專利名稱：Attractin(Atrn)和Attractin like 1(AtrnL1)基因雙敲除小鼠心臟病模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用基因敲除的方法建立Attractin like 1 (atrnLl)基因敲除小鼠， 并把它和Attractir^atrn)自然突變的小鼠雜交，得到雙基因敲除，即基因?yàn)閍trn-/-; atrnLl-/"的小鼠，這種動(dòng)物除了有象atrn-/- ；atrn-/-小鼠一樣的中樞神經(jīng)系統(tǒng)海綿狀空泡變性，它們的心臟也出現(xiàn)了嚴(yán)重的病變。本發(fā)明為我們研究人的心臟病的發(fā)病機(jī)理、抗心臟病藥物篩選和心臟疾病的治療方法提供了一個(gè)非常有價(jià)值的動(dòng)物模型。本發(fā)明還涉及所述的基因在心臟病變發(fā)生中的作用。
背景技術(shù)：
Attractin基因變異的小鼠也被稱為Mahogany，首先被用作描寫Agouti小鼠基因變異所引起的毛發(fā)顏色的改變現(xiàn)象。近來(lái)定位克隆mahogany小鼠的變異基因，發(fā)現(xiàn)它們是一個(gè)由14 個(gè)氨基酸組成的富含胱氨酸的I型跨膜蛋白，具有一個(gè)很大的細(xì)胞外微區(qū)，跨膜微區(qū)和一個(gè)較小的細(xì)胞內(nèi)微區(qū)。細(xì)胞外微區(qū)具有軸突誘導(dǎo)和細(xì)胞粘連分子的特征； 目前我們還不了解細(xì)胞內(nèi)微區(qū)的具體功能。Duke-Cohan和他的同事在人體血漿內(nèi)發(fā)現(xiàn)和 Mahogany細(xì)胞外微區(qū)相似的分泌性糖蛋白，在體外能激活T淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞之間的相互作用，因而命名為吸引素(Attractin，Atrn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)人體能夠產(chǎn)生二種Atrn蛋白一種是和小鼠的Mahogany分子非常相似的I型跨膜蛋白，這種Atrn的組織分布和小鼠的Mahogany —樣，包括腦，心，胃，肺，腎和睪丸；而另一種則是沒有跨膜和細(xì)胞內(nèi)微區(qū)的分泌型Atrn，它們的分布則更為廣泛，幾乎表達(dá)于所有受檢組織內(nèi)。由于結(jié)構(gòu)的相似，所以小鼠的Mahogany亦被稱之為Atrn。I. Atrn在免疫系統(tǒng)中的作用實(shí)驗(yàn)證明，Atrn能夠介導(dǎo)單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞之間的結(jié)合反應(yīng)，而這并非通過(guò)簡(jiǎn)單的連接作用，其作用機(jī)制還不太清楚。當(dāng)T淋巴細(xì)胞向單核細(xì)胞運(yùn)動(dòng)時(shí)，單核細(xì)胞還處于靜止?fàn)顟B(tài)。這可能是由于atrn能穩(wěn)定和維持細(xì)胞外的單核細(xì)胞到T淋巴細(xì)胞的趨化性， 也可能是通過(guò)某些趨化因子，或atrn本身和細(xì)胞外的基質(zhì)成分相互結(jié)合而形成的一種趨化作用。II. Atrn在毛發(fā)色素信息調(diào)控系統(tǒng)方面的作用機(jī)制根據(jù)Atrn的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，它們可能在細(xì)胞-細(xì)胞之間的相互反應(yīng)中發(fā)揮重要作用， 但我們現(xiàn)在對(duì)它們特異的生物化學(xué)功能還知之甚少。