專利名稱：發(fā)酵法生產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽酵母菌種及其生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵領(lǐng)域，特別涉及酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的菌種及工藝。
背景技術(shù)：
天然的蝦青素存在于藻類和以藻類為食的魚蝦的組織中，其生理作用是抗氧化和 保護(hù)色的作用。研究表明蝦青素的抗氧化能力是維生素E的500倍是胡蘿卜素的11倍以 上，具有明顯的抗氧化、消除活性的單線態(tài)氧的作用?？梢詮V泛應(yīng)用于人類保健等方面。人工合成蝦青素比較困難，且大多數(shù)為順式結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)也不能轉(zhuǎn)化成天然的反 式構(gòu)型。紅法夫酵母(Phaffia rhodozyma)可合成蝦青素，紅法夫酵母野生株系中蝦青素 積累量達(dá)細(xì)胞干重的0. 05%左右，某些突變株系中最多可達(dá)0.3%，并且所合成的類胡蘿
卜素中蝦青素是主要成分，因而是目前微生物發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素普遍采用的菌株。彭峰2008年碩士論文題目為紅發(fā)夫酵母發(fā)酵蝦青素的研究，該文對紅發(fā)夫酵母 生長特性和發(fā)酵培養(yǎng)提取測定工藝進(jìn)行了研究，同時(shí)也開展了耐高溫菌種的誘變選育，確 定了發(fā)酵培養(yǎng)條件，但誘變菌的蝦青素產(chǎn)量很小。谷胱甘肽是發(fā)現(xiàn)最早、功能最強(qiáng)和研究最深入的天然小分子肽之一。谷胱甘肽是 存在于生物體內(nèi)的重要肽類物質(zhì)，有著重要的生理活性，通常是從動(dòng)物肝臟和酵母中提取 得到。由于特殊的酵母菌種在培養(yǎng)過程中會(huì)積累一定濃度的谷胱甘肽，所以酵母細(xì)胞就成 了提取谷胱甘肽的主要來源?，F(xiàn)有技術(shù)中沒有揭示聯(lián)產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的高產(chǎn)菌株，尚無文章報(bào)道利用同一 酵母菌種同時(shí)高效生產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的工藝；以及有效的從酵母中提取蝦青素和谷胱 甘肽的工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種生產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的紅發(fā)夫酵母菌種；提 供一種紅發(fā)夫酵母生產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的生產(chǎn)工藝。本發(fā)明提供一種高產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的紅發(fā)夫酵母(Phaffia rhodozyma)菌 種，該酵母菌株已經(jīng)于2010年4月29日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理委員會(huì)普 通微生物中心，地址位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，(郵編100101)，保藏編號為 CGMCC No 3788。本發(fā)明的另一目的是提供一種利用上述高產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的紅發(fā)夫酵母生 產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的方法，該方法包括上述高產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的紅發(fā)夫酵母在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得酵 母細(xì)胞；從上述酵母細(xì)胞中分離提取蝦青素和谷胱甘肽。本發(fā)明發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的方案中，發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源為葡萄糖，葡萄 糖的濃度為25-40g/L ；
