專利名稱：調(diào)控胚胎干細(xì)胞及早期胚胎的胚層分化的方法和試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及調(diào)控胚胎干細(xì)胞分化及早期胚胎的胚層分化的方法和試劑。
背景技術(shù)：
胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem Cells,ES)是由著床前囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner Cell Mass, I CM)的細(xì)胞在體外分離培養(yǎng)所建成的全能性細(xì)胞系。它具有自我更新和發(fā)育多能性的特點(diǎn)。一方面通過對稱分裂而快速增殖，產(chǎn)生未分化的子代群體；另一方面，能夠分化為包括體內(nèi)三胚層細(xì)胞以及生殖細(xì)胞在內(nèi)的多種類型的細(xì)胞。這兩大特性使ES細(xì)胞具有極其重要的基礎(chǔ)研究價值和巨大的臨床應(yīng)用前景，可應(yīng)用于早期胚胎發(fā)育過程的研究， 藥物毒物篩選，細(xì)胞移植治療，基因治療等領(lǐng)域。目前的研究表明，外源性LIF-STAT3和 BMP-SMAD通路對于ES細(xì)胞維持自我更新具有至關(guān)重要的作用。在沒有其他因子存在的無血清培養(yǎng)基中，僅僅添力口 LIF(leukemia inhibitor factor)禾口 BMP4(bone morphogenetic protein 4)兩種因子便可成功的在體外培養(yǎng)ES細(xì)胞。在這種條件下生長的ES細(xì)胞具有典型的ES細(xì)胞的所有特性。在ES細(xì)胞的多能性維持方面，除了外源性信號性分子起關(guān)鍵作用外，以轉(zhuǎn)錄因子0ct4，Sox2, Nanog為核心的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對于ES細(xì)胞維持自我更新也具有至關(guān)重要的作用。這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)僅存在于早期胚胎發(fā)育過程中的多能細(xì)胞中，如ICM、Epiblast等。隨著胚胎的進(jìn)一步發(fā)育，這些多能細(xì)胞逐漸分化成成熟的組織細(xì)胞類型而喪失了多能性，而此時這些多能性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)也就隨之消失。然而調(diào)控ES細(xì)胞胚層分化的分子機(jī)制目前研究不是很清楚，研究僅表明激活ERK-1/2通路可以觸發(fā)ES細(xì)胞進(jìn)行胚層分化，而抑制這條通路可以不依賴LIF部分維持ES細(xì)胞自我更新。但除了 ERK-1/2通路以外，是否有其他信號通路參與調(diào)控ES細(xì)胞胚層分化目前并不清楚。自我更新和分化多能性是胚胎干細(xì)胞的重要特性。但是，ES細(xì)胞從維持自我更新到胚層分化轉(zhuǎn)變的分子調(diào)控機(jī)制目前研究并不清楚。綜上，本領(lǐng)域非常有必要研究其它相關(guān)的信號通路，以對ES細(xì)胞的發(fā)育和分化作出更深的了解。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供調(diào)控胚胎干細(xì)胞及早期胚胎的胚層分化的方法和試劑。在本發(fā)明的第一方面，提供鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcinuerin)-SK T細(xì)胞核因子 (NFAT)信號通路的調(diào)節(jié)劑的用途，用于制備調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞(EQ分化和胚胎(特別是早期胚胎)發(fā)育的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)節(jié)劑是抑制劑，其用于制備抑制胚胎干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑選自(但不限于)環(huán)孢素A(CyCl0Sp0rine A, CsA) ；FK506 ；VIVIT ；GM6001 ；PP2 ；特異性干擾鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶基因表達(dá)的干擾分子(如siRNA)；特異性結(jié)合鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的抗體或配體。在另一優(yōu)選例中，所述的干擾分子是SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2所示序列的分子。在另一優(yōu)選例中，所述的抑制胚胎干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育包括抑制胚胎干細(xì)胞進(jìn)行胚層分化；維持胚胎干細(xì)胞自我更新。在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)節(jié)劑是促進(jìn)劑，其用于制備促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的促進(jìn)劑是一表達(dá)載體，其中含有鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶編碼基因或活化τ細(xì)胞核因子編碼基因；或者，所述的促進(jìn)劑是促進(jìn)Ca2+信號通路的物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育包括促進(jìn)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行胚層分化。在另一優(yōu)選例中，所述的早期胚胎是指發(fā)育0-4. 5天的胚胎。在另一優(yōu)選例中，所述的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶包括亞基CnA(包括Ppp3Ca、Ppp3cb、 Ppp3cc)、CnB (包括 Ppp3rl，Ppp3r2)；或所述的活化T 細(xì)胞核因子包括 AFAI^cl、NFAjTcZ、NFATc3, NFATc40在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于與Erkl/2信號通路共同作用，激活下游靶基因Src或促進(jìn)上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換(EMT)。、在另一優(yōu)選例中，所述的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-活化T細(xì)胞核因子信號通路與Erkl/2 信號通路共同作用激活下游靶基因Src或促進(jìn)上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換。在本發(fā)明的另一方面，提供一種篩選(體外篩選)調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育的潛在物質(zhì)的方法，所述的方法包括(1)將候選物質(zhì)與含有鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-活化T細(xì)胞核因子信號通路的體系接觸；(2)檢測候選物質(zhì)對鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-活化T細(xì)胞核因子信號通路的影響；若所述候選物質(zhì)提高鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和/或活化T細(xì)胞核因子的表達(dá)或活性，則表明該候選物質(zhì)是促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育的潛在物質(zhì)；若所述候選物質(zhì)抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和/或活化T細(xì)胞核因子的表達(dá)或活性，則表明該候選物質(zhì)是抑制胚胎干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)包括在測試組中，將候選物質(zhì)加入到含有鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-活化T細(xì)胞核因子信號通路的體系中；和/或步驟( 包括檢測測試組的體系中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和/或活化T細(xì)胞核因子的表達(dá)或活性，并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質(zhì)的含有鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-活化T細(xì)胞核因子信號通路的體系；如果測試組中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和/或活化T細(xì)胞核因子的表達(dá)或活性在統(tǒng)計學(xué)上高于(優(yōu)選顯著高于，如高20%以上，較佳的高50%以上；更佳的高80%以上)對照組，就表明該候選物質(zhì)是促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育的潛在物質(zhì)；如果測試組中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和/或活化T細(xì)胞核因子的表達(dá)或活性在統(tǒng)計學(xué)上低于(優(yōu)選顯著低于，如低20%以上，較佳的低50%以上；更佳的低80%以上)對照組，就表明該候選物質(zhì)是抑制胚胎干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育的潛在物質(zhì)。
在另一優(yōu)選例中，所述的體系中不包含Erkl/2信號通路，或者參與Erkl/2信號通路的相關(guān)蛋白不表達(dá)，或者參與Erkl/2信號通路的相關(guān)基因被沉默(注此處為了排除候選物質(zhì)可能作用于Erkl/2信號通路的情況，該情況沒有新穎性)。在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中，所述的體系中還包含Src表達(dá)盒，步驟( 包括檢測候選物質(zhì)對Src表達(dá)的影響；若所述候選物質(zhì)促進(jìn)Src表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育的潛在物質(zhì)；若所述候選物質(zhì)抑制Src表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是抑制胚胎干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的體系選自細(xì)胞體系、亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、 器官體系或動物體系。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖1、Calcinuerin-NFAT信號通路對于小鼠胚胎干細(xì)胞的多胚層分化是必需的。(a)圖示為CGR8細(xì)胞在文中所示培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3. 5天的細(xì)胞形態(tài)。(b)定量RT-PCR檢測(a)中所描述的細(xì)胞中基因的表達(dá)水平。胚胎干細(xì)胞在加有白血病抑制因子(LIF)的培養(yǎng)條件下的mRNA水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差 (n = 3)。*指示ρ < 0. 