Mahogany變異首先是由于它能改變 Agouti小鼠的毛發(fā)顏色而被認(rèn)知的。黑色素的信號(hào)傳導(dǎo)通路為探討Atrn的作用提供了一個(gè)較好的系統(tǒng)，使我們能利用現(xiàn)代遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和生物化學(xué)的方法著手研究Atrn的多方面生物學(xué)功能。在正常毛發(fā)生長(zhǎng)過(guò)程中，黑色素細(xì)胞刺激素(a -melanocyte stimulating hormone, α -MSH)作用于黑色素細(xì)胞的膜受體(melanocortin-lrec印tor，Mclr)，一個(gè)與G蛋白偶聯(lián)的具有7個(gè)
3垮膜微區(qū)的細(xì)胞膜受體，激活腺苷酸環(huán)化酶，使細(xì)胞內(nèi)的cAMP升高，從而產(chǎn)生黑色素。正常的C;3h/fej小鼠毛發(fā)是Agouti顏色(棕黃色)，Agouti等位基因A在毛發(fā)生長(zhǎng)過(guò)程中能夠短暫地表達(dá)Agouti蛋白，作用于黑色素細(xì)胞表面的受體Mclr，降低細(xì)胞內(nèi)的cAMP的水平，在黑色素細(xì)胞合成黑色素的的某個(gè)階段暫時(shí)抑制黑色素的產(chǎn)生，轉(zhuǎn)而合成黃色色素，然后在合成黑色素，從而產(chǎn)生一種特有的毛發(fā)，即在黑色毛發(fā)的毛尖下端的一段呈黃色，從而使小鼠整體上看來(lái)呈現(xiàn)棕黃色。然而，在喪失了 atrn基因變異的小鼠，Agouti 失去了產(chǎn)生黃色色素的功能，因此小鼠的毛發(fā)呈黑色，所以Atrn基因自然丟失的小鼠被稱為 Mahogany。我們用轉(zhuǎn)基因的方法，能在小鼠黑色素細(xì)胞特異性地表達(dá)atrn，能糾正 atrn, _/_小鼠的表型，這亦提示它是Mclr的一個(gè)低親和力的復(fù)合受體。利用生物化學(xué)的方法在體外去檢查atrn和Agouti蛋白之間的相互反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)Agouti蛋白的N-端能夠和 atrn相結(jié)合，而C-端則和Mclr有一定的親和力。這個(gè)研究結(jié)果從分子水平為Atrn在色素改變中的作用提供了解釋。從遺傳學(xué)角度來(lái)說(shuō)，在毛發(fā)色素信息調(diào)控系統(tǒng)中，Atrn位于 Agouti和MClR之間?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)顯示，在黑色素細(xì)胞，Atrn是Agouti蛋白的輔助受體。III. Atrn與能量平衡的調(diào)節(jié)位于下丘腦的一個(gè)調(diào)節(jié)中心的作用和色素轉(zhuǎn)換的調(diào)控非常相似，它們主要控制能量代謝的平衡。α -MSH作用于下丘腦神經(jīng)元的膜受體Mc4r (melanocortin-4receptor)，能夠降低能量的攝取。而Agrp (Agouti Related Protein)則能夠通過(guò)作用于神經(jīng)細(xì)胞膜受體Mc4r，增加能量的攝取。Mc4r喪失功能(Mc4r+)或Agrp的異位高表達(dá)都可以引起一種和Ay小鼠相似的肥胖綜合癥。因?yàn)樵隗w外Agouti能夠作為Mclr和Mc4r的拮抗劑，從而導(dǎo)致一種假設(shè)Ay小鼠的肥胖是由于Agouti蛋白在下丘腦的異位表達(dá)，模擬Agrp的作用所致。正常情況下，Agouti蛋白僅表達(dá)于皮膚，毛囊的真皮乳頭細(xì)胞分泌的Agouti蛋白是一種細(xì)胞旁的信息分子，能夠使黑色素細(xì)胞產(chǎn)生黃色素，并只影響毛發(fā)的顏色。