專利名稱：擾亂內(nèi)分泌的物質(zhì)的吸收劑及含有該吸收劑的食物和飲料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收劑，該吸收劑能吸收并清除經(jīng)口攝入的擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)，本發(fā)明尤其涉及一種擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收劑及含有該吸收劑的食物，該吸收劑不僅能在人或動物的腸腔內(nèi)吸收擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)，從而抑制此類物質(zhì)的體內(nèi)吸收，而且能加速這類被體內(nèi)吸收的化學(xué)物質(zhì)的排泄。
背景技術(shù)：
長期以來，人們把有機(jī)錫涂在船底來防止甲殼類動物的吸附。自從有報道稱有機(jī)錫能夠?qū)е录讱ゎ悇游锏纳称鞴佼惓Ｒ詠?Gibbs等，J.Mar.Biol.Assoc.UK，66，767，1986)，擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)(或環(huán)境激素)就被認(rèn)為是能夠?qū)е聡?yán)重社會問題的物質(zhì)。生物體的內(nèi)分泌系統(tǒng)是一個非常重要的系統(tǒng)，它通過各種激素的作用進(jìn)行生物個體進(jìn)化的調(diào)節(jié)、生殖器官的發(fā)育和保持器官的自身穩(wěn)定。對于那些生活在被生活廢水污染的湖泊和沼澤中的動物來說，擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)能夠破壞其內(nèi)分泌系統(tǒng)的平衡，并導(dǎo)致生長和生殖的異常。
據(jù)說人和動物可通過消化道、肺和皮膚吸收擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)。但是，在正常的生活環(huán)境下，人類通過空氣、水或土壤所吸收的擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)是相當(dāng)少的。有人認(rèn)為人類主要通過日常攝入的食物(肉類和魚)而受到此類物質(zhì)的侵害。具體而言，據(jù)報道當(dāng)前使用的三嗪除草劑如“阿特拉津(Atrazine)”(如下式(I)所示)和“西瑪津(Simazine)”以及其他農(nóng)用化學(xué)品如“馬拉松(Malathion)”都是危險的，因?yàn)樗鼈兡芮趾ι锏母黝惼鞴佟＿@類經(jīng)口攝入的擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)在腸道內(nèi)被吸收，并集中在肝臟和脂肪組織中。 另一方面，作為各種食品包裝材料的聚碳酸酯樹脂等釋出的雙酚A(Krishnan等，內(nèi)分泌學(xué)(Endocrinology)，132，2279(1993)，Olea等，環(huán)境安全展望(Environ.Health Perspect.)，104，298(1996))和4-壬基酚(Soto等，Environ.Health Perspect.，92，167(1991)，Nimrod等，Crit.Rev.Toxicol，26，335(1996))結(jié)合到雌激素受體和雌激素上，對人類表現(xiàn)出嚴(yán)重的影響。所以這些化學(xué)物質(zhì)都是嚴(yán)重社會問題的根源。
雙酚A是具有下式(II)的化合物。 該化合物主要用作聚碳酸酯樹脂、環(huán)氧樹脂和其他樹脂如酚醛樹脂、塑性聚酯、聚砜、丙烯酸樹脂等的原料，并且用作聚氯乙烯的穩(wěn)定劑，還可用作抗氧化劑。1996年日本雙酚A的產(chǎn)量達(dá)到了約250,000噸，其中的40,000噸用于食品領(lǐng)域。
由于用雙酚A制得的聚碳酸酯樹脂具有出色的耐熱性和抗沖擊性，所以該樹脂被用于高溫設(shè)備如咖啡滴器(coffee dripper)、嬰幼兒的餐具和哺乳瓶等。聚碳酸酯產(chǎn)品不但含有未反應(yīng)的雙酚A，而且在高溫下容易從該聚合物中釋出雙酚A。
另外，許多鋼罐和鋁罐的內(nèi)壁涂有環(huán)氧樹脂或氯乙烯樹脂。環(huán)氧樹脂含有原料雙酚A，氯乙烯樹脂也含有穩(wěn)定劑雙酚A。有人指出，保留在鋼罐和鋁罐內(nèi)壁涂層中的雙酚A可能會被溶解下來進(jìn)入食物(Brotons等，Environ.Health Perspect.，103，608(1995))。
此外，作為牙封閉劑的聚碳酸酯塑料中含有雙酚A，該牙封閉劑被用來填補(bǔ)牙齒的齲洞或作為兒童的牙齒涂敷劑(Keith等，“環(huán)境中的擾亂內(nèi)分泌的物質(zhì)(Environmental Endocrine Disruptors)”Willey-Inteuscience，New York，p1232(1997))。有人指出，如果聚合效果不好或用高壓蒸汽殺菌時，就存在從這類護(hù)牙材料中釋放出雙酚A的危險(Krishnan等，Endocrinology，132，2279(1993))。
下式(III)的4-壬基酚以4-壬基酚的乙氧基化物的形式被用作非離子表面活性劑。其年產(chǎn)量達(dá)約20,000噸。4-壬基酚乙氧基化物由于具有低的起泡性，所以在日本它主要用作紡織業(yè)、造紙業(yè)、金屬工業(yè)和殺蟲劑工業(yè)的工業(yè)洗滌劑或分散劑。被排放的含有4-壬基酚的廢水流入河流和海洋，污染了魚和其他動物。 這樣，人類在日常生活中就面臨著與擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)如雙酚A、4-壬基酚和阿特拉津接觸的危險。因此，人們迫切希望能夠開發(fā)出某種能夠防止人類被這類化學(xué)物質(zhì)侵害的物質(zhì)，并且開發(fā)出清除這類化學(xué)物質(zhì)的方法。經(jīng)口攝入并在腸道內(nèi)被吸收的擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)通過血液流動可到達(dá)身體的任何器官，結(jié)果可能帶來各種不利的影響，例如內(nèi)分泌系統(tǒng)的失衡。如果發(fā)現(xiàn)某種物質(zhì)能夠吸收腸道內(nèi)的擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)，則該物質(zhì)可用于抑制擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的體內(nèi)吸收，并可促進(jìn)擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的排泄。于是，根據(jù)上述機(jī)理，該物質(zhì)可保護(hù)生物器官不受擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的侵?jǐn)_。
在這方面，Morita等曾報道，米糠纖維、菠菜纖維、小球藻和旋殼烏賊可促進(jìn)擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)二-8-羥基喹啉和某些多氯聯(lián)苯(PCB)的排泄(Morita等，Jpn.J.Toxicol.Environ.Health，43，42-47(1997))。
然而，還沒有關(guān)于微生物在人和動物的腸道內(nèi)吸收擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)并抑制該化學(xué)物質(zhì)的體內(nèi)吸收的報道。