05，**指示ρ < 0. 01 (應(yīng)用非配對t檢驗)。(c)激光共聚焦圖片顯示在圖中所示培養(yǎng)條件下細(xì)胞的Nanog染色結(jié)果。標(biāo)尺 50 μ m0(d)使用磷酸化Mat3和Mat3的特異性抗體檢測在LIF撤除和CsA (15 μ Μ)處理時Mat3的活化狀況。D1、D3分別表示LIF撤除后第1、3天。(e)圖示為 CGR8 細(xì)胞在有 / 無 LIF，control-oligo (對照 oligo，獲自 Invitrogen ；Stealth RNAi siRNA Negative Control Hi GC (Cat.No. 12935400)； Stealth RNAi siRNA Negative Control Med GC(Cat. No. 12935300) ；Stealth RNAi siRNA Negative Control LO GC(Cat. No. 12935200))和 Ppp3rl_oligo(Ppp3rl_oligol 序列為 UUGUGUAUCUUUCAGAUU⑶UGCCC(SEQ ID NO :1) ；Ppp3rl_oligo2 序列為 UAAAGGGUUCUGCUGUAACUCAGGC (SEQ ID NO :2))條件下的細(xì)胞形態(tài)。(f)定量RT-PCR檢測(e)中所描述的細(xì)胞中基因的表達(dá)水平。胚胎干細(xì)胞在加有 LIF和control-oligo處理條件下的mRNA水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(η =3)。統(tǒng)計處理同上。(g) RT-PCR檢測來源于CsA處理的ES細(xì)胞的類胚體(EB，embryo id body)的標(biāo)記基因表達(dá)情況。Gapdh為RT-PCR的內(nèi)參。DO、D4、D9分別表示處理后0、4、9天。(h)免疫熒光檢測EB貼壁后細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)。使用抗體Soxl7(內(nèi)胚層)， Nestin (外胚層)和Flkl (內(nèi)胚層)免疫熒光染色。(i)在含有15微摩CsA培養(yǎng)液中培養(yǎng)的ESC，注入小鼠體內(nèi)獲取畸胎瘤。H&E染色檢測畸胎瘤內(nèi)的組織形態(tài)。
(j)來源于CsA處理的含有histone 2B-GFP融合蛋白的ES細(xì)胞的18. 5天的嵌合胚。以18. 5天未嵌合小鼠為對照。圖2、Calcinuerin-NFAT信號通路在ES細(xì)胞分化過程中被激活。(a)定量RT-PCR檢測ES細(xì)胞在LIF撤除條件下calcinuerin各個調(diào)節(jié)亞基 (Ppp3ca、Ppp3cb、Ppp3cc、Ppp3rl、Ppp3rf)的mRNA水平。胚胎干細(xì)胞在加有白血病抑制因子(LIF)的培養(yǎng)條件下的mRNA水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n =幻。統(tǒng)計處理同上。D2、D4分別表示LIF撤除后第2、4天。(b) RA誘導(dǎo)不同天數(shù)(D0-D6)的NFATc 1_4的表達(dá)水平。(C)ES細(xì)胞在LIF撤除后的NFATcl_4的蛋白表達(dá)水平。Tubulin作為內(nèi)參。(d)免疫熒光檢測NFATc3在含有LIF和撤除LIF 3. 5天的ES細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。DAPI標(biāo)示細(xì)胞核。(e)NFAT :AP_1報告基因在撤除LIF條件下的ES細(xì)胞中的活化。報告基因在加LIF 培養(yǎng)的ES中的活性水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n =幻。統(tǒng)計處理同上。圖3、CalCinuerin-NFAT信號通路的激活可以促進(jìn)ES細(xì)胞從自我更新狀態(tài)進(jìn)入分化狀態(tài)。(a)圖示為ES細(xì)胞中過表達(dá)激活形式的Calcinuerin(ACnA), NFATc 1-4 (CA-NFATc 1-4)改變的細(xì)胞形態(tài)。CGR8細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后篩選3天。(b-c)定量RT-PCR檢測(a)中所描述的細(xì)胞中基因的表達(dá)水平。胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)染了對照載體(Vector，空質(zhì)粒)的mRNA水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n = 3)。(d)圖示為來源于對照細(xì)胞和CA_NFATc3過表達(dá)細(xì)胞的畸胎瘤的形態(tài)。(e) RT-PCR檢測對照畸胎瘤和來源于CA_NFATc3過表達(dá)細(xì)胞的出血瘤的基因表達(dá)情況。圖4、NFAT直接地結(jié)合在Src啟動子區(qū)域，激活其表達(dá)水平。(a)定量 RT-PCR 檢測在 iNFATc3ES 細(xì)胞中通過移除 iTc (0. 5 μ M)誘導(dǎo) CA_NFATc3 過表達(dá)的Src表達(dá)模式。對照細(xì)胞中的mRNA水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差 (η = 3)。統(tǒng)計處理同上。(b-c)定量RT-PCR檢測在瞬時過表達(dá)持續(xù)激活形式的calcineriun，NFATcl-4(b) 的細(xì)胞中，或者在iRasES細(xì)胞中通過加入dox(0. 2μΜ)誘導(dǎo)Hras 1Q61L (HRas) (c)過表達(dá)3 天時Src的mRNA水平。對照細(xì)胞中的mRNA水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差 (η = 3)。統(tǒng)計處理同上。(d)定量RT-PCR檢測在圖示條件下培養(yǎng)3. 5天的細(xì)胞中Src的mRNA水平。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n =幻。統(tǒng)計處理同上。(e)圖示為使用Src或IL_2探針和過表達(dá)CA_NFATc32天的E14T核裂解液所做的 EMSA檢測。(f)使用含有野生型Src啟動子的報告基因以及不含或含有NFAT或AP-I位點(diǎn)突變(NFATm或AP-Im)的報告基因做熒光素酶檢測。與空載(Vector)共轉(zhuǎn)的野生型Src啟動子報告基因活性設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n =幻。統(tǒng)計處理同上。(g)染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示NFATc3在撤除LIF誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化或者Tc誘導(dǎo)的CA-NFATc3過表達(dá)的ES細(xì)胞中結(jié)合到Src上游區(qū)域。圖5、Src對于Calcinuerin-NFAT引起的ES細(xì)胞分化是必需的。(a)圖示為持續(xù)激活形式的Src過表達(dá)引起的ES細(xì)胞形態(tài)改變。CGR8細(xì)胞在過表達(dá)后篩選3天。Vector為空質(zhì)粒對照。(b)定量RT-PCR檢測過表達(dá)Src引起的細(xì)胞如(a)所示的標(biāo)記基因改變。細(xì)胞轉(zhuǎn)染了空白載體的基因水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n = 3)。(c) Src抑制劑ΡΡ2能夠抑制NFATc3引起的ES細(xì)胞分化。圖示為iNFATc3ES細(xì)胞在所示條件下培養(yǎng)3天的細(xì)胞形態(tài)。CA-NFATc3的表達(dá)水平是由在iNFATc3細(xì)胞中撤除Tc 引起的。對照為加iTc,不加抑制劑PP2培養(yǎng)的iNFATc3細(xì)胞。(d)定量RT-PCR檢測在(c)圖中細(xì)胞的基因表達(dá)水平。對照細(xì)胞中未添加PP2的 mRNA水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n =幻。統(tǒng)計處理同上。(e)通過Src特異性的oligo (兩段不同序列的oligo)降低Src的水平能夠阻斷由NFATc3引起的細(xì)胞分化。定量RT-PCR檢測在含有或不含Src-oligo處理的細(xì)胞中的標(biāo)記基因表達(dá)水平。通過在iNFATc3ES細(xì)胞中撤除Tc (0. 5 μ M)誘導(dǎo)CA_NFATc3的表達(dá)。轉(zhuǎn)有control-oligo的mRNA水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n =幻。統(tǒng)計處理同上。對照組(Control)為加Tc培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染對照oligo序列的iNFATc3ES細(xì)胞。(f)PP2能夠消除ES由LIF撤除所引起的分化。CGR8在圖示條件下培養(yǎng)三天的細(xì)胞形態(tài)。(g)定量RT-PCR檢測在(f)圖中細(xì)胞的基因表達(dá)水平。對照細(xì)胞中加入LIF培養(yǎng)的ES細(xì)胞的mRNA水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n = 3)。統(tǒng)計處理同上。圖6、NFAT-Src介導(dǎo)的EMT對于胚層分化是必需的過程。(a)定量RT-PCR檢測過表達(dá)Src F的CGR8細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)水平。 轉(zhuǎn)染了對照載體(空質(zhì)粒，vector)的細(xì)胞中的基因水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n = 3)。(b)細(xì)胞中過表達(dá)Src F引起細(xì)胞中E-cadherin的重分布，從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞漿中。iSrcES細(xì)胞通過撤除Tc培養(yǎng)三天后檢測E-cadherin的表達(dá)。對照為加Tc培養(yǎng)的 iSrcES 細(xì)胞。(c)通過不同天數(shù)誘導(dǎo)ES細(xì)胞中NFATc3的表達(dá)來監(jiān)測標(biāo)記基因的表達(dá)的時序性。 定量RT-PCR檢測標(biāo)記基因的表達(dá)，對照細(xì)胞中的基因表達(dá)水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n = 3)。統(tǒng)計處理同上。(d)MMP廣譜的抑制劑GM6001能夠抑制NFATc3引起的ES細(xì)胞的分化。iNFATc3ES 在圖中所示條件下培養(yǎng)3天的細(xì)胞形態(tài)圖。標(biāo)尺100微米。(e)定量RT-PCR檢測在(d)圖中細(xì)胞的基因表達(dá)水平。對照細(xì)胞中的基因表達(dá)水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n =幻。統(tǒng)計處理同上。(f-g) Calcinuerin的抑制劑CsA (f)和Src的抑制劑PP2能夠消除LIF撤除所引起的EMT.定量RT-PCR檢測EMT相關(guān)基因的表達(dá)。加LIF培養(yǎng)條件下ES細(xì)胞的mRNA水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n =幻。統(tǒng)計處理同上。圖7、Calcinuerin-NFAT信號通路對于早期小鼠胚胎的胚層分化是必需的。(a)應(yīng)用NFATc3和0ct4的抗體對小鼠胚胎進(jìn)行免疫熒光染色。