本發(fā)明發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的實(shí)施方案中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源為葡 萄糖，氮源主要為玉米漿及少量無機(jī)氮源，如0. 2-3. 5g/L的玉米漿以及無機(jī)氮源，無機(jī)氮 源可選擇0. 03-lg/L的硫酸銨和尿素；以及其他營養(yǎng)鹽，如0. 1-0. 3g/L的KH2PO4,, 0-0. 2g/ L 的 MgSO4 · 7H20。本發(fā)明發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的實(shí)施方案中，發(fā)酵培養(yǎng)條件如下攪拌轉(zhuǎn)速 120-180rpm，溫度15_26°C，溶氧0. 5%以上；發(fā)酵時(shí)間56-102小時(shí)。本發(fā)明發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的實(shí)施方案中，發(fā)酵過程中流加葡萄糖和氮 源，發(fā)酵液中葡萄糖濃度控制在1.5% (質(zhì)量體積比)及以下，流加氮源為玉米漿及少量 無機(jī)氮源，呼吸商在0. 8-1. 5，發(fā)酵培養(yǎng)16小時(shí)后1次或多次降低發(fā)酵液中葡萄糖濃度到 0.02-0. 5g/L。本發(fā)明從酵母細(xì)胞中分離提取蝦青素和谷胱甘肽的工藝如下將發(fā)酵獲得酵母發(fā)酵液離心洗滌后獲得酵母細(xì)胞，熱水浸提獲得谷胱甘肽浸出 液；谷胱甘肽浸出液經(jīng)膜過濾除去大分子物質(zhì)，減壓濃縮后進(jìn)行等點(diǎn)結(jié)晶或噴霧干燥制備 粉末制劑；酵母細(xì)胞經(jīng)干燥獲得酵母粉，酒精萃取酵母粉，濃縮萃取液獲得蝦青素；上述熱水浸提操作中熱水溫度為80-100°C，浸提2-4次，每次浸提5_10分鐘；上述膜的截流分子量在500_1000Da之間；上述酒精萃取工藝中，酵母粉與酒精的料液比為1 7-12;所述酒精為85-100% 的乙醇溶液。有益效果酵母在較低發(fā)酵溫度條件下積累的谷胱甘肽幾乎全部是活性的還原型谷胱甘肽 (GSH)，這也發(fā)揮了蝦青素發(fā)酵過程最為人詬病的低溫條件的優(yōu)勢，用增加的有益副產(chǎn)物來 彌補(bǔ)降溫能耗的花費(fèi)。本發(fā)明采用誘變選育的新菌種和科學(xué)工藝實(shí)現(xiàn)同一株菌種生產(chǎn)蝦青素和谷胱甘 肽的工藝思路，發(fā)明創(chuàng)造性的采用發(fā)酵穩(wěn)定期降低葡萄糖濃度的饑餓培養(yǎng)方法有效提高了 蝦青素的產(chǎn)量，一舉兩得地同時(shí)開發(fā)出脂溶性的抗氧化劑和水溶性的抗氧化劑。使得細(xì)胞 濃度達(dá)到了 20克/升以上，蝦青素含量為2500微克/克干細(xì)胞以上的成績，單位體積蝦 青素產(chǎn)量達(dá)到了 50毫克/升的國內(nèi)先進(jìn)的生產(chǎn)水平。酵母的谷胱甘肽的含量也達(dá)到了 10000 μ g/g以上的水平，具有良好的綜合利用價(jià)值。完成了主要利用葡萄糖和玉米漿實(shí)現(xiàn)蝦青素和谷胱甘肽這兩種重要的活性抗氧 化劑物質(zhì)的10噸發(fā)酵規(guī)模的技術(shù)驗(yàn)證，發(fā)酵水平達(dá)到了國內(nèi)先進(jìn)水平，而多產(chǎn)品發(fā)酵和提 取技術(shù)具備進(jìn)行工業(yè)化實(shí)施的價(jià)值和條件。提出并實(shí)現(xiàn)了利用中性醇溶液進(jìn)行高效蝦青素萃取的工藝路線，避免了酸化破壁 對產(chǎn)品質(zhì)量和用途造成的不良影響；試驗(yàn)表明，本發(fā)明的提取工藝使蝦青素的提取率可以 達(dá)到85%以上，谷胱甘肽的提取率達(dá)到90%以上。成功實(shí)現(xiàn)高收率的蝦青素和谷胱甘肽有效成分的提取，提高了生產(chǎn)的效益和產(chǎn)品 的附加值。
具體實(shí)施例方式下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明中高產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽紅 發(fā)夫酵母菌株的獲得以及其發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的方法。除非特別說明，本發(fā)明中 所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員 而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對這些實(shí)施方案中的培養(yǎng)劑組分、含量、培養(yǎng) 條件、分離提取條件進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。定向誘變技術(shù)選育高產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的紅發(fā)夫酵母采用來自日本微生物菌種保藏中心的紅發(fā)夫酵母菌種JCM-9680菌株定向誘變產(chǎn) 生高產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的菌株，本發(fā)明中定向誘變指將一定濃度的酵母細(xì)胞懸浮液用化 學(xué)和物理誘變劑反復(fù)處理，包括采用100-200微克/毫升亞硝基胍在20-25°C處理20-40分 鐘，并用Co60輻射源進(jìn)行輻照，總的輻照劑量為lOOGy。