本發(fā)明在這方面取得了成功。本發(fā)明的一個目的是提供一種藥物，當(dāng)人們攝入來自餐具或被雙酚A、4-壬基酚和阿特拉津等擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)污染的食物時，可日?？诜撍幬铮撍幬锬芤种茢_亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的體內(nèi)吸收，而且此類化學(xué)物質(zhì)一旦被吸收，該藥物能促進(jìn)其排泄。

發(fā)明內(nèi)容
為了發(fā)現(xiàn)能夠吸收擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)，尤其是例如雙酚、烷基酚和三嗪等化學(xué)物質(zhì)的物質(zhì)，本發(fā)明的發(fā)明者進(jìn)行了深入的研究。結(jié)果，該發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，腸細(xì)菌或其成分能夠有效地吸收此類化學(xué)物質(zhì)。該發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了本發(fā)明的完成。
具體而言，本發(fā)明提供了擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收劑，該吸收劑含有作為活性成分的活的或死的腸細(xì)菌或腸細(xì)菌的成分。
本發(fā)明還提供了含有上述擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收劑的食物。
本發(fā)明進(jìn)而提供了抑制人體吸收擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的方法，或促進(jìn)人體排泄擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的方法，所述方法包括給人類施用上述擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收劑的步驟。


圖1顯示了當(dāng)反應(yīng)混合物中只存在腸細(xì)菌時，腸細(xì)菌的濃度與被腸細(xì)菌所吸收的雙酚A的量之間的關(guān)系。
圖2顯示了腸細(xì)菌濃度、反應(yīng)混合物的上清液中殘余的雙酚A的量以及被腸細(xì)菌所吸收的雙酚A的量之間的關(guān)系。
圖3顯示了當(dāng)食物中存在腸細(xì)菌時，腸細(xì)菌的濃度與被吸收的雙酚A的量的關(guān)系。
圖4顯示了食物濃度與被腸細(xì)菌所吸收的雙酚A的量之間的關(guān)系。
圖5顯示了反應(yīng)體系的pH值與被腸細(xì)菌所吸收的雙酚A的量之間的關(guān)系。
圖6顯示了反應(yīng)時間與被腸細(xì)菌所吸收的雙酚A的量之間的關(guān)系。
圖7顯示了腸細(xì)菌的種類與被腸細(xì)菌所吸收的雙酚A的量之間的關(guān)系。
圖8顯示了纖維素的種類與被腸細(xì)菌所吸收的雙酚A的量之間的關(guān)系。
圖9顯示了腸細(xì)菌的種類與被腸細(xì)菌所吸收的4-壬基酚的量之間的關(guān)系。
圖10顯示了腸細(xì)菌的種類與被腸細(xì)菌所吸收的阿特拉津的量之間的關(guān)系。
圖11顯示了腸細(xì)菌的種類、所施用的腸細(xì)菌的量以及作為排泄物所排泄的雙酚A的總量之間的關(guān)系。
圖12顯示了腸細(xì)菌的種類、所施用的腸細(xì)菌的量以及干排泄物的量之間的關(guān)系。
圖13顯示了腸細(xì)菌的種類、所施用的腸細(xì)菌的量以及在沒有施用腸細(xì)菌時盲腸中活的細(xì)菌的數(shù)量之間的關(guān)系。
圖14顯示了所施用的腸細(xì)菌的量與干排泄物中雙酚A的濃度之間的關(guān)系。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明用作擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收劑的腸細(xì)菌是一些微生物，它們是已知的用于食品(乳酸菌飲料、酸奶等)加工的菌株，而且對人類是極其安全的。本發(fā)明的腸細(xì)菌不僅包括存在于腸內(nèi)的細(xì)菌，而且包括來自食物和飲料的并在腸內(nèi)長時間停留的細(xì)菌。
腸細(xì)菌的例子有屬于下列菌屬的微生物乳桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、乳球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸道球菌屬(Enterococcus)、Weissella、明串珠菌屬(Leuconostoc)、Tetragenococcus、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、類桿菌屬(Bacteroides)、梭菌屬(Clostridium)、真桿菌屬(Eubacterium)、(Prevotella)、小球菌屬(Pediococcus)和巨球形菌屬(Megasphaera)。
所有屬于上述菌屬的微生物都很容易得到。特別優(yōu)選的微生物的具體例子如下·干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029FERM BP-1366(1981年5月1日)·嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidphilus)YIT 0168FERM BP-7536(1981年12月16日)·短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)YIT 4065FERM BP-6223(1996年2月29日)·兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)YIT 4007FERM BP-791(1981年5月1日)·乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)YIT 2027FERM BP-6224(1997年2月10日)·嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)YIT 2001FERM BP-7538(2001年1月31日)·嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)YIT 2021FERM BP-7537(1996年11月1日)上述微生物保藏在國家產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所國際專利生物保藏中心(International Patent Organism Depositary National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology*)，AIST Tsukuba Central6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566日本(*現(xiàn)名)。
·屎腸球菌(Enterococcus faecium)YIT 2039·Weissella confusa YIT 0233·嗜檸檬酸明串珠菌(Leuconostoc lactis)YIT 3001·Pediococcus acidilactici YIT 3025·丙酸丙酸桿菌(Propionibacterium acidipropionici)YIT 3051·埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)YIT 6063本發(fā)明的活的腸細(xì)菌可通過在含有酵母提取物和聚胨的復(fù)合培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)而得到。下面給出了優(yōu)選的復(fù)合培養(yǎng)介質(zhì)的組成。上述微生物既可單獨(dú)使用，也可以兩種或兩種以上本發(fā)明的腸細(xì)菌結(jié)合使用。兩種或兩種以上的屬于不同種或?qū)俚奈⑸锟山Y(jié)合使用。(復(fù)合培養(yǎng)介質(zhì))改性GAM液體培養(yǎng)基(日水制藥株式會社制) 41.7gD-(+)-葡萄糖(和光純藥工業(yè)株式會社制)10.0g聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯 1.0g(和光純藥工業(yè)株式會社制)去離子水1.0L(pH7.3)可以得到上述腸細(xì)菌的熱處理細(xì)胞(死細(xì)菌)，例如，通過在80-120℃的溫度下加熱上述活的細(xì)菌約15到30分鐘。