NFATc3在滋養(yǎng)層(E 3.5)和原始內(nèi)胚層(E 4.0)出現(xiàn)時定位從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)入細(xì)胞核。0ct4陽性的細(xì)胞位于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中。(b)PP2對于滋養(yǎng)層發(fā)育的作用。胚胎從8細(xì)胞期開始在不含/含有PP2的條件下培養(yǎng)兩天，用0ct4 (綠色)和Cdx2 (紅色)的抗體免疫熒光染色。(c)柱狀圖顯示在(b)所示條件下的胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)和滋養(yǎng)層(TE)的細(xì)胞數(shù)目。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n =幻。統(tǒng)計處理同上。(d)參與ES細(xì)胞分化的信號通路的模型。Lineage commitment指胚層分化。圖8、LIF刺激對Mat3的動態(tài)激活。CGR8細(xì)胞在撤除LIF培養(yǎng)12小時。使用磷酸化Mat3和Mat3的抗體檢測LIF 刺激和CsA處理后Mat3的動態(tài)激活。圖^Calcinuerin-NFAT信號通路的其他抑制劑可以保持ES細(xì)胞在撤除LIF的條件下的未分化狀態(tài)。(a) Calcinuerin抑制劑Π(506可以保持ES細(xì)胞在撤除LIF的條件下的未分化狀態(tài)。圖示為CGR8細(xì)胞在所示培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3. 5天的細(xì)胞形態(tài)。標(biāo)尺100微米。(b)定量RT-PCR檢測(a)中所描述的細(xì)胞中基因的表達(dá)水平。胚胎干細(xì)胞在加有白血病抑制因子(LIF)的培養(yǎng)條件下的mRNA水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差 (n = 3)。*指示ρ < 0. 05，**指示ρ < 0. 01 (應(yīng)用非配對t檢驗)。(c) Calcinuerin-NFAT通路的抑制劑VIVIT可以保持ES細(xì)胞在撤除LIF的條件下的未分化狀態(tài)。圖示為CGR8細(xì)胞在所示培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3天的細(xì)胞形態(tài)。標(biāo)尺100微米。(d)定量RT-PCR檢測(c)中所描述的細(xì)胞中基因的表達(dá)水平。胚胎干細(xì)胞在加有白血病抑制因子(LIF)的培養(yǎng)條件下的mRNA水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差 (η = 3)。統(tǒng)計處理同上。圖10、Calcinuerin抑制劑CsA可以保持ES細(xì)胞在維甲酸(RA)存在的條件下的未分化狀態(tài)。(aKalcinuerin抑制劑CsA可以保持ES細(xì)胞在撤除LIF的條件下的未分化狀態(tài)。 圖示為CGR8細(xì)胞在有/無RA(0. ΙμΜ)和CsA (15 μ Μ)存在條件下的細(xì)胞形態(tài)。標(biāo)尺100 微米。(b)定量RT-PCR檢測(a)中所描述的細(xì)胞中基因的表達(dá)水平。胚胎干細(xì)胞在無 RA處理的培養(yǎng)條件下的mRNA水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n = ；3)。統(tǒng)計處理同上。圖11、抑制Calcinuerin-NFAT信號通路可以保持ESC長期的自我更新和全能型。(a)圖示為在撤除LIF和添加CsA的培養(yǎng)條件下，40天后ES細(xì)胞仍保持典型的未分化形態(tài)。標(biāo)尺100微米。(b)圖示為來源于LIF培養(yǎng)和撤除LIF，添加CsA的培養(yǎng)ES細(xì)胞的EB形態(tài)。標(biāo)尺 100微米。圖12、HRas的過表達(dá)能夠促進(jìn)ESC的分化。定量RT-PCR檢測過表達(dá)HRas 3天的iRasES細(xì)胞中標(biāo)記基因的表達(dá)水平。通過在iRasES細(xì)胞中加入doxycycline(dox，0. 2μΜ)誘導(dǎo)HRas的表達(dá)。對照細(xì)胞中的基因表達(dá)水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n = 3)。圖13、基因芯片分析NFAT相關(guān)的基因。(a)受NFAT調(diào)控基因的聚類分析?；蛟谌缦逻^程中存在變化撤除LIFl天和3 天在加入CsA處理條件下撤除LIFl天和3天；通過撤除Tc誘導(dǎo)Δ CnA的過表達(dá)1天和4 天。基因的表達(dá)水平用顏色來顯示，綠色(較低的表達(dá)水平)，紅色(較高的表達(dá)水平)。(b)用DAVID 2008分析富集出來的NFAT下游潛在靶基因可能參與的信號通路。圖14、降低Src的水平可以阻斷NFATc3引起的ES細(xì)胞的分化。(a)通過Src特異性的oligo降低Src的表達(dá)可以阻斷由CA_NFATc3過表達(dá)引起的 ES細(xì)胞的分化。圖示為iNFATc3ES細(xì)胞在所示培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)。在iNFATc3ES 細(xì)胞中撤除iTc (0. 5 μ Μ)誘導(dǎo)CA-NFATc3表達(dá)2天。對照組為加Tc培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染對照oligo 序列的iNFATc3ES細(xì)胞。(b)定量RT-PCR檢測(a)中所描述的細(xì)胞中全能性標(biāo)記基因的表達(dá)水平。對照細(xì)胞中的mRNA水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n =幻。統(tǒng)計處理同上。圖15、Src的抑制劑ΡΡ2可以抑制HRas引起的ES細(xì)胞分化。(a) ΡΡ2可以保持過表達(dá)HRas細(xì)胞的未分化狀態(tài)。圖示為iRasES細(xì)胞在所示培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)。(b)定量RT-PCR檢測(a)中所描述的細(xì)胞中基因的表達(dá)水平。對照細(xì)胞(非過表達(dá)HRas)中的mRNA水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n =幻。統(tǒng)計處理同上。圖16、EMT能夠誘導(dǎo)ES細(xì)胞發(fā)生分化。(a)過表達(dá)CA-NFAiTc 1-4的CGR8中EMT相關(guān)基因上升。定量RT-PCR檢測mRNA水平，細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了空載(Vector)的mRNA設(shè)定為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n = 3)。(b)過表達(dá)HRas所引起的EMT相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)水平。在iRasES細(xì)胞中加入 dox (0. 2 μ Μ)誘導(dǎo)Hras 1Q61L (HRas)的表達(dá)3天。對照細(xì)胞(非過表達(dá)HRas)中mRNA設(shè)定為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n = 3)。(c)誘導(dǎo)CA-NFAI~C3的過表達(dá)引起的ES細(xì)胞分化時E-cadherin的重新分布。 E-cadherin的免疫熒光染色為紅色。藍(lán)色的DAPI標(biāo)示核。(d)撤除LIF引起的ES細(xì)胞分化E-cadherin的重新分布。E-cadherin的免疫熒光染色如(c)所示。圖17、EMT對于撤除LIF引起的ES細(xì)胞分化是必需的。(a)MMP廣譜的抑制劑GM6001能夠部分的阻斷ES細(xì)胞由撤除LIF引起的細(xì)胞分化。CGR8細(xì)胞在所示條件下培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)。(b)定量RT-PCR檢測過表達(dá)Src引起的細(xì)胞如(b)所示的標(biāo)記基因改變。對照細(xì)胞的基因水平設(shè)為1。數(shù)據(jù)的表述為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(n =幻。統(tǒng)計處理同上。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究，首次揭示激活Calcinuerin-NFAT信號通路與胚胎干細(xì)胞(EQ的分化或自我更新密切相關(guān)，激活該通路可以促發(fā)ES細(xì)胞進(jìn)行胚層分化，而抑制這條信號通路可以長期維持ES細(xì)胞自我更新。在ES細(xì)胞中，Calcinuerin-NFAT信號通路參與激活下游靶基因Src，促進(jìn)上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換(印ithelial-mesenchymal transition, EMT)。而EMT潛在地是ES細(xì)胞早期胚層分化必經(jīng)的過程。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)， Calcinuerin-NFAT信號通路在胚胎早期胚層分化過程中也被激活，并且抑制它可以影響胚胎的正常發(fā)育。如本文所用，所述的“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......構(gòu)
成”、“基本上由......構(gòu)成”、和“由......構(gòu)成”；“主要由......構(gòu)成”、“基本上
由......構(gòu)成”和“由......構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。Calcinuerin-NFAT 信號通路鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(Calcinuerin)屬絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶家族成員(又稱蛋白磷酸酶2b，pp2b)，是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一受Ca2+/鈣調(diào)素(cam)調(diào)節(jié)的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶。Calcinuerin廣泛分布于包括心臟在內(nèi)的全身組織中，是一種廣泛分布的、參與多種細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的多功能信號酶，在細(xì)胞因子介導(dǎo)的T細(xì)胞活化中起到調(diào)節(jié)樞紐的作用；在神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、突觸可塑性方面亦具有重要的調(diào)節(jié)作用；特別是新近研究表明， Calcinuerin介導(dǎo)的信號通路Calcinuerin-NFAT在心肌肥大的發(fā)生發(fā)展中可能起到中心作用。Calcinuerin包括包括兩個亞基CnA (催化亞基)、CnB (調(diào)節(jié)亞基)；其中亞基CnA 包括Ppp3ca (氨基酸序列參GenBank登錄號NP_032939. 1)、Ppp3cb (氨基酸序列參GenBank 登錄號NP_032940. 1)、Ppp3cc三種(氨基酸序列參GenBank登錄號NP_032941. 1)；亞基 CnB包括Ppp3rl (氨基酸序列參GenBank登錄號NP_077779. 