將輻照后的菌液稀釋后涂布于含有0. 1 %的亞硫酸氫鈉的YMPD平板上，于22°C培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)后，挑取菌落顏色鮮艷且菌落較大者進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。通過檢測蝦青素和 谷胱甘肽含量，確定高產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的紅發(fā)夫酵母菌株。篩選得到的酵母菌顯微形態(tài)是典型的酵母形態(tài)，呈圓形或卵圓形。生長方式為單 邊簇生芽殖，在細(xì)胞中可以明顯的觀察到橙色的著色顆粒(液滴)，在固體培養(yǎng)基表面生長 成鮮艷的橙色菌落。將挑出的分離株經(jīng)過一次液體試管轉(zhuǎn)接后，轉(zhuǎn)接到40毫升的搖管中，于22°C下進(jìn) 行搖管發(fā)酵，培養(yǎng)24-36小時(shí)后，離心分離酵母菌體進(jìn)行蝦青素和谷胱甘肽產(chǎn)量的測定。選擇出的酵母菌種發(fā)酵生產(chǎn)的蝦青素含量和蝦青素產(chǎn)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于原始出發(fā)菌株。 蝦青素產(chǎn)量達(dá)到了 2500μ g/g以上，谷胱甘肽的含量也達(dá)到了 ΙΟΟΟΟμ g/g的水平。酵母菌株已經(jīng)于2010年4月29日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號， (郵編100101)，中國普通微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No3788。紅發(fā)夫酵母菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化將紅發(fā)夫酵母菌株在三角瓶搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下研究培養(yǎng)基成分和條件；葡萄 糖，蔗糖，麥芽糖為碳源，碳源濃度在25-40g/L，葡萄糖為優(yōu)選碳源，濃度為25-40g/L ；氮源 包括玉米漿和少量無機(jī)氮源，無機(jī)鹽包括鎂、鉀的磷酸鹽和硫酸鹽，微量元素如錳、銅、鋅； 以及維生素等。研究確定培養(yǎng)基組分及濃度，獲得菌株發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)基。高產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的紅發(fā)夫酵母規(guī)模性發(fā)酵生產(chǎn)工藝如下，從斜面到搖瓶到 種子罐到5噸或10噸發(fā)酵罐。發(fā)酵過程采用常規(guī)的自動(dòng)化控制發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，自動(dòng) 控制系統(tǒng)對溶氧水平，溫度、罐壓、攪拌速度進(jìn)行控制，實(shí)現(xiàn)菌體濃度和目的產(chǎn)物的有效積 累ο培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員通常根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和基本知識(shí) 確定，本發(fā)明中優(yōu)選的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件如下YMPD 1 % Yeast Extract (酵母膏)，2 % Peptone (蛋白胨)，2 % Dextrose glucose (葡萄糖)，1 %的麥芽糖，若制固體培養(yǎng)基，加入2%瓊脂粉。斜面培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖10 ；酵母膏3 ；蛋白胨10 ；瓊脂20 ；麥芽汁3 ；PH 5. 0。搖瓶培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖30，酵母氮基10，KH2PO4O.25，MgSO4 · 7H20 0. 1。搖瓶培養(yǎng)條件250ml三角瓶裝量為25ml，22°C 220r/min培養(yǎng)48小時(shí)。發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖30 ；酵母氮基10 ；KH2PO4 0. 25 ；MgSO4 · 7H20 0. 1。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖30；玉米漿3 ；硫酸銨0. 3 ；KH2PO4 0. 25 ；MgSO4 ·7Η20 0. 1。10噸發(fā)酵罐培養(yǎng)條件裝液量60%，接種量為10%，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm，溫度 18-230C。