另一方面，本發(fā)明的腸細(xì)菌的成分可由常規(guī)方法得到。腸細(xì)菌的成分可以是用下述適當(dāng)方法處理腸細(xì)菌所得到的產(chǎn)物，這些方法不會對本發(fā)明的效果造成不利影響。腸細(xì)菌的成分可包括通過用細(xì)胞壁消化酶處理上述細(xì)胞而除去細(xì)胞壁所得到的原生質(zhì)體成分；通過用細(xì)胞壁消化酶處理上述細(xì)胞所得到的可溶成分；通過用有機(jī)溶劑處理原生質(zhì)體成分所得到的細(xì)胞質(zhì)膜成分；上述細(xì)胞的研磨產(chǎn)物；以及通過用核酸酶和蛋白酶處理上述細(xì)胞的研磨產(chǎn)物所得到的細(xì)胞壁成分。
活細(xì)菌、熱處理的細(xì)菌(死細(xì)菌)和由上述方法所得到的腸細(xì)菌的成分(下稱“腸細(xì)菌細(xì)胞”)的自身，或所述成分與已知的藥用載體的結(jié)合體被用作本發(fā)明的擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收劑。
盡管根據(jù)細(xì)胞種類的不同，用來有效抑制腸道內(nèi)擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)發(fā)生作用的吸收劑的劑量也有所不同，但是，10mg-30g/天，優(yōu)選1-5g/天的劑量一般是足夠了。因此，本發(fā)明的擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收劑可被配制成能夠提供該劑量的適當(dāng)?shù)闹苿?br> 此外，可將本發(fā)明的擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收劑摻入到各種食物和飲料中。這類食物和飲料的例子有發(fā)酵乳、果汁、湯、米餅以及小甜餅。盡管對于加入到食物和飲料中的該擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收劑的量沒有限制，但其用量應(yīng)當(dāng)足以使一個人最終達(dá)到上述限定的劑量。
這樣所得到的本發(fā)明的擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收劑以及含有該吸收劑的食物和飲料可吸收多種擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)，例如雙酚如雙酚A、烷基酚如4-壬基酚和三嗪如阿特拉津，從而阻止了這些化學(xué)物質(zhì)在體內(nèi)的吸收，并促進(jìn)了這些化學(xué)物質(zhì)的排泄。所以擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收劑可保護(hù)內(nèi)分泌系統(tǒng)不受這些化學(xué)物質(zhì)的侵害。實(shí)施例通過實(shí)施例將對本發(fā)明做更為詳細(xì)的描述，但不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為這些實(shí)施例是對本發(fā)明進(jìn)行限制。在下列實(shí)施例中，按照下述方法用動物測定了細(xì)菌對擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收量和排泄量。(1)微生物對雙酚A的吸收作用(a)試樣的制備將白金環(huán)上的存儲在分散介質(zhì)中的細(xì)胞接種到試管(15ml)中的10ml上述復(fù)合培養(yǎng)介質(zhì)中，并且在37℃下孵育。24小時之后，將試管的內(nèi)容物置于含有240ml相同介質(zhì)的錐形瓶(500ml)中，將該混合物在37℃下靜置16小時。培養(yǎng)后，將液體培養(yǎng)基離心分離為細(xì)胞和上清液，同時在下述條件下冷卻。用磷酸鹽緩沖液(20mM的磷酸二氫鉀水溶液與20mM的磷酸氫二鉀的水溶液的混合物，調(diào)節(jié)至pH7.0)洗滌所述細(xì)胞。使經(jīng)過洗滌的細(xì)胞或通過在80℃下處理該細(xì)胞30分鐘所得到的熱處理細(xì)菌懸浮在磷酸緩沖液中，留待吸收性測試時使用。(冷卻離心分離的條件)冷卻離心分離器RS-18III(Tomy精工株式會社制)轉(zhuǎn)子TA-18BH(Tomy精工株式會社制)轉(zhuǎn)速(重力加速)8,000rpm(12,000×g)離心時間20分鐘溫度4℃(b)雙酚A試樣的制備用10ml的容量瓶在電子天平上稱出100mg的雙酚A(東京化成工業(yè)株式會社制)，將其溶解于乙醇(和光純藥工業(yè)株式會社制，特級)，最終得到精確的體積10ml。用移液管將1ml該溶液轉(zhuǎn)移到另一個容量瓶(50ml)中，然后用乙醇精確地稀釋至50ml。
用如下化學(xué)式(IV)的雙酚B作為內(nèi)標(biāo)物。 (c)微生物對雙酚A的吸收及雙酚A殘余量的測定將由(b)所得到的0.2ml雙酚A的乙醇溶液加入到玻璃試管中，該玻璃試管中裝有3.8ml由上述(a)所得到的活細(xì)菌或熱處理細(xì)菌的上清液。充分?jǐn)嚢柙摶旌衔铮⒃?7℃的水浴中靜置。60分鐘后，離心使細(xì)胞沉淀，用一個單獨(dú)的玻璃管收集0.95ml上清液。加入0.05ml乙醇溶液(雙酚B內(nèi)標(biāo)物)及1ml二氯甲烷，然后用振蕩器劇烈振蕩該玻璃管。20分鐘后，用離心方法將二氯甲烷層從水層中分離出來，用另一個玻璃管收集0.2ml二氯甲烷層。將二氯甲烷蒸干，使殘余物在干燥器中過夜。在沒有微生物存在下，通過上述步驟得到的試樣作為陰性對照。
接下來，將0.16ml二氯甲烷加入該殘余物。在重新溶解雙酚A之后，加入N，O-雙(三甲基甲硅烷基)-三氟乙酰胺(BSTFA)，從而將酚基進(jìn)行三甲基硅烷基化。室溫下靜置該混合物1小時。反應(yīng)之后，在下述條件下用氣相色譜(GC)對雙酚A進(jìn)行定量分析。(氣相色譜測定條件)氣相色譜儀GC-14A(株式會社島津制作所制)毛細(xì)柱NEUTRABOND-1(GL Science Inc.制，25m×0.25mm；df＝0.4μm)柱溫100℃到300℃，10℃/分鐘載氣氦注射器分流式(Split)，T＝310℃檢測器FID(火焰電離檢測器)，T＝310℃注射體積1μl分析時間20分鐘(d)由雙酚A殘余物的量計算被微生物所吸收的雙酚A的量根據(jù)下列方程，由上述(c)所確定的未被微生物吸收的雙酚A的量計算被微生物所吸收的雙酚A的量。
Y＝X-(SA×CB/SB×CA)×XY被微生物所吸收的雙酚A的量X加入到反應(yīng)溶液中的雙酚A的量
CA沒有微生物存在的條件下反應(yīng)溶液中所含的雙酚A的峰面積CB相應(yīng)于CA的雙酚B的峰面積SA未被微生物吸收的雙酚A的峰面積SB相應(yīng)于SA的雙酚B的峰面積(e)微生物對雙酚A的吸收及雙酚A吸收量的測定將由上述(b)所得到0.2ml的雙酚A的乙醇溶液加入玻璃試管中，該玻璃試管中裝有3.8ml由上述(a)所描述的活細(xì)菌或熱處理細(xì)菌的上清液。充分?jǐn)嚢柙摶旌衔铮缓笤?7℃的水浴中靜置。60分鐘后，離心使細(xì)菌沉淀，將上清液置于一個單獨(dú)的玻璃管中。用磷酸鹽緩沖液(20mM的磷酸二氫鉀水溶液與20mM的磷酸氫二鉀的水溶液的混合物，調(diào)節(jié)至pH7.0)洗滌該細(xì)菌兩次。向該細(xì)菌團(tuán)及上清液加入20μg雙酚A-d16(代用藥)和2ml二氯甲烷，劇烈振蕩該混合物(200次/分鐘)。20分鐘后，將離心所得到的0.2ml的上清液收集到一個單獨(dú)的玻璃管中。將二氯甲烷蒸干，使該殘余物在干燥器中放置過夜。
