專利名稱：艾滋病病毒靶細(xì)胞cd4+t細(xì)胞抵抗和清除hiv-1的極端表達(dá)基因群的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類基因組的疾病相關(guān)基因的表達(dá)譜研究和特征基因群的篩選。具體 的講是在人功能基因組范圍內(nèi)篩選艾滋病相關(guān)基因，利用細(xì)胞模型和基因芯片技術(shù)相結(jié)合 的方法建立的艾滋病病毒靶細(xì)胞CD4+T細(xì)胞抵抗和清除HIV-I的極端表達(dá)基因群，屬生物 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
艾滋病(AIDS)是一種由 HIV (human immunodeficiency virus，人類免疫缺陷病 毒)引起的嚴(yán)重威脅人類健康的重大傳染病。HIV-I天然的靶細(xì)胞CD4+T細(xì)胞的活化和增 殖是HIV-I得以大量繁殖和廣泛播散的先決條件。1996年Levine等人意外發(fā)現(xiàn)，經(jīng)同時包 被在磁珠上的⑶3、⑶28抗體(“⑶3/⑶28beadS”)刺激后，活化、增殖的⑶4+T細(xì)胞，反而 獲得了既能抵抗感染又能清除病毒的能力——來自HIV-I感染者的CD4+T細(xì)胞活化后，能 逐漸清除已感染的病毒，來自健康成人的CD4+T細(xì)胞活化后，能抵抗HIV-I而不被感染。我 們以此特殊效應(yīng)為基礎(chǔ)，同時以高度易感并促進(jìn)病毒增殖的PHA/IL-2活化細(xì)胞為反證，構(gòu) 建細(xì)胞模型并篩選出艾滋病病毒靶細(xì)胞CD4+T細(xì)胞抵抗和清除HIV-I的極端表達(dá)基因群。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供艾滋病病毒靶細(xì)胞CD4+T細(xì)胞抵抗和清除HIV-I的極端表 達(dá)基因群。本發(fā)明通過采用高通量的人表達(dá)譜基因芯片，通過比較未刺激、⑶3/⑶28磁珠刺 激(具備抵抗和清除HIV-I能力)及PHA/IL-2刺激(具備易感和支持HIV-I能力)三種狀 態(tài)下的CD4+T細(xì)胞基因表達(dá)差異，篩選在多樣本中有共同表達(dá)趨勢的差異基因，得到一組 艾滋病病毒靶細(xì)胞CD4+T細(xì)胞抵抗和清除HIV-I的極端表達(dá)基因群，共包含6個基因，其部 分或全部組合作為篩查抗艾滋細(xì)胞藥物的標(biāo)志；該基因群在CD4+T細(xì)胞抵抗和清除HIV-I 狀態(tài)時高表達(dá)且在CD4+T細(xì)胞易感和支持HIV-I時低表達(dá)，基因群中的各基因的名稱、序列 號及主要描述見表1。表1抵抗和清除HIV-I的極端表達(dá)基因群(共6個基因)基因名稱 GenBank序列號基因描述
1ACTN2NM_001103Homo sapiens actinin, alpha 22CTHNM_001902Homo sapiens cystathionase (cystathionine gamma-lyase), transcript variant 13IL2NM_000586Homo sapiens interleukin 24IL24NM_006850Homo sapiens interleukin 24, transcript variant 15MAGIlNM_004742Homo sapiens membrane associated guanylate kinase, WW and PDZ domain containing 1, transcript variant 26PYGLNM—002863Homo sapiens phosphorylase, glycogen; liver (Hers disease, glycogen storage disease type VI) 本發(fā)明中的極端表達(dá)基因群中的基因均參與了造成不同生物學(xué)效應(yīng)的顯著功能 (Gene Ontology, GO)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(pathway)，同時在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)(Signal-Net)和基 因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(GeneRelNet)中處于關(guān)鍵結(jié)點(diǎn)或重要地位，因此具有代表意義。


圖1顯示抵抗和清除狀態(tài)(B)中高表達(dá)且易感和支持狀態(tài)(P)中低表達(dá)的極端表 達(dá)基因。