2),Ppp3r2兩種(氨基酸序列參GenBank登錄號NP_001004025. 1)。Ppp3rl可以使下游基因NFAT去磷酸化、被激活進(jìn)入細(xì)胞核?；罨疶細(xì)胞核因子(NFAT)是一種Ca2+調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄因子，位于靜息細(xì)胞的胞漿內(nèi)。 NFAT在免疫反應(yīng)中對誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄起重要作用。除T細(xì)胞外，這類蛋白質(zhì)還可以在許多免疫細(xì)胞上進(jìn)行表達(dá)。其活性受到Calcinuerin的調(diào)節(jié)。所述的活化T細(xì)胞核因子包括NFAT cl (氨基酸序列參GenBank登錄號NP_001157581. 1) ,NFAT c2 (氨基酸序列參GenBank登錄號 ΝΡ_001032254· 1)、NFAT c3 (氨基酸序列參 GenBank 登錄號 ΝΡ_0!35031· 2)、NFAT c4 (氨基酸序列參GenBank登錄號NP_001161818. 1)。由于NFAT的DNA結(jié)合能力比較弱，它通常和其他轉(zhuǎn)錄因子共同激活靶基因，其中最重要的共同因子是AP-I (R)s/Jun，Erkl/2的底物)。在體內(nèi)，胞漿的Ca2+濃度上升到一定水平激活Calcinuerin，繼而活化 Calcinuerin-NFAT信號通路。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的報導(dǎo)，所述的Calcinuerin-NFAT信號通路參與多種體內(nèi)機(jī)制且與多種疾病相關(guān)，例如其參與調(diào)節(jié)苯腎上腺素誘導(dǎo)的VSMCs增生肥大， 其在心肌肥大中的作用。然而，其是否與胚胎干細(xì)胞或胚胎發(fā)育相關(guān)還沒有在先揭示。為了尋找調(diào)控ES細(xì)胞胚層分化的未知通路，本發(fā)明人應(yīng)用了 PB轉(zhuǎn)座子這一突變篩選工具。發(fā)現(xiàn)當(dāng)PB轉(zhuǎn)座子突變ES細(xì)胞內(nèi)源基因Ppp3rl后，在撤去LIF誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化條件下，ES細(xì)胞不能進(jìn)行正常的胚層分化，而能維持自我更新狀態(tài)。這提示基因Ppp3rl 在調(diào)控ES細(xì)胞胚層分化方面有重要作用。在發(fā)明中，利用Calcinuerin-NFAT信號通路抑制劑和RNA干涉(RNA interference, RNAi)等方法表明，Calcinuerin-NFAT信號通路的激活對促發(fā)ES細(xì)胞和早期胚胎進(jìn)行而胚層分化是充分而且必需的，機(jī)制上，它和Erkl/2通路共同激活下游靶基因Src，進(jìn)一步促進(jìn)上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymaltransition, EMT)。而EMT潛在地是ES細(xì)胞早期胚層分化必經(jīng)的過程。Calcinuerin-NFAT信號通路的調(diào)節(jié)劑及其用途如本文所用，所述的Calcinuerin-NFAT信號通路的調(diào)節(jié)劑包括任何可調(diào)節(jié) Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白(包括Calcinuerin或其亞基或類似物，NFAT蛋白或其亞基或類似物)的活性或表達(dá)的試劑。例如，所述的Calcinuerin-NFAT信號通路的調(diào)節(jié)劑包括了 調(diào)節(jié)Calcinuerin (或其亞基)和/或NFAT (或其亞基)的調(diào)節(jié)劑。所述的調(diào)節(jié)劑包括了促進(jìn)劑和抑制劑。如本文所用，所述的Calcinuerin-NFAT信號通路的促進(jìn)劑包括了上調(diào)劑、激活劑、激動劑等。任何可提高Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白的活性、維持 Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白的穩(wěn)定性、促進(jìn)Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白的表達(dá)、 延長Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白有效作用時間、或促進(jìn)Calcinuerin-NFAT信號通路基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為可用于促進(jìn)Calcinuerin-NFAT信號通路的激活的有效物質(zhì)。如本文所用，所述的Calcinuerin-NFAT信號通路的抑制劑包括了下調(diào)劑、阻滯劑、阻斷劑、拮抗劑等。任何可降低Cal c inuer in-NFAT信號通路蛋白的活性、降低 Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白的穩(wěn)定性、抑制Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白的表達(dá)、 減少Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白有效作用時間、或抑制Calcinuerin-NFAT信號通路基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為可用于抑制Calcinuerin-NFAT信號通路的激活的有效物質(zhì)。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的Calcinuerin-NFAT信號通路的促進(jìn)劑例如是一表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含一基因盒，所述的基因盒含有編碼Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白的編碼基因及與之操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。所述表達(dá)載體在轉(zhuǎn)入細(xì)胞后表達(dá) (或過表達(dá))Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白。作為本發(fā)明的另一優(yōu)選方式，所述的Calcinuerin-NFAT信號通路的促進(jìn)劑為該通路的上游效應(yīng)物質(zhì)，例如，所述的促進(jìn)劑是Ca2+或在體內(nèi)可形成Ca2+的物質(zhì)。當(dāng)Ca2+濃度上升到一定水平后，可激活Calcinuerin，繼而活化Calcinuerin-NFAT信號通路。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的Calcinuerin-NFAT信號通路的抑制劑是(但不限于)特異性抗Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白的抗體，所述的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，只要其對于Calcinuerin-NFAT信號通路中任一種蛋白具有特異性結(jié)合能力， 且能夠通過與Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白的結(jié)合而抑制Calcinuerin-NFAT信號通路的激活；或特異性抑制Calcinuerin-NFAT信號通路中任一種蛋白的編碼基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的干擾分子或反義核苷酸。針對已知蛋白或已知基因的干擾分子或反義核苷酸的制備方法是本領(lǐng)域人員熟知的。本發(fā)明還提供了 Cal c inuer in-NFAT信號通路蛋白的促進(jìn)劑的用途。所述的 Calcinuerin-NFAT信號通路的促進(jìn)劑用于制備調(diào)節(jié)Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白的組合物。例如，所述的Calcinuerin-NFAT信號通路的促進(jìn)劑通過促進(jìn)Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白的表達(dá)或活性，促進(jìn)Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白的激活，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)ES 細(xì)胞或胚胎(特別是早期胚胎)的發(fā)育、分化。本發(fā)明還提供了 Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白的抑制劑的用途。所述的Calcinuerin-NFAT信號通路的抑制劑用于制備抑制Calcinuerin-NFAT信號通路的激活的組合物。例如，所述的Calcinuerin-NFAT信號通路的抑制劑通過抑制Calcinuerin-NFAT 信號通路蛋白的表達(dá)或活性，抑制Calcinuerin-NFAT信號通路的激活，進(jìn)而抑制胚胎干細(xì)胞進(jìn)行胚層分化；維持胚胎干細(xì)胞自我更新。篩選調(diào)節(jié)Calcinuerin-NFAT信號通路的潛在物質(zhì)在得知了所述的Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白對于調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞或胚胎發(fā)育的用途后，可以基于該特征來篩選通過調(diào)節(jié)Calcinuerin-NFAT信號通路的活性或表達(dá)調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞或胚胎發(fā)育的物質(zhì)。因此，本發(fā)明提供一種篩選可用于調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞或胚胎發(fā)育的潛在物質(zhì)的方法，所述的方法包括將候選物質(zhì)與表達(dá)Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白的體系接觸；和檢測候選物質(zhì)對Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白的影響；若所述候選物質(zhì)可提高Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白的表達(dá)或活性，則表明該候選物質(zhì)是可用于促進(jìn) Calcinuerin-NFAT信號通路的潛在物質(zhì)；若所述候選物質(zhì)可降低Calcinuerin-NFAT信號通路的表達(dá)或活性，則表明該候選物質(zhì)是可用于抑制Calcinuerin-NFAT信號通路的潛在物質(zhì)。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在進(jìn)行篩選時，為了更易于觀察到Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白的表達(dá)或活性的改變，還可設(shè)置對照組，所述的對照組可以是不添加所述候選物質(zhì)的表達(dá)Calcinuerin-NFAT信號通路的體系。較佳地，為了排除其它相關(guān)信號通路對于藥物篩選的潛在干擾，所述的體系中不包含Erkl/2信號通路，或者參與Erkl/2信號通路的相關(guān)蛋白不表達(dá)，或者參與Erkl/2信號通路的相關(guān)基因被沉默。