罐壓0. 3mpa,溶解氧30%，發(fā)酵過程中流加葡萄糖和氮源，發(fā)酵液葡萄糖濃度控 制在1. 5%及以下，流加氮源為玉米漿及少量無機(jī)氮源。進(jìn)入發(fā)酵生長的穩(wěn)定期后1次或多 次降低發(fā)酵液中葡萄糖濃度到0. 02-0. 5g/L。細(xì)胞濃度達(dá)到20克/升以上，蝦青素含量為2500微克/克干細(xì)胞，單位體積蝦青 素產(chǎn)量達(dá)到了 50毫克/升，酵母的谷胱甘肽的含量達(dá)到10000 μ g/g以上。本發(fā)明從酵母細(xì)胞中分離提取蝦青素和谷胱甘肽的工藝如下將發(fā)酵獲得酵母發(fā)酵液離心洗滌后獲得酵母細(xì)胞，熱水浸提獲得谷胱甘肽浸出 液；谷胱甘肽浸出液經(jīng)膜除去大分子物質(zhì)，減壓濃縮后進(jìn)行等點(diǎn)結(jié)晶或噴霧干燥制備粉末 制劑；酵母細(xì)胞經(jīng)干燥獲得酵母粉，酒精萃取酵母粉，濃縮萃取液獲得蝦青素；上述熱水浸提操作中熱水溫度為95°C，浸提3次，每次浸提10分鐘；上述酒精萃取工藝中，酵母粉與酒精的料液比為1 10;所述酒精為85%的乙醇 溶液。本發(fā)明中蝦青素的測定方法如下1. IOml發(fā)酵液3000r/min離心15min洗滌兩次，去掉上清液。2.用2. 5ml的二甲基亞砜破壁，攪拌然后用3000r/min離心15min兩次至沉淀物
無色，上清液用丙酮萃取。3.加蒸餾水洗滌丙酮萃取液至澄清透明，定容至25ml，測定波長在474nm時(shí)的吸光度。細(xì)胞總蝦青素質(zhì)量濃度(yg/ml) = (A*Va)/(E*Vf)式中A-光密度Va-萃取液體積，mlE-消光系數(shù)，為0.21Vf-取樣發(fā)酵液體積，ml本發(fā)明中谷胱甘肽的含量測定方法如下A、半定量方法B、HPLC定量測定方法色譜柱島津Vp-ODS 4. 6 X 250mm ；流動(dòng)相磷酸二氫鈉和庚烷磺酸鈉混合溶液(磷酸二氫鈉3. Og,庚烷磺酸鈉1. Og, 加水溶解并定容至500ml)乙腈=96 4 (ν ν)，用磷酸調(diào)節(jié)ρΗ為3. 0。檢測器島津SPD-M20A型DAD檢測器。流速:lml/min；柱溫:45°C ；進(jìn)樣量:20μ L·實(shí)施例1將出發(fā)菌株JCM-9680紅發(fā)夫酵母的平板分離單菌落培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到含葡萄糖5% 的YMPD液體培養(yǎng)基中，于22°C下培養(yǎng)18 24小時(shí)。取旺盛生長的培養(yǎng)物5毫升，于4000rpm下離心15分鐘，傾倒掉上清液，用生理鹽水洗滌沉淀細(xì)胞2 3次后，用50mM的 PH7. 0的磷酸緩沖溶液懸浮酵母沉淀，稀釋至約IO7細(xì)胞/毫升，備用。向裝有上液的試管中加入亞硝基胍丙酮溶液，使最終濃度達(dá)到200微克/毫升，混 合均勻后在22°C下保溫30分鐘，離心，除去上清液，用相同的磷酸緩沖溶液洗滌2 3次， 洗滌后的細(xì)胞懸液適當(dāng)稀釋后涂布于YMPD平板上，于22°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)后，挑取 菌落顏色鮮艷者進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。試驗(yàn)采用的液體培養(yǎng)基的組成為(g/L)葡萄糖30 ；酵母 膏3 ；蛋白胨10 ；麥芽汁3 ；PH 5.0。在22°C下，250rpm的轉(zhuǎn)速下?lián)u瓶48小時(shí)，分析變異 株同出發(fā)株的產(chǎn)物產(chǎn)量為 實(shí)施例2將用50mM的pH7. 0的磷酸緩沖溶液制備的含M_3菌種濃度為IO7細(xì)胞/毫升的 懸液分裝在15毫升的無菌聚丙烯離心管中，在輻照室中接受Co60輻射源的輻照，總的輻照 劑量為lOOGy。將輻照后的菌液稀釋后涂布于含有0. 的亞硫酸氫鈉的YMPD平板上，于 22°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)后，挑取菌落顏色鮮艷且菌落較大者進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。試驗(yàn)采用 的液體培養(yǎng)基的組成為(g/L)葡萄糖30 ；酵母膏3 ；蛋白胨10 ；麥芽汁3 ；PH 5. 0。在 22°C下，250rpm的轉(zhuǎn)速下?lián)u瓶48小時(shí)，分析變異株同出發(fā)株的產(chǎn)物產(chǎn)量為 將變異株M-3-86進(jìn)行多次傳代試驗(yàn)，遺傳性狀穩(wěn)定的單菌落純培養(yǎng)物提交中國 普通微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC No 3788。實(shí)施例3在10升發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基為6升，培養(yǎng)基的組成和比例(g/L)葡萄糖30 ；玉米漿 3 ；硫酸銨0. 