但是，如果它們?cè)谀X組織的異常表達(dá)能夠模擬Agrp的作用，刺激能量調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)細(xì)胞的受體Mclr，則能引起肥胖。Atrn在飲食和能量平衡方面的作用來(lái)源于對(duì)Ay小鼠的研究。用atrn變異小鼠和 Ay小鼠交配，純合子Ay小鼠的atrn基因喪失功能后，它們的毛發(fā)由黃色變成棕黑色，而且也不再肥胖。因此，Atrn的丟失抑制了異位表達(dá)的Agouti在體重和色素方面的效果；但如果用atrn小鼠和Mclr或Mc4r變異的小鼠交配，則atrn基因喪失功能后并不影響Mclr和 Mc4r變異的小鼠在色素和肥胖方面的表型。所以從遺傳學(xué)的角度來(lái)說(shuō)，在色素和能量平衡的調(diào)節(jié)通路上，Atrn位于Agouti的下游，而在Mclr和Mc4r的上游。Agouti蛋白和AGRP 羧基端的氨基酸序列是基本相似的，Agouti蛋白的氨基端能夠和吸引素細(xì)胞外微區(qū)特異性地結(jié)合，而AGRP則不能與吸引素起反應(yīng)。與這些結(jié)果相一致，我們發(fā)現(xiàn)Atrn喪失功能可完全地抑制Agouti引起的肥胖，但是對(duì)AGRP所誘導(dǎo)的肥胖則沒有效果。IV. Atrn變異所致的動(dòng)物神經(jīng)變性在進(jìn)行的廣泛組織學(xué)研究中，出人意料地發(fā)現(xiàn)Atrn喪失功能突變的動(dòng)物具有進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)的海綿狀變性，其腦組織有廣泛的空泡變和神經(jīng)元的喪失，它們的組織學(xué)特征和朊蛋白有關(guān)的疾病非常相似。
在最初研究Atrn變異小鼠時(shí)，我們?cè)鴪?bào)道腦組織的灰質(zhì)和白質(zhì)有空泡樣變，尤以腦干、小腦髓質(zhì)和顆粒層、延腦、丘腦、海馬(CA2和CA!3)、尾狀核和蒼白球?yàn)槊黠@，軀體感覺的大腦皮質(zhì)和脊髓的灰質(zhì)更為嚴(yán)重。最近，我們發(fā)現(xiàn)空泡變開始出現(xiàn)于皮質(zhì)的深層，在疾病的較晚階段逐漸發(fā)展到白質(zhì)。Atrn變異小鼠的神經(jīng)變性伴隨著行為的異常年幼的小鼠有時(shí)出現(xiàn)輕微的震顫，較年老的小鼠活動(dòng)過(guò)度，某些種族的小鼠Atrn變異會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)肌肉衰弱及共濟(jì)失調(diào)。

發(fā)明內(nèi)容
心臟疾病是目前威脅人類健康的最主要的疾病之一，心臟病作為全球高致病率、 高死亡率的疾病，很大程度上是由不良的生活習(xí)慣造成的。食用脂肪過(guò)多、缺乏運(yùn)動(dòng)和吸煙會(huì)使動(dòng)脈血管中的有害膽固醇含量上升，這些膽固醇附著在血管壁上，會(huì)引起人體自然的免疫反應(yīng)，使血管壁發(fā)炎腫脹造成動(dòng)脈硬化，切斷流向心臟的動(dòng)脈血供應(yīng)，從而引發(fā)心臟病。為了更好的防治心臟病，我們必須有很好的動(dòng)物模型，目前所用的最多的動(dòng)物模型是手術(shù)結(jié)扎，部分梗阻冠狀動(dòng)脈的分支以造成心肌的局部缺血，這種模型的缺點(diǎn)顯而易見。為了更有效地提供心臟病研發(fā)、防治所需要的動(dòng)物模型，克服現(xiàn)有動(dòng)物模型的缺陷，本發(fā)明通過(guò)發(fā)明者的創(chuàng)造性研究，提供了一種不僅能夠大量、而且病變穩(wěn)定的基因敲除小鼠的心臟病的動(dòng)物模型。