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法還包括對獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì)胞試驗或動物試驗，以進(jìn)一步選擇和確定對于調(diào)節(jié)Calcinuerin-NFAT信號通路有用的物質(zhì)。本發(fā)明所述的體系包括但不限于細(xì)胞(包括原核細(xì)胞，真核細(xì)胞)或細(xì)胞培養(yǎng)物體系、亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系。另一方面，本發(fā)明還提供了采用所述篩選方法獲得的可用于調(diào)節(jié) Calcinuerin-NFAT信號通路的潛在物質(zhì)。這些初步篩選出的物質(zhì)可構(gòu)成一個篩選庫。組合物本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有有效量(如0. 00000 l-50Wt% ；較佳的 0. 00001-20wt % ；更佳的，0. OOOl-IOwt % )的所述的 Calcinuerin-NFAT 信號通路蛋白，或其促進(jìn)劑或抑制劑，以及藥學(xué)上可接受的載體。所述的組合物可直接用于調(diào)節(jié) Calcinuerin-NFAT信號通路。此外，還可同時與其它治療劑或輔劑聯(lián)合使用。如本文所用，“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。本發(fā)明的組合物含有安全有效量的Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白或其促進(jìn)劑或抑制劑，以及藥學(xué)上可接受的載體。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配，本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量。本發(fā)明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。本發(fā)明所述的Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白或其促進(jìn)劑或抑制劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于所述的Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白或其促進(jìn)劑或抑制劑的藥代動力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當(dāng)本發(fā)明的Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白或其生物活性片段每天以約 0. 00001-50mg/kg動物體重(較佳的0. OOOl-lOmg/kg動物體重)的劑量給予，能得到令人滿意的效果。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于首次證明Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白是調(diào)控胚胎干細(xì)胞或胚胎發(fā)育的重要分子，能夠影響胚胎干細(xì)胞的分化和自我更新?？赏ㄟ^Calcinuerin-NFAT信號通路蛋白或其促進(jìn)劑或抑制劑來調(diào)控胚胎干細(xì)胞或胚胎發(fā)育。本發(fā)明人研究表明NFAT和Erkl/2信號通路形成控制ES細(xì)胞進(jìn)行胚層分化信號開關(guān)，對研究ES細(xì)胞從維持自我更新到胚層分化轉(zhuǎn)變的分子調(diào)控機(jī)制提供了途徑。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 2002)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。材料和方法哺乳動物細(xì)胞CGR8，E14T 小鼠胚胎干細(xì)胞系，獲自由劍橋大學(xué)。iRasES cells 小鼠胚胎干細(xì)胞系，獲自美國波士頓兒童醫(yī)院。i Δ CnAES, iNFATc3ES和iSrcES cell小鼠胚胎干細(xì)胞系根據(jù)發(fā)育生物學(xué)RIKEN中心提供的Rosa-Tet四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)建立，發(fā)育生物學(xué)RIKEN中心提供了 Rosa-Tet四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)相關(guān)質(zhì)粒和母細(xì)胞系。Rosa-Tet四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)構(gòu)建如下1、質(zhì)粒構(gòu)建分別從包含相應(yīng)基因片段的質(zhì)粒Δ CnA/pPyCAGIP (對應(yīng)i Δ CnAES細(xì)胞)， CA-NFAI^cS/pPyCAGIP (對應(yīng) iNFATc3ES)和 Src F/pPyCAGIP (對應(yīng) iSrcES)中獲得目的基因片段，然后通過》ιο I和Not I插入交換載體PPthC-0ct3/4(獲自發(fā)育生物學(xué)RIKEN中心)。2、Lipo2000 轉(zhuǎn)染
(I)Rosa-Tet四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)母細(xì)胞系在-Tc，+hygromycin B 150μ g/ml條件下培養(yǎng)2 3天后，以1 X IO6密度鋪入6孔板，+Tc 1 μ g/ml, -hygromycin B培養(yǎng)。(2)24h 后，5μ g 目的基因質(zhì)粒 pPthC+2y g pCAGGS-Cre+15y 1 Lipo2000 轉(zhuǎn)染。
(3) 24h 后，傳入 IOcm 皿。3、24h 后，力口入 1. 5μ g/ml Puromycin, +Tc 1 μ g/ml 蹄選。4、約一周后，空白對照組細(xì)胞完全死亡，從轉(zhuǎn)染組挑選約10個克隆。5、挑選克隆時，分出部分細(xì)胞進(jìn)入M孔板進(jìn)行檢驗。(1)分出的克隆在M孔板內(nèi)-Tc，+Puromycin培養(yǎng)。(2) 36h 后，力口 150 μ g/ml hygromycin B。(3) 2 4天后，如克隆細(xì)胞死亡，則為正確重組子。6、將步驟5鑒定出的正確重組子進(jìn)行連續(xù)擴(kuò)增培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為1.5yg/ mlPuromycin,1 μ g/ml Tc。7、篩選擴(kuò)增的克隆細(xì)胞在-Tc，+Puromycin 1. 5 μ g/ml條件下誘導(dǎo)3 4天，即可 Western檢測(可提高Puromycin量至7. 5 μ g/ml以提高誘導(dǎo)表達(dá)量)。質(zhì)粒PB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)獲自復(fù)旦大學(xué)。pPyCAGIP載體真核細(xì)胞表達(dá)載體，獲自劍橋大學(xué)。NFAT =AP-I 熒光素酶報告基因，pBJ5_CnA，pENTRll CA NFATl，pENTRll CANFAT2 獲自哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院。pRL-TK :Promega。Src-P(1. 9K)/pGL3-Enhancer，Src-P(1. 9K)AP-lm/pGL3-Enhancer 獲自 Nara Institute of Science and Technology。pMEmX-Δ (CRI_SP12)獲自東京大學(xué)。ρ⑶NA3_NFATc4獲自新加坡國立大學(xué)。pRc/CMV_SrcF5^獲自范德畢爾特大學(xué)醫(yī)學(xué)院。ACnA/pPyCAGIP 將質(zhì)粒pBJ5_CnA通過Bgl II和Β ο I酶切，獲取酶切片段亞克隆至pPyCAGIP載體的相應(yīng)位點(diǎn)中。CA-NFATcΙ/pPyCAGIP 由質(zhì)粒 pENTRllCA NFATl 通過 Xho I 和 EcoR I 酶切位點(diǎn)亞克隆至pPyCAGIP載體。CA-NFATc2/pPyCAGIP 由質(zhì)粒 pENTRllCA NFAT2 通過I 和 Xba I 酶切位點(diǎn)亞克隆至pPyCAGIP載體。CA-NFATc3/pPyCAGIP 由質(zhì)粒 pMEmX- Δ (CRI_SP12)通過 EcoR I 和 BanH I 酶切位點(diǎn)亞克隆至pPyCAGIP載體。CA-NFATc4/pPyCAGIP 由質(zhì)粒 pCDNA3_NFATc4 通過 Mlu I 和 EcoR I 酶切位點(diǎn)亞克隆至pPyCAGIP載體。Src F/pPyCAGIP 由質(zhì)粒 pRc/CMV_SrcF5^ 通過 EcoR I 和 Xho I 酶切位點(diǎn)亞克隆至pPyCAGIP載體。Src-P (1. 9K) NFATm/pGL3_Enhancer :以質(zhì)粒 Src-P (1. 9K) /pGL3_Enhancer 為模板，通過引物 src NFATm F :CACTATGCTGCCCACGTAT GGTCTCCTGGGAGACAT(SEQ ID NO 3)和src NFATm R :CATACGTGG GCAGCATAGTGAGTCAGACTGATCTGA (SEQ ID NO 4) PCR 突變 NFAT 蛋白結(jié)合位點(diǎn)。
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主要抗體
NFATcl 抗體ab2796，Abcam ；
NFATc2 抗體ab2722，Abcam ；
NFATc3 抗體:sc-8321, SantaCruz ；
NFATc4 抗體=#2183, Cell Signaling ；
Cdx2 iKW :MU392A-UC, BioGenex Laboratories ；
α -tubulin 抗體T5168, Sigma,
Flk 抗體:sc-6251, SantaCruz,
Soxl7 抗體AF1924，R&D,
Nestin 抗體:MAB353, Chemicon,
Stat3 抗體#4904, Cell Signaling,
Phospho-Stat3 抗體#9131, Cell Signaling ；
0ct4抗體為多克隆抗體，常規(guī)方法將0ct4蛋白免疫兔獲得。
辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗Jackson Immuno Research ；
免疫染色用焚光二抗:Jackson Immuno Research。
主要抑制劑
Calcinuerin 抑制劑 CsA :#C-900, Alomone ；
Calcinuerin 抑制劑 FK506 :ALX-380-008-M025, Alexis ；
NFAT 抑制劑 VIVIT :480401, Calbiochem ；
Src 抑制劑 PP2 :EI-297, BIOMOL ；
各種蛋白酶抑制劑及PMSF均為Sigma產(chǎn)品。
主要細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑
細(xì)胞培養(yǎng)基及各種添加成分=Gibco ；
月臺牛血清 FBS (fetal bovine serum) :Hyclone ；
白血病 Φ制因子 LIF(Leukemia inhibitory factor) :ESGR0，Chemicon 胰酶-EDTA Jnvitrogen ； 明膠 gelatin :Sigma ；
細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑 LipofectAMINE 2000 =Invitrogen ；
puromycin Amresco ；
G418 Promega ；
Tetracyclin(Tc) :Sigma ；
retinoid acid (RA) Sigma.