3 ；KH2PO4 0. 25 ；MgSO4 · 7H20 0. 1。攪拌轉(zhuǎn)速 150rpm，溫度 22°C?？刂迫芙庋?大于5%，發(fā)酵時(shí)間為56小時(shí)。細(xì)胞濃度達(dá)到4. 5克/升，蝦青素含量為2040 μ g/g干細(xì) 胞，酵母的谷胱甘肽的含量達(dá)到8500 μ g/g干細(xì)胞。酵母為CGMCC No 3788。實(shí)施例4在10升發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基為6升，培養(yǎng)基的組成和比例(g/L)葡萄糖30;玉米 漿3 ；硫酸銨0. 3 ；KH2PO4 0. 25 ；MgSO4 · 7H20 0. 1。攪拌轉(zhuǎn)速 150rpm，溫度 22°C。溶解氧 大于0. 5%，發(fā)酵過程中流加濃度為30%葡萄糖的和氮源，發(fā)酵液葡萄糖濃度控制在0. 5 1. 5%，流加氮源為0. 5%玉米漿及0. 2%無機(jī)氮源。酵母為CGMCC No 3788。
發(fā)酵時(shí)間96小時(shí)。細(xì)胞濃度達(dá)到20克/升以上，蝦青素含量為1980yg/g干細(xì) 胞，酵母的谷胱甘肽的含量達(dá)到12000 μ g/g干細(xì)胞。實(shí)施例5在10升發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基為6升，培養(yǎng)基的組成和比例(g/L)葡萄糖30 ；玉米漿 3 ；硫酸銨0. 3 ；KH2PO4 0. 25 ；MgSO4 · 7H20 0. 1。攪拌轉(zhuǎn)速 150rpm，溫度 22°C。溶解氧大于 0.5%，發(fā)酵過程中流加濃度為30%葡萄糖的和氮源，發(fā)酵液葡萄糖濃度控制在1.5%，流 加氮源為0. 5%玉米漿及0. 2%無機(jī)氮源。在發(fā)酵約50小時(shí)后，發(fā)酵液葡萄糖濃度可降到0. lg/L以下，此時(shí)開始流加，在8 小時(shí)內(nèi)使葡萄糖濃度提高到左右。其后通過流加速度調(diào)節(jié)重復(fù)控制葡萄糖濃度在低于 0. 的“饑餓”水平和左右的正常水平間擺動(dòng)，直到發(fā)酵時(shí)間96小時(shí)發(fā)酵終止。此時(shí)細(xì) 胞濃度達(dá)到20克/升以上，蝦青素含量為2500 μ g/g干細(xì)胞，單位體積蝦青素產(chǎn)量達(dá)到了 50毫克/升，酵母的谷胱甘肽的含量達(dá)到13000 μ g/g干細(xì)胞以上。酵母為CGMCC No 3788。實(shí)施例6在10噸發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基為6噸，培養(yǎng)基的組成和比例(g/L)葡萄糖30 ；玉米漿 3 ；硫酸銨0. 3 ；KH2PO4 0. 25 ；MgSO4 · 7H20 0. 1。攪拌轉(zhuǎn)速 150rpm，溫度 22°C。溶解氧大于 0. 5%，發(fā)酵過程中流加葡萄糖和氮源，發(fā)酵液葡萄糖濃度控制在1. 5%，流加氮源為0. 5% 玉米漿及0.2%無機(jī)氮源。發(fā)酵50小時(shí)時(shí)逐漸降低發(fā)酵液葡萄糖濃度到0. lg/L，之后恢復(fù)葡萄糖濃度到正 常水平。發(fā)酵時(shí)間96小時(shí)。細(xì)胞濃度達(dá)到20克/升以上，蝦青素含量為2500微克/克干 細(xì)胞，單位體積蝦青素產(chǎn)量達(dá)到了 50毫克/升，酵母的谷胱甘肽的含量達(dá)到IOOOOyg/ g以上。將發(fā)酵獲得酵母發(fā)酵液離心洗滌后獲得酵母細(xì)胞，熱水浸提獲得谷胱甘肽浸出 液；谷胱甘肽浸出液經(jīng)納濾膜(分子量為500Da)除去大分子物質(zhì)，減壓濃縮后進(jìn)行等點(diǎn)結(jié) 晶或噴霧干燥制備谷胱甘肽粉末制劑；酵母細(xì)胞經(jīng)干燥獲得酵母粉，酒精萃取酵母粉，蒸餾 濃縮萃取液獲得蝦青素；通過蝦青素和谷胱甘肽檢測方法確定產(chǎn)量。上述熱水浸提操作中熱水溫度為95°C，浸提3次，每次浸提10分鐘；上述酒精萃取工藝中，酵母粉與酒精的料液比為1 10;所述酒精為95%的乙醇 溶液。實(shí)施例7基本方法同例1在10噸發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基為6噸，培養(yǎng)基葡萄糖濃度為4%，發(fā)酵過程中流加葡萄 糖和氮源，發(fā)酵液葡萄糖濃度控制在1.4%，流加氮源為玉米漿及少量無機(jī)氮源。發(fā)酵溫度 21 °C。進(jìn)入發(fā)酵生長43和59小時(shí)時(shí)階段性降低發(fā)酵液葡萄糖濃度到0. 5g/L。發(fā)酵時(shí)間98小時(shí)。細(xì)胞濃度達(dá)到20克/升以上，蝦青素含量為2550微克/克干 細(xì)胞，單位體積蝦青素產(chǎn)量達(dá)到了 50毫克/升，酵母的谷胱甘肽的含量達(dá)到IOOOOyg/ g以上。
權(quán)利要求