接下來，向該殘余物中加入0.26ml二氯甲烷。待雙酚A重新溶解后，加入BSTFA將酚基進(jìn)行三甲基硅烷基化。將該混合物在室溫下放置1小時。三甲基硅烷基化(TMS)反應(yīng)之后，加入0.1ml菲-d10(內(nèi)標(biāo)物)的二氯甲烷(10μg/ml)溶液，在下述條件下用氣相色譜/質(zhì)譜儀(GC/MS)定量分析雙酚A。(氣相色譜測定條件)氣相色譜儀GC-17A(株式會社島津制作所制)毛細(xì)柱HP-5(Aglient Inc.制造，30m×0.25mm；df＝0.25mm)液相5％的苯基甲基聚硅氧烷柱溫60℃(1分鐘)至280℃(5分鐘)，10℃/分鐘入口溫度280℃注射方式不分流法(Splitless)(1分鐘后清洗)
注射體積1μl載氣高純度氦氣，線速度＝44cm/秒界面溫度280℃取樣時間1分鐘分析時間28分鐘(質(zhì)譜檢測條件)質(zhì)譜儀QP5000(株式會社島津制作所制)離子化方法EI(電子撞擊)(70eV)檢測器電壓1.5kV檢測方式SIM取樣速度0.2秒(被檢離子)測試物與代用藥中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的被檢離子如下表1所示。
表1

*TMS(三甲基硅烷基化)衍生物(f)被微生物所吸收的雙酚A的量的計算由GC/MS測定所得到的雙酚A的三甲基硅烷基化(TMS)產(chǎn)物的峰面積與代用藥的峰面積之比得到校準(zhǔn)曲線，用該校準(zhǔn)曲線確定被檢測的雙酚A的量。然后根據(jù)測得的量、注射到GC/MS裝置中的試樣的量、濃度放大(concentration magnification)等按下式計算雙酚A的量。
Y＝D×(L×1000/I)Y被微生物所吸收的雙酚A的量(μg)D由GC/MS檢測得到的量(μg)
L試樣的最終液量(ml)I注射到GC/MS中的試樣的量(μl)(2)不同微生物對4-壬基酚的吸收作用(a)試樣的制備試樣的制備采用與上述(1)(a)相同的方法。(b)制備4-壬基酚的試樣用10ml的容量瓶在電子天平上稱出100mg的4-壬基酚(GL Science Inc.公司生產(chǎn))，將其溶解于乙醇，得到的最終體積精確為10ml。用移液管將3ml該溶液轉(zhuǎn)移到另一個容量瓶(50ml)，然后用乙醇精確稀釋到50ml。
用上述的雙酚B作內(nèi)標(biāo)物。(c)微生物對4-壬基酚的吸收及4-壬基酚殘余量的測定將由(b)所得的0.2ml的4-壬基酚的乙醇溶液加入玻璃試管中，該玻璃試管中裝有3.8ml由上述(a)所描述的活細(xì)菌或熱處理細(xì)菌的上清液。充分?jǐn)嚢柙摶旌衔铮缓笤?7℃的水浴中靜置。60分鐘后，離心使細(xì)胞沉淀，將0.95ml上清液收集在一個單獨(dú)的玻璃管中。加入0.05ml乙醇溶液(雙酚B內(nèi)標(biāo)物)和1ml二氯甲烷，用振蕩器劇烈振蕩該試管。20分鐘后，用離心方法將二氯甲烷層從水層中分離出來，用另一個玻璃管收集0.2ml二氯甲烷層。將二氯甲烷蒸干，使殘余物在干燥器中過夜。在沒有微生物存在下，通過上述步驟得到的試樣作為陰性對照。
接下來，將0.16ml二氯甲烷加入該殘余物。在重新溶解4-壬基酚之后，加入N，O-雙(三甲基硅烷基)-三氟乙酰胺(BSTFA)，從而將酚基進(jìn)行三甲基硅烷基化。該混合物在室溫下靜置1小時。三甲基硅烷基化反應(yīng)之后，在與測定雙酚A所用的相同條件下用氣相色譜(GC)對4-壬基酚進(jìn)行定量分析。(d)計算被微生物所吸收的4-壬基酚的量根據(jù)下列方程，由上述(c)所確定的未被微生物吸收的4-壬基酚的量計算被微生物所吸收的4-壬基酚的量。
Y＝X-(SA×CB/SB×CA)×XY被微生物所吸收的4-壬基酚的量X加入到反應(yīng)溶液中的4-壬基酚的量CA沒有微生物存在的條件下反應(yīng)溶液中所含的4-壬基酚的峰面積CB相應(yīng)于CA的4-壬基酚的峰面積SA未被微生物吸收的4-壬基酚的峰面積SB相應(yīng)于SA的4-壬基酚的峰面積(3)不同微生物對阿特拉津的吸收作用(a)試樣的制備試樣的制備采用與上述(1)(a)相同的方法。(b)制備阿特拉津的試樣用10ml的容量瓶在電子天平上稱出100mg的阿特拉津(GL Science Inc.公司生產(chǎn))，將其溶解于乙醇(和光純藥工業(yè)株式會社制，特級)得到的最終體積精確為10ml。用移液管將3ml該溶液轉(zhuǎn)移到另一個容量瓶(50ml)，然后用乙醇精確稀釋到50ml。(c)微生物對阿特拉津的吸收及阿特拉津殘余量的測定將由上述(b)所得的0.2ml的阿特拉津的乙醇溶液加入玻璃試管中，該玻璃試管中裝有3.8ml由上述(a)所描述的活細(xì)菌或熱處理細(xì)菌的上清液。充分?jǐn)嚢柙摶旌衔铮缓笤?7℃的水浴中靜置。60分鐘后，離心使細(xì)菌沉淀，將1ml上清液收集在一個單獨(dú)的玻璃管中。加入1ml二氯甲烷，用振蕩器劇烈振蕩該試管。20分鐘后，用離心方法將二氯甲烷從水層中分離出來，用另一個玻璃管收集0.2ml二氯甲烷層。將二氯甲烷蒸干，使殘余物在干燥器中過夜。在沒有微生物存在下，通過上述步驟得到的試樣作為陰性對照。
將乙腈與50mM NH4H2PO4水溶液之比為55∶45的0.2ml混合物加入該殘余物，以便溶解阿特拉津。然后，在下述條件下用HPLC(高效液相色譜)對阿特拉津進(jìn)行定量分析。(HPLC測定條件)HPLC儀Waters 2690(Waters Corp.制)柱對稱C185mm(Waters Corp.制，4.6×150mm)柱溫37℃流速1ml/分鐘流動相乙腈(和光純藥工業(yè)株式會社制，HPLC用)與50mM NH4H2PO4水溶液之比為55∶45的混合物檢測器Waters 996光電二極管陣列檢測器(Waters Corp.制)波長230nm分析時間10分鐘(d)計算被微生物所吸收的阿特拉津的量根據(jù)下列方程，由上述(c)所確定的未被微生物吸收的阿特拉津的量計算被微生物所吸收的阿特拉津的量。
Y＝X-(S/C)×XY被微生物所吸收的阿特拉津的量X加入到反應(yīng)溶液中的阿特拉津的量S未被微生物所吸收的阿特拉津的峰面積C沒有微生物存在時反應(yīng)溶液中所含的阿特拉津的峰面積(4)微生物對大鼠的雙酚A的排泄的影響(a)試樣食物的制備以及動物實(shí)驗(yàn)組的準(zhǔn)備根據(jù)AIN-76組合物(美國營養(yǎng)學(xué)會特別委員會關(guān)于營養(yǎng)研究標(biāo)準(zhǔn)的報告(Report of the American Institute of Nutrition Ad Hoc Committeeon Standards for Nutritional Studies)；J.Nutr.，107，1340 1977)制備表2所示的試樣食物組合物。采用了4個實(shí)驗(yàn)組，每組由8只動物組成。給其中3個組中的每只動物喂含有2.5％、5％或10％凍干的活細(xì)菌的食物，給其他組(對照組)喂不含細(xì)菌的食物。每份食物均含有15％的脫脂奶粉，在凍干細(xì)菌時，該脫脂奶粉被用作保護(hù)劑。食物組合物如下表2所示。
表2