具體實(shí)施例方式1.樣本的選擇和處理3例樣本取自云南昆明血液中心，均為健康人外周血濃縮白細(xì)胞。采用密度梯度 離心法分離外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，采用CD4+T Cell Isolation Kit II human試劑 盒(Miltenyi公司)對PBMC進(jìn)行磁珠陰性分選，獲得靜息狀態(tài)的CD4+T細(xì)胞。使用6孔 培養(yǎng)板每孔3ml微量培養(yǎng)體系在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中對CD4+T細(xì)胞進(jìn)行體外刺激培養(yǎng)， 培養(yǎng)基為RPMI 1640完全培養(yǎng)液[RPMI 1640+10% FBS+0. lmol/L HEPES(上海生工生物公 司)]。⑶3/⑶28磁珠刺激(B組)按細(xì)胞磁珠1 3的比例接種1 X IO6⑶4+T細(xì)胞/孔 (Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28，Invitrogen 公司)，每 2 天換半液并傳代，維持 細(xì)胞密度為1 2X IO6細(xì)胞/ml。PHA/IL-2刺激(P組)接種2X106CD4+T細(xì)胞/孔，加 入5mg/ml植物血凝素(PHA)和100U/ml白介素_2(IL_2)進(jìn)行刺激培養(yǎng)，每3天換半液補(bǔ) 充PHA和IL-2。上述細(xì)胞刺激6天，連同未刺激(R組)的⑶4+T細(xì)胞提取總RNA后作為基 因芯片雜交的樣本。2.基因芯片雜交2. 1總RNA提取及純化采用TRIzol法提取細(xì)胞的總RNA，QIAGEN RNeasy Kit純化總RNA，用 NanodropND-1000 分析 RNA 濃度，瓊脂糖電泳或 Agilent BioAnalyzer 2100 進(jìn)行質(zhì)檢。2. 2cDNA第一鏈和第二鏈一步法合成1)取2μ g RNA于1. 5ml離心管中，如下配置反應(yīng)溶液總RNA 2 μ g (最多 6. 5 μ 1)Τ7 Promotor primer 5 μ 1RNase-free Water X μ 1
總體積11·5μ12) 65 °C保溫10分鐘，冰浴5分鐘。3)配置如下cDNA合成體系5XFirst Strand Buffer 4μ 10. IMDTT 2 μ 1IOmM dNTP mix 1 μ 1MMLV RT 1 μ 1RNase OUT 0. 5 μ 1總體積8. 5μ14)將上述8. 5 μ 1 mix加入變性后冰浴的RNA中。5)用槍頭混勻，之后離心。6)PCR 熱蓋65°C，40°C反應(yīng)2小時；65°C滅活15分鐘；4°C反應(yīng)5分鐘。
2. 3aaUTP 標(biāo)記 cRNA 合成1)試劑配制NTP 的配制IOOmMATP 250 μ 1IOOmM GTP 250 μ 1IOOmM CTP 250 μ 1IOOmM UTP 187. 5 μ 1RNase free Η20 62. 5 μ 1Total 1000 μ 12)如下配置 Transcription mix RNase-free Water 5. 7 μ 14X Transcription Buffer 20 μ 1NTP 16 μ 10. IM DTT 6 μ 150% PEG 6. 4 μ 1aa-UTP(25mM) 4 μ 1RNase OUT 0. 5 μ 1Inorganic Pyrophosphatase 0. 6 μ 1T7RNA Polymerase 0.8 μ 1總體積60 μ 13)加入 60 μ 1 Transcription mix 并混勻。4斤0 儀中熱蓋601，401反應(yīng)2小時。2. 4cRNA純化與濃度測定采用QIAGEN RNeasy Mini kit純化cRNA，用分光光度計分析RNA濃度。按下面 的計算公式確定調(diào)整cRNA的含量調(diào)整cRNA 含量=RNAm- (total RNAi) (y)RNAm = IVT 后測得 cRNA 量(μ g)
total RNAi =開始總 RNA 的量(μ g)y =在IVT過程中加入的雙鏈cDNA產(chǎn)物占全部cDNA產(chǎn)物的百分?jǐn)?shù)。2. 5cRNA樣品熒光標(biāo)記1)取上述cRNA 4 μ g并濃縮至6. 6 μ 1。2)力口 10 μ 1 DMSO 混勻。3)力口 3. 4 μ 1 的 0. 3Μ 碳酸氫鈉(NaHC03) (ρΗ9· 0)并混勻。4)將上述20 μ IcRNA混合物加入到熒光染料(Cy3)中，并混勻。25°C保溫1小時。5.力卩 9 μ 1 的 4Μ Hydroxylamine 混勻后 25°C保溫 15min。2. 6熒光標(biāo)記cRNA樣品純化采用QIAGEN RNeasy Mini kit 純化 cRNA。2. 7熒光分子濃度及摻入率計算Cy3_ 濃度(pmol/μ 1) = A552/0. 15Cy3-摻入率(pmol/ yg)= Cy3-濃度 /cRNA 濃度(μ g/μ 1)2. 8cRNA 樣品片段化和芯片雜交(4x44K microarrays)1)按下表配制片段化混合液，然后在60°C溫浴30min進(jìn)行片段化。Cy3cRNA 875ngIOXBlocking Agent 11 μ 125X Fragmentation Buffer 2. 