主要生化試劑、酶及試劑盒
各種限制性內(nèi)切酶=Takara ；
T4DNA 連接酶Takara ；
RNA 逆轉(zhuǎn)錄酶ReverTra Ace reverse transcriptase ； RNA 酶抑制劑 Rnase inhibitor =Toyobo ；
Taq DNA聚合酶及反應(yīng)緩沖液=NuoHua ；高保真 DNA 聚合酶 pfu :Promega ；SYBR Green PCR Mast Mix :ABI ；TRIzol Jnvitrogen ；質(zhì)粒大量抽提純化試劑盒=QIAGEN ；熒光封片劑DAK0 ；質(zhì)粒DNA分離純化試劑盒及DNA膠回收試劑盒博大泰克；蛋白定量試劑盒BCA Protein Assay Kit =Pierce ；ECL 反應(yīng) i式齊[J 盒:SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce ；電泳遷移率實(shí)驗(EMSA)試劑盒Pierce。感受態(tài)細(xì)菌的制備和質(zhì)粒DNA的制備感受態(tài)細(xì)菌的制備(氯化銣法)用接種環(huán)挑取少許凍存的菌種接種在固體LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)12 15小時。挑取單克隆，接種到30ml SOB液體培養(yǎng)基中，在搖床上37°C培養(yǎng)過夜(12 15小時)。 次日取菌液8ml接種到200ml SOB中，在搖床上37°C振蕩培養(yǎng)至OD59tl = 0. 3 0. 5。將菌液置于鹽冰浴中15分鐘，然后4°C離心，4000g，5分鐘。用6細(xì)1預(yù)冷的緩沖液I重懸細(xì)菌， 鹽冰浴15分鐘后，4°C離心，4000g，5分鐘。用16ml預(yù)冷的緩沖液II在冰上重懸細(xì)菌，然后立即分裝到預(yù)冷的Ep管中，每支lOOul，用液氮速凍后，存于-80°C備用。制備感受態(tài)細(xì)菌所用的溶液SOB(IL)蛋白胨20g，酵母抽提物5g，NaCl 0. 6g，KC10. 5g。高壓蒸汽滅菌后，加入過濾滅菌的MgCl2至終濃度10mM，MgSO2至終濃度10mM。緩沖液I (IL) =RbCl 12g, MnCl2 · 4H20 9. 9g, CaCl2 · 2H20 1. 5g,甘油 150g, KAc30mM。用0. 2M HAc調(diào)pH值至5. 8，濾器過濾除菌后儲存于4°C備用。緩沖液II(IL) :M0PS 20ml of 0. 5M stock (pH 6· 8)，RbCl 1. 2g，CaCl2 · 2Η20 llg，甘油150g。濾器過濾除菌后儲存于4°C備用。質(zhì)粒的大量制備按質(zhì)粒純化試劑盒OiIAGEN plasmid maxi kit)要求進(jìn)行，簡述如下取2.5ml已鑒定正確的菌液接種入250ml LB中，37°C，200_250rpm，振蕩培養(yǎng)16h。 收集菌液，7000rpm，4°C，離心，lOmin。棄上清，在細(xì)菌沉淀中加入IOml溶液Pl (含foiase A)，打勻沉淀。加入IOml溶液P2，輕緩倒置離心管4-5次，靜止％iin。加入預(yù)冷的溶液P3 輕緩倒置離心管4-5次。12000rpm, 4°C，離心，20min,取上清，并重復(fù)一次。將上清移至預(yù)先用10ml QBT緩沖液平衡過的柱子上。QC緩沖液洗柱，每次30ml，共2次。用15ml緩沖液QF 洗脫質(zhì)粒。加入10. 5ml異丙醇混勻后，15000g，4°C，離心30min，沉淀DNA。70% (ν/ν)乙醇洗滌，離心，去凈乙醇。干燥DNA，待其變透明，用適量無菌去離子水溶解。測定沈0歷/^80歷 OD值，鑒定質(zhì)粒濃度和純度。最后用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切質(zhì)粒，電泳鑒定結(jié)果。細(xì)胞基因組DNA的提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有PB轉(zhuǎn)座子的ES細(xì)胞撤除LIF培養(yǎng)而仍然不分化的克隆挑取出來，單克隆至M孔板，依次擴(kuò)增至12孔板和6孔板。用0. 25% (ν/ν)胰酶消化成單細(xì)胞，PBS洗CN 102382796 A
說明書
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一遍后，重懸細(xì)胞于100 μ 1 PBS或TE緩沖液中。用細(xì)胞基因組DNA小量提取試劑盒(博大泰克)抽提細(xì)胞基因組DNA。具體操作過程如下(1)在細(xì)胞懸液中加入試劑盒中的100 μ 1裂解液和10 μ 1蛋白酶K/RNase A ；(2)振蕩混勻；(3) 55 °C水浴鍋中裂解Ih ；(4)加入 10 μ 1 3Μ NaAc 和 1250 μ 1 結(jié)合緩沖液；(5)振蕩混勻(必須非常充分直至出現(xiàn)大量絮狀物)；(6) 15000g,離心 5min ；(7)取上清，分兩次過柱；(8)漂洗三次，每次用600 μ 1漂洗液；(9) 15000g，離心!3min，去除殘留乙醇；(10)加30-40 μ 1滅菌水或洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫。所得基因組DNA，取2μ1經(jīng)1 40稀釋后，用紫外分光光度計進(jìn)行定量，_20°C保存?zhèn)溆谩B轉(zhuǎn)座子突變ES細(xì)胞內(nèi)源基因Ppp3rl為了尋找調(diào)控ES細(xì)胞胚層分化的未知信號通路，本發(fā)明人應(yīng)用了 PB轉(zhuǎn)座子突變篩選系統(tǒng)。將PB轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶通過電轉(zhuǎn)整合入ES細(xì)胞，隨機(jī)突變內(nèi)源基因。由于LIF 對于維持小鼠ES細(xì)胞的自我更新具有重要的作用，將ES細(xì)胞撤除LIF培養(yǎng)，誘導(dǎo)其發(fā)生分化。本發(fā)明人推測如果PB轉(zhuǎn)座子突變了分化必須的基因?qū)?dǎo)致一些ES細(xì)胞不能分化而會生長形成克隆。將這些未分化的克隆挑選出來，通過iverse PCR鑒定出被突變的基因。反向PCR鑒定PB(PiggyBac)轉(zhuǎn)座子插入的基因由于PB轉(zhuǎn)座子屬于非復(fù)制轉(zhuǎn)座，它轉(zhuǎn)座時能攜帶一段基因組DNA，在PB轉(zhuǎn)基因載體上設(shè)計一對引物(RFl和RRl)，利用基因組DNA上普遍存在的Msp I或Hae III酶識別位點(diǎn)將基因組DNA切成很多片段，這些DNA片段經(jīng)過自連成環(huán)后，就能作為模板進(jìn)行反向PCR 鑒定出PB轉(zhuǎn)座子所插入的基因。此過程包括基因組DNA酶切、自連環(huán)化、反向PCR和測序鑒定4個主要步驟。(1)酶切Msp I 或 Hae III (Takara)，37°C，酶切過夜；(2)Msp I或Hae III酶切過夜的產(chǎn)物，各取5 μ 1進(jìn)行0. 7% (w/v)的瓊脂糖凝膠電泳以確定是否酶切完全。完全酶切的產(chǎn)物跑膠，其條帶總體呈彌散狀，其中可見一條或兩條明顯的條帶；(3)80°C,20min滅活限制性內(nèi)切酶；(4)酶切產(chǎn)物自連成環(huán)4°C，過夜。(5)力卩40 μ 1 3Μ NaAc和Iml無水乙醇至自連產(chǎn)物中，混勻，_20°C，過夜(沉淀 DNA)；(6) 4"C，18000g,離心 15min ；(7)去上清，用200 μ 1 70% (ν/ν)乙醇洗DNA沉淀；(8)去上清，空氣中干燥IOmin ；(9)用50無菌水溶解DNA樣品，55°C，lh，使其充分溶解；(該樣品可保存于-20°C 備用)