(b)動物及其喂食方法飼養(yǎng)Fisher 2344雌性大鼠(鼠齡10周，由Clea Japan，Inc.公司提供)直到其適應(yīng)環(huán)境(用Oriental Yeast Co.，Ltd.公司生產(chǎn)的MF食物自由給食)。一周后，將該大鼠按體重分為7組。用試驗(yàn)食物給食12天，在此期間，根據(jù)大鼠的需求盡量為其提供多的食物和水。飼養(yǎng)條件為室溫25℃，相對濕度55％，12小時光照和12小時黑暗交替進(jìn)行。(c)雙酚A的施用方法及排泄物的收集方法用試驗(yàn)食物飼養(yǎng)這些動物5天后，禁食一夜。次日，施用10g含有100μg雙酚A的試驗(yàn)試樣食物。在開始施用雙酚A后，收集全部的排泄物并凍干7天。(d)從排泄物中分離雙酚A按照《廢水中擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的檢測手冊》(MANUAL FORINVESTIGATION OF ENDOCRINE DISRUPTING CHEMICALS IN SEWERAGE)(日本廢水工程技術(shù)學(xué)會(Japan Institute of Wastewater EngineeringTechnology))和《擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)(環(huán)境激素)的分析》(ANALYSISOF ENDOCRINE DISRUPTING CHEMICALS(ENIRONMENT HORMONES))(III)(GLSciences，Inc.)中所描述的方法從排泄物中分離雙酚A。
采用一種用于檢測殺蟲劑殘余物的有機(jī)溶劑來提取雙酚A。將0.5g凍干的排泄物放入玻璃試管，加入1μg雙酚A-d16(代用藥)和10ml甲醇。劇烈振蕩該混合物(200次/分鐘)。將離心(2,000rpm，20分鐘)得到的上清液收集在一個單獨(dú)的玻璃試管中。向殘余物中加入10ml甲醇。劇烈振蕩該混合物，然后與此前得到的上清液混合。將該上清液(約20ml)濃縮至約5ml。加入0.125ml純凈水和2.5ml正己烷之后，將該混合物劇烈振蕩(200次/分鐘)。10分鐘后，正己烷層消失，然后將2.5ml新的正己烷加入甲醇層，將該混合物劇烈振蕩(200次/分鐘)。10分鐘后，將甲醇層濃縮至約1ml，通過加入0.125N HCl水溶液將所得的濃縮物調(diào)節(jié)pH值至3。
向該溶液中加入4ml 3.75％的鹽水和5ml二氯甲烷，將該混合物劇烈振蕩(200次/分鐘)。10分鐘后，將下部的二氯甲烷層轉(zhuǎn)移到一個單獨(dú)的玻璃試管中。向上層加入5ml新的二氯甲烷，將該混合物劇烈振蕩(200次/分鐘)。10分鐘后，將該二氯甲烷層與此前得到的二氯甲烷層混合，然后將該混合物濃縮至約5ml。向該濃縮物中加入1.5g無水硫酸鈉進(jìn)行脫水。將該溶液加載到硅膠柱(40mm×12mm)上，加入10ml正己烷，同時排出洗出液。接下來，加入10ml丙酮，同時收集洗出液。將所得到的洗出液干燥至固化，向其殘余物加0.26ml的二氯甲烷，以便重新溶解雙酚A。
加入BSTFA將酚基進(jìn)行三甲基硅烷化。使該混合物在室溫下放置1小時。在三甲基硅烷化反應(yīng)之后，加入0.1ml菲-d10(內(nèi)標(biāo)物)的二氯甲烷溶液(10μg/ml)，在下述條件下用氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)對雙酚A進(jìn)行定量分析。(e)GC/MS測定條件GC/MS的測定與上述(2)(d)的方法相同。(f)雙酚A的定量分析由GC/MS測定所得到的雙酚A的三甲基硅烷基化(TMS)產(chǎn)物的峰面積與雙酚A-D16的峰面積之比得到校準(zhǔn)曲線，用該校準(zhǔn)曲線確定被檢測的雙酚A的量。然后根據(jù)測得的量、注射到GC/MS裝置中的試樣的量、測試中所用的排泄物的量以及濃度放大等，按下式計算雙酚A的量。
Y＝D×(L×1000/I)/FY被微生物所吸收的雙酚A的量(μg/g)D由GC/MS檢測得到的量(μg)L試樣的最終液量(ml)I注射到GC/MS中的試樣的量(μl)F測試中所用的排泄物的量(g)(g)盲腸內(nèi)容物中活細(xì)菌數(shù)量的測定按照上述(a)的方法給大鼠施用活細(xì)菌12天，用戊巴比妥麻醉大鼠后取出盲腸，然后在冰中保存。按照Yuki等(Norikatsu YUKI，YukikoSAKAITANI，Yoko TAGAMI，and Masami MORTOMI，發(fā)酵乳中的Lactobacilluscasei Strain Shirota在消化道中的殘余物的性質(zhì)(Digestive TractRemaining Properties Of Lactobacillus casei Strain Shirota InFermented Milk)，營養(yǎng)食品雜志(Journal of Nutrition Food)2，1-6，1999)或Asahara等(Takashi ASAHARA，Kensuke SHIMIZU，Yuji OHASHI，Takahiro MATSUKI，Kazumasa MATSUMOTO，Toshiihiko TAKADA，NorikatsuYUKI，Hirooo TAKAYAMA，and Ryuichiro TANAKA，雙歧桿菌-發(fā)酵乳對人類泌尿系統(tǒng)誘變性的影響——攝入熟的攪細(xì)的牛肉后該影響增加了(TheEffects of Bifidobacteria-Fermented Milk on Human UrinaryMutagenicity，Which Increases Following Ingestion of Cooked GroundBeef)，腸內(nèi)微生物學(xué)雜志(Journal of Intestinal Microbiology)，12，89-96，1999)的方法測定盲腸內(nèi)容物中活細(xì)菌的數(shù)量。(h)統(tǒng)計分析根據(jù)Dunnett的多因素對照方法對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。實(shí)施例1干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029對雙酚A的吸收(1)根據(jù)上述(1)(a)所描述的試樣制備方法得到干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029的活細(xì)菌或熱處理細(xì)菌。采用這些試樣測定了該微生物的濃度與雙酚A的量之間的關(guān)系。制備不同濃度(0、0.625、1.25、2.5、5和10g/l)的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT9029的活細(xì)菌或熱處理細(xì)菌的試樣。將40μg的雙酚A加入到這些試樣中并反應(yīng)，隨后用氣相色譜分析殘留在上清液中的雙酚A的量，從而確定被吸收的雙酚A的量。結(jié)果如圖1所示。(結(jié)果)如圖1所示，干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029所吸附的雙酚A的量隨反應(yīng)溶液總中該細(xì)胞濃度的增加而增加。活細(xì)菌或熱處理細(xì)菌均顯示出了吸收作用。已經(jīng)確定雙酚A對熱處理細(xì)菌的吸收多于對活細(xì)菌的吸收。于是本發(fā)明的活細(xì)菌和熱處理細(xì)菌均顯示出了吸收性。
因此，可以確定，采用這些微生物制備的食物和飲料不一定需要含有活細(xì)菌，而是這些食物和飲料可以在很寬的條件范圍如溫度、pH等下制備。實(shí)施例2干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029對雙酚A的吸收(2)采用微生物干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029的活細(xì)菌研究了細(xì)菌濃度、吸收的雙酚A的量以及殘余的雙酚A的量之間的關(guān)系。制備不同濃度(0、0.625、1.25、2.5、5和10g/l)的干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)YIT 9029活細(xì)菌試樣。向這些試樣加入20μg雙酚A。反應(yīng)后，分別按照上述(1)(c)和(1)(e)所描述GC/MS方法和氣相色譜方法，并按照上述(1)(d)和(f)所述的計算公式，對被細(xì)菌所吸收的的雙酚A和殘余的雙酚A的量進(jìn)行定量分析。結(jié)果如表2所示。(結(jié)果)如表2所示，被干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029所吸收的雙酚A的量隨反應(yīng)溶液中微生物的濃度增加而增加。相比之下，離心或殘留在上清液中的雙酚A的量則隨微生物的濃度增加而降低。在此情形下，被吸收的雙酚A的量與殘留在上清液中的雙酚A的量之和與加入到反應(yīng)溶液中的雙酚A的量(20μg)相等。
