30min ；7)離心，棄異丙醇，70%乙醇洗2次。室溫干燥，50 200 μ L ddH20溶解。2.實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增體系25μ 1 :Premix Ex TaqTM(2X) 12. 5 μ L，上、下游引物 (5ymol/L)各 1 μ L，TaqMan 核酸分子探針 P (5 μ mol/L) 1 μ L，DNA (10 20ng/μ L)模板 1 μ L, ROX Reference Dye II (50 X) 0. 5 μ L，滅菌蒸溜水補(bǔ)至 25 μ L，在 ABI 7500 型 Fast Real-Time PCR System上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)轭A(yù)變性95°C IOs ；然后以 950C 15s，60°C Imin 進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)。采用上述相同的檢測(cè)步驟，對(duì)來自于不同地區(qū)的多刺曼陀羅及其近似品種的樣品 (見表1)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表2。表IPCR擴(kuò)增所用材料及其來源
權(quán)利要求
一種檢測(cè)多刺曼陀羅的核酸組合物，其特征是包括核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探針P或與核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探針P完全互補(bǔ)的核酸鏈；所述的核酸引物F如SEQ ID No 1所示，所述的核酸引物R如SEQID No 2所示，所述的核酸分子探針P如SEQ ID No 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)多刺曼陀羅的核酸組合物，其特征是所述的核酸分子探 針P為Tagman熒光探針。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)多刺曼陀羅的核酸組合物，其特征是所述的核酸分子探 針P的熒光基團(tuán)為羧基熒光素。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)多刺曼陀羅的核酸組合物，其特征是所述的核酸分子探 針P的淬滅劑為羧基四甲基落羅丹明。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)多刺曼陀羅的核酸組合物，其特征是所述的核酸組合物 用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)判斷目標(biāo)樣品中的多刺曼陀羅。
6.一種實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)多刺曼陀羅的試劑組合物，其特征是包括權(quán)利要求1-4之一 所述的核酸組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種檢測(cè)多刺曼陀羅(D.ferox)的核酸組合物，包括SEQ ID No1所示的核酸引物F、SEQ ID No 2所示核酸引物R和SEQ ID No 3所示核酸分子探針P或與核酸引物F、核酸引物R和核酸分子探針P完全互補(bǔ)的核酸鏈。通過實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)，本發(fā)明核酸組合物能在半個(gè)工作日內(nèi)完成檢測(cè)，不僅檢測(cè)時(shí)間大大縮短，檢測(cè)的靈敏度也顯著提高。將本發(fā)明核酸組合物用于口岸檢驗(yàn)檢疫、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和植物保護(hù)等領(lǐng)域當(dāng)中，以達(dá)到快速和準(zhǔn)確的檢測(cè)鑒定。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101988126SQ20101029395
公開日2011年3月23日 申請(qǐng)日期2010年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月28日
發(fā)明者傅怡寧, 印麗萍, 易建平, 薛華杰, 魏莎莎 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)上海出入境檢驗(yàn)檢疫局