(10)以酶切后的基因組DNA為模板進(jìn)行反向PCR (11)1% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，切下大于484bp (經(jīng)Hae III酶切) 或588bp (經(jīng)Msp I酶切)的條帶，并根據(jù)博大泰克膠回收試劑盒說明書回收DNA片段，直接送公司測序或?qū)⑵錁?gòu)建至PGEM-T easy載體中(ftOmega)，再經(jīng)PCR鑒定，送測序；(12)PCR鑒定是以Ιμ 菌液為模板，用RFl和RRl引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系同步驟(10)的反向PCR，程序為55°C變性，72°C延伸45sec，35個循環(huán)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離；(13)利用NCBI網(wǎng)站將測序結(jié)果與小鼠基因組進(jìn)行比對，以確定PB在基因組上插入的具體位置。細(xì)胞培養(yǎng)CGR8、E14T ES 細(xì)胞系培養(yǎng)于 GMEM(Glasgow Minimum Essential Medium)中，含 10% (w/v)FBS，100U/ml青霉素，100μ g/ml鏈霉素，2mM L-谷氨酰胺，0. ImM非必需氨基酸， ImM丙酮酸鈉，1，000U/ml LIF和0. ImMβ -巰基乙醇(Sigma)。培養(yǎng)ES細(xì)胞的培養(yǎng)皿需用 0. 1% (w/v)lXPBS明膠溶液預(yù)先包被。i Δ CnAESdNFAI^^ES 和 iSrcES 細(xì)胞系培養(yǎng)于 GMEM (Glasgow Minimum Essential Medium)中，含 10% FBS, lOOU/ml 青霉素，100 μ g/ml 鏈霉素，2mM L-glutamine, 0. ImM 非必需氨基酸，ImM丙酮酸鈉，l，000U/ml LIF、0. ImMβ -巰基乙醇(Sigma)、0· 5 μ g/ml四環(huán)素 (Tc)。培養(yǎng)ES細(xì)胞的培養(yǎng)皿需用0. 1% IXPBS明膠溶液預(yù)先包被。撤除四環(huán)素(Tc)培養(yǎng)可以誘導(dǎo)激活的Calcinuerin、NFATc3和Src表達(dá)。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF原代細(xì)胞取自ICR小鼠13. 5天胚胎，傳代培養(yǎng)2-4代，經(jīng) Co60射線照射或絲裂霉素C處理，將細(xì)胞計數(shù)后凍存或鋪盤。MEF細(xì)胞均培養(yǎng)于含10% (w/ ν) FBS (fetal bovine serum, HyClone)、lOOU/ml 青霉素和 100 μ g/ml 鏈霉素(Invitrogen) 白勺 DMEM(Dulbecco’ s Modified Eagle' s Medium, Invitrogen)巾。
照一定密度鋪至明膠預(yù)處理的培養(yǎng)皿或孔板備用。iRasES 細(xì)胞系培養(yǎng)于 DMEM(high glucose, Hyclone)中，含 10% FBS(HyClone)， 100U/ml # M S,100 μ g/ml ^MM (Invitrogen),2mM L-glutamine(Invitrogen), 0. ImM 非必需氨基酸 anvitrogen)，1，OOOU/ml LIF (Chemicon)和 0. ImM β -巰基乙醇 (Invitrogen)，并置于鋪有MEF飼養(yǎng)層的培養(yǎng)皿中生長。細(xì)胞凍存與復(fù)蘇細(xì)胞凍存細(xì)胞消化后計數(shù)，離心收集后按適當(dāng)比例加入預(yù)冷的細(xì)胞凍存液，以每管1-1. 5ml加入細(xì)胞凍存管，細(xì)胞凍存管轉(zhuǎn)入凍存盒并置于-70°C冰箱過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮罐進(jìn)行長期凍存。凍存液配置將DMSO(按10%體積)加入相應(yīng)細(xì)胞的培養(yǎng)液中，并混勻靜置片刻。細(xì)胞復(fù)蘇從液氮中取出凍存管，迅速投入37°C水浴中化解，溶解90%時將管內(nèi)細(xì)胞移至含有培養(yǎng)液(37°C預(yù)熱)的離心管中，離心收集細(xì)胞，去除上清后，加入適量相應(yīng)培養(yǎng)液重懸后鋪板。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用ES細(xì)胞電轉(zhuǎn)方法或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(Lipof ectAMINE 2000轉(zhuǎn)染試劑盒， Invitrogen)。
RT-PCR 及實(shí)時定量 PCR (quantitative real-time PCR, qPCR)RT-PCR用TRIZOL (Invitrogen)抽提細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計定量后取4 μ g總RNA以 oligo (dT) 15為第一鏈引物，用ReverTra-Ace (Τ0Υ0Β0，Japan)逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。
反應(yīng)體系及過程如下oligo (dT) 15 2μ 1RNA 4 μ gDEPC H2O 補(bǔ)至 20 μ 170°C 5min (立即取出置冰上)5 X RT 緩沖液10 μ 1dNTP(IOmM) 3μ 1ReverTra-Ace 2 μ 1RNase 抑制劑1 μ 1DEPC H2O 14 μ 1總體積50 μ 142 °CIhPCR反應(yīng)在20 μ 1體系中進(jìn)行，含2 μ 1 cDNA模板，正反向引物各250nM， 200 μ MdNTP混合物，1單位Taq酶(華諾)。PCR程序為95 V首輪變性!Bmin ；95 V變性 30sec，在序列特異性的溫度下(一般通用60°C )復(fù)性30sec，72°C延伸30sec，適當(dāng)循環(huán)后， 72°C延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)含有溴化乙錠(ethidium bromide,EB)的2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，紫外凝膠成像分析儀(Syngene)分析并拍照。實(shí)時定量PCR制備反應(yīng)混合物(10 μ 1反應(yīng)體系按照一定比例稀釋過的cDNA模板2 μ 1，正反向引物3yl，2XSTOR Green I master mix 5 μ 1)，在實(shí)時定量PCR儀上擴(kuò)增40個循環(huán)數(shù)。 為了排除不同樣品上樣量的差異造成的影響，每個基因的Ct值都用看家基因GAPDH的Ct 值進(jìn)行校正° 數(shù)據(jù)用 Sequence Detection System 2. 0 software (ABI, Foster City, CA, USA)進(jìn)行分析。基因芯片(micro-array)收取如下樣品CRR8ES細(xì)胞撤除LIF培養(yǎng)0、1、3天；撤除LIF加抑制劑CsA培養(yǎng) 0、1、3天；i ACnAESES細(xì)胞系撤除四環(huán)素Tc)誘導(dǎo)表達(dá)Acan 0、1、4天。樣品裂解于Iml TRIZOL中，保存于-80°C。共收集兩批樣品用于基因芯片(聯(lián)合基因公司的Illumina芯片， Mouse-6V3)檢測分析。yk^J^^^Mli^ (Chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)小鼠ES細(xì)胞培液中加入37% (ν/ν)甲醛至終濃度(ν/ν)，室溫輕晃10分鐘促進(jìn)交聯(lián)反應(yīng)。加入甘氨酸至終濃度125mM，室溫處理5分鐘以終止交聯(lián)反應(yīng)。然后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解緩沖液(5mM PIPS pH 8. l,85mM KC1,0. 5% (w/v)NP-40，ImMPMSF)，置于冰上10分鐘。以5，OOOrpm離心4分鐘，得到細(xì)胞核沉淀，然后加入細(xì)胞核裂解緩沖液(50mM Tris-HCl pH 8. 1, IOmM EDTA, 1% (v/v) SDS, ImM PMSF)，置于冰上 10 分鐘(可取少量于顯微鏡下觀察裂解程度)。將核裂解液稀釋后用超聲儀超聲處理，使染色質(zhì)DNA打斷至平均長度為0. 5 21Λ，14，OOOXg離心20分鐘，取上清。將上清用稀釋緩沖液10倍稀釋，然后用 protein A s印harose (預(yù)先經(jīng)lmg/ml BSA和0. lmg/ml ssDNA處理過)預(yù)清除后，加入對照IgG或識別目的蛋白的特異性抗體，混勻后在4°C旋轉(zhuǎn)孵育過夜。次日，加入蛋白A瓊脂糖(經(jīng)lmg/ml BSA和0. lmg/ml ssDNA處理過)結(jié)合并沉淀反應(yīng)中的抗體_目的蛋白-染色質(zhì)復(fù)合物，然后依次用透析緩沖液OmM EDTA, 50mM Tris-Cl pH 8. 0,0. 2% Sarkosyl (w/ ν))洗滌兩次，免疫沉淀洗滌緩沖液(IOOmM Tris-HCl pH 7. 5,25mM EDTA, 1. 25% SDS)洗滌4次。最后，染色質(zhì)DNA用免疫沉淀洗脫緩沖液(50mM NaHCO3,1 % SDS)于65°C洗脫10 分鐘，加入RNase A和NaCl于67°C解交聯(lián)4 5小時，蛋白酶K于45°C消化2小時，乙醇沉淀獲得DNA，用于PCR分析。熒光素酶報告基因?qū)嶒?Luciferase Reporter Assay)CGR8ES細(xì)胞(1. 2 X IO5)培養(yǎng)于M孔板中。24小時后，利用脂質(zhì)體LipofectAMINE 2000 (Invitrogen)轉(zhuǎn)染報告基因質(zhì)粒QOOng)，并轉(zhuǎn)染pRL-TK (IOng) (Promega)作為內(nèi)參照。轉(zhuǎn)染48小時后，裂解細(xì)胞，按照雙熒光素酶活性分析試劑盒的操作說明檢查報告基因的活性(Promega)。將所得到的目的報告基因活性值除以內(nèi)參的數(shù)值以校正轉(zhuǎn)染效率，得到熒光素酶活性值。細(xì)胞總蛋白的制備與定量蛋白樣品的準(zhǔn)備收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗2次，根據(jù)細(xì)胞量加入適當(dāng)體積的裂解緩沖液 (50mMTris-Cl, pH 7. 5,150mM NaCl，2mM EDTA, 10% (ν/ν)甘油，0· 5% Nonidet Ρ-40, ImM NaF, ImM phenylmethylsulfonyl fluoride)裂解，12，000rpm，4°C離心 10 分鐘，吸取上清