一種生產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的紅發(fā)夫酵母(Phaffia rhodozyma)，其保藏編號為CGMCCNo 3788。
2.一種如權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的紅發(fā)夫酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素 和谷胱甘肽的方法，包括如下步驟如權(quán)利要求1所述紅發(fā)夫酵母在含葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng) 基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得酵母細(xì)胞；從上述酵母細(xì)胞中分離提取蝦青素和谷胱甘肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的紅發(fā)夫酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的方法，其特征在 于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為25-40g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述紅發(fā)夫酵母菌生產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的的方法，其特征在 于所述發(fā)酵培養(yǎng)基還含有0. 2-3. 5% g/L玉米漿。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的紅發(fā)夫酵母菌生產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的方法，其特征在 于所述發(fā)酵培養(yǎng)條件如下攪拌轉(zhuǎn)速120-180rpm，溫度15_26°C，溶氧大于0. 5%。
6.根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的紅發(fā)夫酵母菌生產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的方法，其特征在 于所述發(fā)酵培養(yǎng)16小時(shí)后至少1次降低發(fā)酵液中葡萄糖濃度到0. 02-0. 5g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的紅發(fā)夫酵母菌生產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的方法，其特征在于所 述發(fā)酵過程中進(jìn)入發(fā)酵生長的穩(wěn)定期時(shí)1次或多次降低發(fā)酵液中葡萄糖濃度到0. 1,0. 02、 或 0. 5g/Lo
8.如權(quán)利要求1所述生產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的紅發(fā)夫酵母菌在蝦青素和谷胱甘肽生 產(chǎn)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了發(fā)酵法生產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽酵母菌種及其生產(chǎn)工藝，本項(xiàng)目通過綜合的生物育種技術(shù)改造野生菌株，獲得高產(chǎn)蝦青素的紅法夫酵母菌種，并利用遺傳和工程控制手段強(qiáng)化了菌種副產(chǎn)物谷胱甘肽的生產(chǎn)特性。本發(fā)明發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)蝦青素和谷胱甘肽的發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源為葡萄糖，葡萄糖的濃度為25-40g/L；發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源主要為玉米漿及少量無機(jī)氮源。通過發(fā)酵過程的優(yōu)化和最佳提取技術(shù)的嵌合，實(shí)現(xiàn)兩種產(chǎn)品的流暢的生產(chǎn)，綜合生產(chǎn)效益比生產(chǎn)單獨(dú)品種有很大程度的提高，克服了蝦青素生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性方面的制約。本發(fā)明對提高產(chǎn)品的附加值和減少環(huán)境污染都有著重要的示范意義。
文檔編號C12R1/645GK101921712SQ201010268908
公開日2010年12月22日 申請日期2010年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月1日
發(fā)明者裴疆森, 黃玲 申請人:中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院