這表明，所有未被細(xì)菌吸收的雙酚A都存在于離心后的上清液中。所以，根據(jù)離心后殘留在上清液中的雙酚A的量所計算出來的被細(xì)菌吸收的雙酚A的量就等于實(shí)際被細(xì)菌所吸收的雙酚A的量。實(shí)施例3干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029對雙酚A的吸收(3)采用微生物干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029的活細(xì)菌和熱處理細(xì)菌以及進(jìn)行動物試驗(yàn)的食物(商品名“F-2”，船橋農(nóng)場社制)研究了微生物濃度或食物與被吸收的雙酚A之間的關(guān)系。制備不同濃度(0、0.625、1.25、2.5、5和10g/l)的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT9029活細(xì)菌和熱處理細(xì)菌以及食物試樣。向這些試樣加入40μg雙酚A并進(jìn)行反應(yīng)。隨后按照氣相色譜方法分析殘留在上清液中的雙酚A的量，以確定被吸收的雙酚A的量。結(jié)果如圖3所示。(結(jié)果)如圖3所示，在一定的食物濃度范圍內(nèi)，被干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)YIT 9029所吸收的雙酚A的量隨反應(yīng)溶液中細(xì)胞濃度的增加而增加。另一方面，如圖4所示，一定濃度范圍內(nèi)的干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)YIT 9029細(xì)胞所吸收的雙酚A的量不受反應(yīng)溶液中食物濃度的影響。
這些結(jié)果表明，干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029細(xì)胞在人和動物的消化道內(nèi)選擇性地吸收雙酚A的能力不受食物存在與否的影響。實(shí)施例4干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029對雙酚A的吸收(4)采用微生物干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029的活細(xì)菌和熱處理細(xì)菌研究了pH值與被吸收的雙酚A的量之間的關(guān)系。20mg的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029細(xì)胞和40μg雙酚A溶于4ml的緩沖溶液中并加熱至37℃。60分鐘后，測定吸收量。制備pH2-9的試樣溶液。向20mM的KH2PO4水溶液中加入鹽酸，制得pH為2到4的緩沖溶液。將20mM的KH2PO4水溶液與20mM的K2HPO4水溶液混合制得pH為5到8的緩沖溶液，由20mM的K2HPO4水溶液制得pH為9的緩沖溶液。結(jié)果如圖5所示。(結(jié)果)如圖5所示，當(dāng)采用干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029的熱處理細(xì)菌時，不論反應(yīng)溶液的pH值如何，被吸收的雙酚A的量幾乎是相同的。相比之下，在酸性范圍(pH2)內(nèi)，活細(xì)菌吸收了較多量的雙酚A。在任何pH范圍內(nèi)，熱處理細(xì)胞比活細(xì)菌吸收的雙酚A的量要多。
該結(jié)果肯定地表明，消化道從食道到肛門的各個部分的pH值不同，但其中的微生物均具有吸收雙酚A的能力。此外，采用活細(xì)菌或死細(xì)菌均顯示出了吸收作用。實(shí)施例5干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029對雙酚A的吸收(5)采用微生物干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029的活細(xì)菌和熱處理細(xì)菌研究了反應(yīng)時間與被吸收的雙酚A的量之間的關(guān)系。20mg的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029細(xì)胞和40μg雙酚A懸浮于4ml的緩沖溶液中并加熱至37℃。分別在1分鐘、2分鐘、5分鐘、10分鐘、30分鐘、60分鐘和1440分鐘(24小時)后測定吸收量。結(jié)果如圖6所示。(結(jié)果)如圖6所示，當(dāng)采用活細(xì)菌或熱處理細(xì)菌時，在反應(yīng)開始后均很快就達(dá)到了雙酚A的最大吸收量，而且在全部24小時(1440分鐘)的測試過程中一直保持了吸收作用。
該結(jié)果表明，吸收了雙酚A的微生物可被沿消化道輸送到肛門并作為排泄物排出，而在此過程中不釋放出雙酚A。實(shí)施例6不同微生物對雙酚A的吸收20mg的活細(xì)菌或熱處理細(xì)菌以及40μg的雙酚A懸浮于4ml的緩沖溶液中，并在37℃的溫度下靜置。60分鐘后，測定離心后上清液中殘留的雙酚A的量，以確定被細(xì)菌所吸收的雙酚A的量。用1mg細(xì)胞所吸收的雙酚A的量(μg)來表示被微生物所吸收的雙酚A的單位量。結(jié)果如圖7所示。
作為對照，研究了據(jù)說能夠吸收擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的纖維素對雙酚A的吸收能力。動物試驗(yàn)中采用了作為食物纖維的植物纖維素(東洋濾紙公司生產(chǎn))和細(xì)菌纖維素(由Acetobactor pasteuria YIT 6109制得的纖維素)，該細(xì)菌纖維素比植物纖維素具有更細(xì)的纖維結(jié)構(gòu)。結(jié)果圖8所示。(結(jié)果)如圖7所示，盡管不同種類的微生物所吸收的雙酚A的量不同，但本發(fā)明所有的微生物都能夠吸收雙酚A。所有的微生物的活細(xì)菌和死細(xì)菌均吸收了較大量的雙酚A。
另一方面，如圖8所示，植物纖維素幾乎沒有吸收雙酚A。具有比植物纖維素更細(xì)的纖維結(jié)構(gòu)的細(xì)菌纖維素也吸收了雙酚A，但其對雙酚A的吸收作用明顯小于本發(fā)明的微生物。
該結(jié)果表明，并非在任何條件下任何食物纖維和微生物均對雙酚A有吸收作用，這僅是本發(fā)明的腸細(xì)菌的固有性質(zhì)。實(shí)施例7不同微生物對4-壬基酚的吸收試驗(yàn)2.5mg的活細(xì)菌和40μg的4-壬基酚懸浮于4ml的緩沖溶液中，并在37℃下靜置。60分鐘后測定被細(xì)胞所吸收的4-壬基酚的量。用1mg細(xì)胞所吸收的4-壬基酚的量(μg)來表示4-壬基酚的吸收量。結(jié)果如圖9所示。(結(jié)果)如圖9所示，盡管不同種類的微生物所吸收的4-壬基酚的量不同，但本發(fā)明的所有微生物都吸收了4-壬基酚。所有的微生物的活細(xì)菌和死細(xì)菌均吸收了較大量的4-壬基酚。實(shí)施例8不同微生物對阿特拉津的吸收試驗(yàn)20mg的活細(xì)菌或熱處理細(xì)菌以及40μg的阿特拉津懸浮于4ml的緩沖溶液中，并在37℃下靜置。60分鐘后測定被細(xì)胞所吸收的阿特拉津的量。用1mg細(xì)胞所吸收的阿特拉津的量(μg)來表示微生物所吸收的阿特拉津的單位量。結(jié)果如圖10所示。(結(jié)果)如圖10所示，盡管不同種類的微生物所吸收的阿特拉津的量不同，但本發(fā)明的所有微生物都吸收了阿特拉津。