2 μ 1Nuclease-free water X μ 1總體積 55 μ 12)力口入 55μ1 2XGEx Hybridization Buffer。3)取100 μ 1上芯片，65°C 17小時，IOrpm滾動雜交。2. 9芯片洗滌1)取出芯片于洗液1中洗滌1分鐘。2)再將芯片放入洗液2中洗滌1分鐘(37°C )。2. 10芯片掃描Agilent掃描儀中掃描，分辨率為5 μ m，掃描儀自動以100%和10% PMT各掃描一 次，兩次結(jié)果Agilent軟件可自動合并。3.數(shù)據(jù)分析3. 1差異基因篩選利用多重比較檢驗(yàn)(RVM)的F檢驗(yàn)進(jìn)行3組樣本的差異基因篩選，按照Pvalue < 0.01, FDR < 0. 01篩選，得到差異表達(dá)基因。3. 2基因表達(dá)趨勢分析通過篩選得到3組樣本的差異基因后，按照樣本的邏輯順序(P-R-B)，基于基因在 每個樣本下的表達(dá)值，對差異基因進(jìn)行基因表達(dá)趨勢的聚類，根據(jù)聚類結(jié)果將每種處理狀 態(tài)下特有的基因歸類，篩選得到差異基因的表達(dá)趨勢。3. 3特征表達(dá)基因群的確認(rèn)對在抵抗和清除狀態(tài)(B)且易感和支持狀態(tài)(P)中呈現(xiàn)極端表達(dá)趨勢的基因(見 圖1)，進(jìn)行功能(Gene Ontology, GO)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(pathway)的顯著性分析，尋找具有顯著功能并參與顯著性信號轉(zhuǎn)到通路的基因；同時在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)(Signal-Net)和基因 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(GeneRelNet)中尋找處于關(guān)鍵結(jié)點(diǎn)或重要地位的基因，將上述數(shù)據(jù)整合，最終 篩選出具有最高、代表意義的基因從而構(gòu)建出特征性的極端表達(dá)基因群(如表1所示)。
本發(fā)明的極端表達(dá)基因群，有望基于其中單個、多個或全部基因建立基因芯片、分 子雜交和RT-PCR的方法檢測樣本中這些基因的mRNA表達(dá)水平，根據(jù)這些基因的表達(dá)水平 診斷艾滋病及篩選抗艾滋細(xì)胞藥物。
權(quán)利要求
一組艾滋病病毒靶細(xì)胞CD4+T細(xì)胞抵抗和清除HIV 1的極端表達(dá)基因群，其特征在于該極端表達(dá)基因群包含的名稱分別為ACTN2、CTH、IL2、IL24、MAGI1、PYGL，其部分或全部組合作為篩查抗艾滋細(xì)胞藥物的標(biāo)志；該群基因在CD4+T細(xì)胞抵抗和清除HIV 1狀態(tài)時高表達(dá)且在CD4+T細(xì)胞易感和支持HIV 1時低表達(dá)。
2.權(quán)利要求1所述的艾滋病病毒靶細(xì)胞CD4+T細(xì)胞抵抗和清除HIV-I的極端表達(dá)基因 群，其特征在于6個基因由SEQ ID NO 1-6所示的核苷酸序列組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及艾滋病病毒靶細(xì)胞CD4+T細(xì)胞抵抗和清除HIV-1的極端表達(dá)基因群，屬生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明通過采用高通量的人表達(dá)譜基因芯片，比較未刺激、CD3/CD28磁珠刺激及PHA/IL-2刺激三種狀態(tài)的CD4+T細(xì)胞基因表達(dá)差異，篩選得到艾滋病病毒靶細(xì)胞CD4+T細(xì)胞抵抗和清除HIV-1的包含6個基因的極端表達(dá)基因群，由SEQ IDNO1-6所示的核苷酸序列組成。本極端表達(dá)基因群中的基因均參與了造成不同生物學(xué)效應(yīng)的顯著功能(Gene Ontology，GO)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(pathway)，同時在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)(Signal-Net)和基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(GeneRelNet)中處于關(guān)鍵結(jié)點(diǎn)或重要地位，且有望基于其中單個、多個或全部基因建立基因芯片、分子雜交和RT-PCR的方法檢測樣本中這些基因的mRNA表達(dá)水平，根據(jù)這些基因的表達(dá)水平診斷艾滋病及篩選抗艾滋細(xì)胞藥物。
文檔編號C12Q1/68GK101979567SQ20101029319
公開日2011年2月23日 申請日期2010年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月27日
發(fā)明者張華堂, 徐雯雯, 郭彥, 陳玲, 韓妙君 申請人:中國科學(xué)院昆明動物研究所