本發(fā)明的第一個(gè)方面，是Atrn基因自然丟失的小鼠作為生產(chǎn)小鼠心臟病模型的基礎(chǔ)，如果沒有atrn基因的變異，和對(duì)照組的小鼠相比較，僅僅atrn Ll基因的敲除沒有任何異常的表現(xiàn)型；在本發(fā)明的實(shí)施方案中，只有atrn和atrnLl兩個(gè)基因完全丟失，才能產(chǎn)生小鼠的心臟的異常，盡管atrn小鼠有許多其他的異常的表型，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的變性等。在本發(fā)明中，我們發(fā)現(xiàn)利用atrn和atrn Ll的雙基因丟失的小鼠作為心臟病的動(dòng)物模型，是建立在C3H/Fej種系小鼠的背景上。糾正實(shí)驗(yàn)中，表達(dá)atrn或atrn Ll都可以糾正小鼠心臟的病變。^X本發(fā)明所述術(shù)語(yǔ)“雙基因敲除小鼠”是指atrn和atrn Ll兩個(gè)基因都完全丟失的小鼠；“小鼠的心臟病模型”指這兩個(gè)基因丟失的小鼠的心臟發(fā)生的病變即早期的心肌細(xì)胞壞死、鈣沉積而導(dǎo)致的心肌鈣化、左心室和室間隔肥大，心力衰竭等心臟病變; "atrn-/-"是指小鼠完全失去的atrn基因；“atrn-/- ；atrn Ll-/- “指這兩種基因都完全丟失的小鼠。本發(fā)明所述術(shù)語(yǔ)“對(duì)照組”指正常的C3H/Fej種系的小鼠。小鼠心臟病變的建立具體實(shí)施方法1，建立小鼠的心臟病的模型必須要有l(wèi))atrn基因自然丟失的小鼠，從美國(guó)的Jackson lab訂購(gòu)；2) atrn Ll基因敲除的小鼠，我們用IRES-LacZ-Neo取代了 atrn Ll基因的外顯子2，從而敲除了小鼠的這個(gè)基因，建立了 atrn Ll缺失的小鼠系，敲除基因的質(zhì)粒如圖1所示；3)雜交這兩個(gè)系的小鼠，以得到這兩個(gè)基因都完全丟失的小鼠系，由于這種小鼠失去了生殖的能力，所以必須用雜合子atrn-/-;atrn Ll+/-來(lái)交配來(lái)維持種系。2，這種模型要建立在C3h/Fej小鼠的品系上。心臟病變的發(fā)牛及結(jié)構(gòu)說(shuō)明1，雜交atrn-/-;atrn Ll+/-所得到的子代(Fl)小鼠，它們的基因型有可能是 atrn-/" ；atrnLl，_/_(25% ), atrn-/" ；atrnLl+/"(50% )禾口 atrri_/_ ；atrnLl+/+ (25% )。 其中僅僅基因atrn-/- ；atrnLl, -/-(25% )的小鼠呈現(xiàn)心臟病變。2，在心臟的大體標(biāo)本，4周的小鼠呈現(xiàn)心臟病變，無(wú)一例外的左心室的左上后方可以看到一個(gè)病灶，呈白色小灶狀。然后逐漸地迅速向周圍延伸，在40天左右累及整個(gè)左心室和室間隔，和右心室(2個(gè)月)，從而導(dǎo)致心臟衰竭(圖2)。3，組織學(xué)，3周左右開始出現(xiàn)個(gè)別心肌細(xì)胞的壞死，炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)，鈣化及纖維化 (圖幻。電子顯微鏡下顯示心肌纖維之間大量的線粒體堆積，水腫和巨大線粒體(圖4)。