所有的微生物的活細(xì)菌和死細(xì)菌均吸收了較大量的阿特拉津。實(shí)施例9大鼠消化道內(nèi)干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029或短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)YIT 4065對雙酚A的吸收采用微生物干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029或短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)YIT 4065研究了所施用的細(xì)菌的量與雙酚A的排泄量之間的關(guān)系。加入凍干的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT9029或短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)YIT 4065細(xì)菌至最終濃度為0％、2.5％、5％和10％，從而制備得到作為試樣的動物食物。作為對照，采用了加入食物纖維素(東洋濾紙制)至最終濃度為10％而得到的食物。按照(4)(c)所述的步驟，在給動物飼喂試樣食物5天后禁食一晚，施用10g含有100μg雙酚A的試樣食物。
從開始施用雙酚A之后，收集7天的全部排泄物，測量排泄物的重量、排泄物中雙酚A的量、食物的消耗量以及體重的增加。此外，測定開始施用試樣食物后第7天大鼠盲腸內(nèi)容物中活細(xì)菌的數(shù)量。(結(jié)果)如圖11所示，7天中對照組的大鼠排泄物中的雙酚A的量為17μg，僅為所施用的雙酚A(100μg)的17％。另一方面，施用了干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029或短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)YIT 4065的大鼠，其排泄物中雙酚A的量隨所施用的細(xì)菌量的增加而增加?？梢源_定，給動物飼喂含有10％該細(xì)菌的食物時，所施用的45-48％的雙酚A被排泄掉了。在試驗(yàn)期間，測試組大鼠的體重和食物消耗量均未發(fā)生變化。
另一方面，如圖12所示，在施用雙酚A的頭7天里，排泄物的量隨細(xì)菌施用量的增加而增加。此外，如圖13所示，在施用雙酚A后的第7天，大鼠盲腸內(nèi)容物中的活細(xì)菌的數(shù)量隨細(xì)菌施用量的增加而增加。該結(jié)果表明，施用細(xì)菌后腸內(nèi)的活細(xì)菌增加了，而這促進(jìn)了排泄。
進(jìn)而，如圖14所示，不同的組中大鼠排泄物中排泄出的雙酚A的濃度不同，但與對照組及施用了植物纖維素的組相比，所有施用了細(xì)菌的組均顯示排泄物中雙酚A的濃度有明顯的增加。
所有這些結(jié)果均表明，干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029和短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)YIT 4065能夠抑制消化道內(nèi)隨食物攝入的雙酚A的吸收，并能促進(jìn)雙酚A通過排泄物的排泄。該結(jié)果還表明，通過施用細(xì)菌使排泄物中雙酚A的排泄增加，其原因不僅在于施用細(xì)菌之后排泄物增加了，而且在于細(xì)菌對雙酚A的吸收也增加了。實(shí)施例10不同食物組合物的制備采用本發(fā)明的微生物制備了各種食物組合物。配方如下所示，但不應(yīng)當(dāng)將其認(rèn)為是對本發(fā)明的限制。(1)保健品(片狀)按下述方法制成片狀組合物。
(組分) 含量(wt％)干的腸細(xì)菌細(xì)胞1)10植物提取物粉末 30蜂王漿粉5膠原蛋白粉 5乳糖25玉米淀粉20羥丙基纖維素4硬脂酸鎂11)通過將由實(shí)施例1得到的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029的活細(xì)菌或熱處理細(xì)菌凍干進(jìn)行制備。(2)保健飲品按下述配方制成保健飲品。
(組分)含量(wt％)干的腸細(xì)菌細(xì)胞1)5
蜂蜜 15枸櫞酸0.1dl-馬來酸 0.1植物提取物液體(肉桂) 20D-山梨糖醇溶液(70％) 10苯甲酸鈉 0.05香料 適量純凈水余量1)通過將由實(shí)施例1得到的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029的活細(xì)菌或熱處理細(xì)菌凍干進(jìn)行制備。(3)果汁按下述配方制成果汁。
(組分)含量(wt％)干的腸細(xì)菌細(xì)胞1)5液態(tài)纖維素33葡萄汁60香料 適量酸味劑適量1)通過將由實(shí)施例1得到的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029的活細(xì)菌或熱處理細(xì)菌凍干進(jìn)行制備。(4)發(fā)酵乳按下述配方制成發(fā)酵乳。(A)由一種微生物菌株制得的發(fā)酵乳對10％的脫脂奶粉和5％的葡萄糖的混合物殺菌，在其中植入腸細(xì)菌，從而制成發(fā)酵乳。采用下述任一種腸細(xì)菌制備8種發(fā)酵乳干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT 9029、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidphilus)YIT 0168、短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)YIT 4065、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)YIT 4007、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)YIT 2027、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)YIT 2001、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)YIT2021和屎腸球菌(Enterococcus faecium)YIT 2039。所得到的發(fā)酵乳中細(xì)胞的量在0.1g/l至10g/l之間(活細(xì)菌的數(shù)量約4×108到4×1010個細(xì)胞/ml)。所有的發(fā)酵乳都具有香氣并且非?？煽?。(B)用多種微生物菌株的組合制得的發(fā)酵乳對10％的脫脂奶粉和5％的葡萄糖的混合物殺菌，在其中植入下列腸細(xì)菌的組合，從而制成10種發(fā)酵乳。
組合1嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidphilus)YIT0168和干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT9029組合2短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)YIT4065和干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT9029組合3兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)YIT4007和干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT9029組合4乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)YIT2027和干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT9029組合5嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)YIT2001和干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT9029組合6嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)YIT2021和干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT9029組合7屎腸球菌(Enterococcus