圖1 =AtrnLl基因敲除小鼠的質(zhì)粒，A 敲除atrnLl基因的質(zhì)粒；B Southern blot 顯示clone 3的atrn Ll被敲除；C :atrn Ll敲除小鼠被敲除的基因和蛋白序列。圖2:Atrn和Atrn L 1雙基因敲除小鼠的心臟，左心室左后靠心房的部分壞死，纖維化，呈現(xiàn)白色的版塊狀；左上心臟前面觀，右上背面觀(6x)，左下Gx)和右下(IOx) 心室的橫斷面。圖3 40天的Atrn和Atrn L 1雙基因敲除小鼠的心臟，左心室肌纖維壞死，纖維化，炎細(xì)胞侵潤(rùn)和鈣鹽沉積。上圖40x，左下圖ΙΟΟχ，右下圖，200x。圖4，Atrn和AtrnLl小鼠心肌病變的電鏡下改變左上圖未正常對(duì)照，其他顯示心
肌纖維變形，之間堆滿線粒體，右的線粒體腫脹，形成巨大線粒體。
權(quán)利要求
1.為了獲得Attractin(atrn)和Attractinlike 1 (atrn Li)基因雙敲除小鼠心臟病的模型，必須是經(jīng)過(guò)如下步驟第一步，購(gòu)買atrn-/-自然突變的小鼠，其基本特征是此小鼠的種系背景是C3h/fej， 2-3個(gè)月時(shí)開始在腦組織內(nèi)出現(xiàn)海綿狀變性；第二步，設(shè)計(jì)atrnLl基因敲除小鼠的質(zhì)粒，其分子結(jié)構(gòu)具有附圖IA所示的特征；第三步，轉(zhuǎn)染atrnLl質(zhì)粒進(jìn)入小鼠的胚胎干細(xì)胞(ES) 內(nèi)，并篩選正常的atrn Ll基因被敲除的ES細(xì)胞。第四步，用這種ES細(xì)胞生產(chǎn)atrn Ll基因敲除的小鼠，傳代獲得atrn Ll-/-的純合子小鼠。第五步，雜交atrn和atrn Ll基因敲除的小鼠，獲得雙基因敲除的小鼠，即心臟病模型小鼠。
2.如權(quán)利要求1所述，atrn自然突變小鼠，用于心臟病動(dòng)物心臟病的模型制作。
3.如權(quán)利要求1所述，atrnLl基因敲除小鼠的質(zhì)粒，其分子結(jié)構(gòu)具有附圖IA所示的特征。
4.如權(quán)利要求1所述，轉(zhuǎn)染atrnLl質(zhì)粒進(jìn)入小鼠的胚胎干細(xì)胞(ES)內(nèi)，并篩選正卻的 atrn Ll基因被敲除的ES細(xì)胞，其DNA雜交結(jié)構(gòu)如附圖1B，第3株ES細(xì)胞所示。
5.如權(quán)利要求1所述，用這種ES細(xì)胞生產(chǎn)atrnLl基因敲除的小鼠，傳代獲得atrn Ll-/-的純合子小鼠。
6.如權(quán)利要求1所述，雜交atrn和atrnLl基因敲除的小鼠，獲得雙基因敲除的小鼠， 即心臟病模型小鼠。
7.權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的任何步驟和產(chǎn)物，在制備各種動(dòng)物心臟病模型的作用和用途。
全文摘要
Attractin和Attractin like 1基因雙敲除小鼠心臟病模型本發(fā)明在世界上首次建立了Attractin like 1(atrnL1)基因敲除小鼠，把這種小鼠和Attractin(atrn)自然突變的小鼠雜交，其后代中雙基因敲除，即基因?yàn)閍trn-/-；atrnL1-/-的小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)海綿狀空泡變性和atrn-/-；atrn-/-小鼠一樣，沒有明顯加重的變化，但這種小鼠的心臟出現(xiàn)了嚴(yán)重的病變。本發(fā)明為我們研究人的心臟病的發(fā)病機(jī)理、治療方法和抗心臟病藥物篩選提供了一個(gè)非常有價(jià)值的動(dòng)物模型。本發(fā)明還涉及所述的基因在心臟病變發(fā)生中的作用。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102399817SQ20101027926
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日
發(fā)明者沈士亮, 沈贊 申請(qǐng)人:上海眾申生物科技有限公司