faecium)YIT2039和干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)YIT9029組合8短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)YIT4065和兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)YIT4007和嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidphilus)YIT0168組合9嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)YIT2021和短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)YIT4065和嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidphilus)YIT0168
組合10嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)YIT2001和短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)YIT4065和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)YIT2027所得到的發(fā)酵乳中細(xì)胞的量在0.1g/l至10g/l之間(活細(xì)菌的數(shù)量約4×108到4×1010個細(xì)胞/ml)。所有的發(fā)酵乳都具有香氣并且非常可口。
工業(yè)實(shí)用性如上所述，腸細(xì)菌或其成分的活細(xì)菌或死細(xì)菌能夠吸收擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)，在人和動物的消化道內(nèi)，所述細(xì)菌能吸收并清除經(jīng)口攝入的擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)如雙酚A、4-壬基酚和阿特拉津，而且，所述細(xì)菌不僅能抑制這類化學(xué)物質(zhì)的體內(nèi)吸收，而且能夠促進(jìn)被體內(nèi)吸收的這類化學(xué)物質(zhì)的排泄。因而，該細(xì)胞及其成分對于防止人類的器官被擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的侵襲非常有用。
腸細(xì)菌已被用來制備食物如乳酸菌飲料、酸奶等，這類細(xì)菌是不會致病的非常安全的微生物。
因此，本發(fā)明的擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收劑含有上述腸細(xì)菌細(xì)胞，該吸收劑不僅能作為藥物或口服制劑，而且能被加入到食物中供日常食用。于是，本發(fā)明的吸收劑對于保護(hù)人類不被擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的侵襲并保持人體健康非常有用。
權(quán)利要求
1.擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收劑，其中含有活的或死的腸細(xì)菌或該細(xì)菌的成分作為活性成分。
2.權(quán)利要求1的擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收劑，其中的擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)為雙酚、烷基酚或三嗪。
3.權(quán)利要求1的擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收劑，其中的腸細(xì)菌為下列微生物中的一種或多種，所述微生物選自由屬于下列菌屬的腸細(xì)菌組成的組乳桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、乳球菌屬(Lactococcus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸道球菌屬(Enterococcus)、Weissella、明串珠菌屬(Leuconostoc)、Tetragenococcus、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、類桿菌屬(Bacteroides)、梭菌屬(Clostridium)、Prevotella和真桿菌屬(Eubacterium)。
4.權(quán)利要求1或3的擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收劑，其中的腸細(xì)菌具有抑制人和動物的腸道對擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收的作用。
5.權(quán)利要求1或3的擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收劑，其中的腸細(xì)菌具有促進(jìn)擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)排泄的作用。
6.權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)的擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收劑，其中采用了腸細(xì)菌的熱處理細(xì)菌。
7.含有吸收劑的食物，所述吸收劑為權(quán)利要求1到6任一項(xiàng)擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收劑。
8.抑制人或動物對擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的體內(nèi)吸收的方法，所述方法包括給人或動物施用擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收劑的步驟。
9.促進(jìn)從人或動物體內(nèi)排泄擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的方法，所述方法包括給人或動物施用擾亂內(nèi)分泌的化學(xué)物質(zhì)的吸收劑的步驟。
全文摘要
擾亂內(nèi)分泌的物質(zhì)的吸收劑，其中所含的活性成分為腸細(xì)菌微生物的活的或死的細(xì)胞或該微生物細(xì)胞的成分。當(dāng)攝入了以雙酚、烷基酚和三嗪為代表的擾亂內(nèi)分泌的物質(zhì)或被這類物質(zhì)所污染的食物和飲料時，日?；蛟跀z入上述物質(zhì)的同時口服該吸收劑，可以抑制這類物質(zhì)被身體吸收，而且這類擾亂內(nèi)分泌的物質(zhì)一旦被身體吸收，該吸收劑還可促進(jìn)其從體內(nèi)排泄。
文檔編號C12N1/21GK1429115SQ01809593
公開日2003年7月9日 申請日期2001年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月16日
發(fā)明者大石憲司, 澤田治司, 橫井稚惠, 吉田康人, 渡邊常一 申請人:株式會社養(yǎng)樂多本社