液，進(jìn)行總蛋白定量。細(xì)胞總蛋白定量利用BCA(bicinchoninic acid)法蛋白濃度定量試劑盒(BCA，Protein Assay Kit)對細(xì)胞總蛋白進(jìn)行定量。反應(yīng)原理為堿性條件下，蛋白可將Cu2+還原為Cu+，Cu+與 BCA試劑與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物，測定樣品在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，即可計算出待測蛋白的濃度，并且不受樣品中離子型和非離子型去污劑影響。在酶標(biāo)板中加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白(如BSA 0μ g,4y g,8y g,12y g,16y g,20y g)及待測樣品。每孔加入 BCA反應(yīng)液(Reagent A與Reagent B按50 1比例混合)200 μ 1，混勻樣品與反應(yīng)液，將酶標(biāo)板置于56°C孵育15分鐘；冰上冷卻，利用酶標(biāo)儀測562nm光吸收值，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并讀出待測樣品的濃度。免疫印跡分析(Western blotting)BCA定量后，每個樣品取一定的總蛋白量并補(bǔ)加裂解緩沖液至相同體積，加4X 上樣緩沖液 QOOmM Tris-Cl, pH7. 4,8% SDS,20% (ν/ν) β-巰基乙醇、40% (ν/ν)甘油、 0. 04% (ν/ν)溴酚藍(lán))，煮沸l(wèi)Omin，上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離或保存于_20°C備用。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)的配制根據(jù)第二版《分子克隆實(shí)驗指南》(科學(xué)出版社)第883頁表18. 3制備所需濃度(8%或10% (w/v))的下層分離膠，根據(jù)第二版《分子克隆實(shí)驗指南》(科學(xué)出版社)第883頁表18. 4制備濃度為4% (w/ ν)的上層壓縮膠。電泳樣品在濃縮膠時電泳電壓為80V，當(dāng)樣品在兩層膠的交界處壓縮成一條直線后將電壓升至120V。根據(jù)樣品的溴酚藍(lán)前沿位置確定所需要的電泳時間。轉(zhuǎn)膜用電轉(zhuǎn)移方法O60mA轉(zhuǎn)池或者400mA轉(zhuǎn)2h)將凝膠內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，麗春紅染色檢查轉(zhuǎn)膜效率。封閉用含有5% (ff/v)脫脂牛奶/TBS-T緩沖液室溫封閉lh。一抗以適當(dāng)稀釋度稀釋于含5%脫脂牛奶的TBS-T緩沖液中，室溫孵育池或4°C 過夜。TBS-T緩沖液清洗3次，每次5min。二抗將相應(yīng)的抗兔或抗鼠的二抗以適當(dāng)稀釋度稀釋于含5%脫脂牛奶的TBS-T 緩沖液中，室溫孵育1 1.證。TBS-T緩沖液清洗3次，每次5min。壓片根據(jù)信號強(qiáng)弱在膜上滴加Pierce或Millipore公司的ECL化學(xué)發(fā)光底物， 然后用X光片曝光，經(jīng)沖片機(jī)自動顯影定影。Western Blot 所用試劑蛋白膠30% (ν/ν)丙烯酰胺、10 % (ν/ν)過硫酸銨、10 % (w/v) SDSUM Tris-Cl (pH6. 8)、1. 5M Tris-Cl (pH8. 8)。IOXRunning Buffer =Tris 0. 25M、Glycine 1. 92M、SDS 1 %，加水定容至 1000ml。10XTBS-T :Tris-Cl(pH7. 6)0. 2M、NaCl 1. 37M, Tween-201% (v/v)，加水定容至 1000ml。IXTransfer Buffer =Tris 0. 025M、Glycine 0. 129M、甲醇(v/v) 20%，加水定容至 IOOOml0IX 上樣緩沖液Tris-Cl 50mM(pH7. 4)、2 % SDS、5 % β -巰基乙醇、10 % 甘油、
0.01%溴酚藍(lán)。Stripping Buffer β -巰基乙醇(v/v)0. 8%,SDS 2%,Tris 0· 06Μ，HCl 調(diào) ρΗ 至 6. 7，加水定容至100ml。電泳遷移率變動實(shí)驗(EMSA)合成Src啟動子區(qū)域寡核苷酸探針序列，并于5’末端標(biāo)記生物素(biotin)。合成反向互補(bǔ)寡核苷酸序列并與標(biāo)記的正向序列混合發(fā)生退火反應(yīng)，形成雙鏈DNA。反應(yīng)條件為在退火緩沖液(IOmM HEPES，pH7. 8，10mM MgCl2O. ImM EDTA)中 100°C反應(yīng) 5 分鐘，并緩慢降至室溫以利于雙鏈DNA的形成。形成的雙鏈DNA可于3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將CA_NFATc3/pPyCAGIP電轉(zhuǎn)入的E14T ES細(xì)胞系，48小時后收集細(xì)胞，提取核蛋白。與標(biāo)記的寡核苷酸探針在室溫如下條件(IOmM Tris-HCl, pH 7. 5,50mM KCl,50mM NaCl, ImM MgCl2, ImM EDTA, 5mM DTT和5%甘油)結(jié)合15分鐘。根據(jù)Pierce試劑盒操作手冊進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，通過化學(xué)發(fā)光核酸檢測試劑盒(Pierce)檢測核酸蛋白結(jié)合條帶。類胚體(EmbryoidBody, EB)形成實(shí)驗小鼠ES細(xì)胞消化計數(shù)。取0. 5-1 X IO6細(xì)胞置于IOcm不貼壁的培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為不含LIF的ES細(xì)胞培養(yǎng)基。懸浮的ES細(xì)胞可于2天后形成多個EB球體， 并隨著時間增加，體積和形態(tài)有所變化。在不同的時間點(diǎn)，觀察EB形態(tài)、拍照或收集EB用于PCR、Wfestern blotting以及免疫染色分析。^iia^Tt^fe^iiT (Immunoflourescence staining)將細(xì)胞傳代并生長于鋪有玻片(Fisher Scientific)的培養(yǎng)皿中，染色時取出玻片，PBS洗后以4%多聚甲醛/PBS室溫固定15分鐘，PBS洗三遍，0. 2% (v/v) TritonX-IOO/ PBS于室溫10分鐘通透細(xì)胞膜；用3% BSA(w/v)/PBS室溫封閉30分鐘后，加入3% BSA/ PBS稀釋至適當(dāng)濃度的一抗，4°C孵育過夜。次日，PBS 3X5分鐘洗去一抗，加針對一抗的熒光二抗(Jackson Immuno Research)，室溫孵育1小時，PBS 3X5分鐘洗去二抗，以IOOng/ ml DAPI處理5分鐘標(biāo)記細(xì)胞核，PBS洗后用熒光封片劑(DAKO)封片，以倒置熒光顯微鏡觀察并拍照，或置于4°C保存。小鼠胚胎組織化學(xué)染色小鼠胚胎在4% (w/v) PFA (PBS配制)中固定10分鐘。用1 X PBS漂洗3_5次后置于0.25% Triton X-IOO室溫通透處理8分鐘。1 XPBS漂洗3-5次，2% BSA封閉處理30 分鐘。然后加入0. 1% Tween-20與特異性抗體，4°C孵育過夜。IXPBS漂洗3_5次，加入熒光標(biāo)記二抗室溫孵育1小時后用DAPI復(fù)染細(xì)胞核。1 XPBS漂洗3-5次后封片，激光共聚焦顯微鏡觀察胚胎染色情況。嵌合胚胎實(shí)驗(chimeric embryo Assay)將無添加LIF用抑制劑長期培養(yǎng)綠色熒光標(biāo)記的ES細(xì)胞系CGR8通過顯微操作儀注射入E3. 5小鼠的囊胚中，并移植入假孕2. 5天的ICR雌鼠子宮內(nèi)。經(jīng)過體內(nèi)發(fā)育，E18. 5 時期的移植胚胎從母體取出，檢測綠色熒光的表達(dá)。H&E ^cfe (hematoxylin and eosin staining)切片于自來水中沖洗片刻，ddH20泡1分鐘。滴加蘇木精染色液染5分鐘(可于光鏡下觀察染色強(qiáng)度，時間可有所增減)，自來水沖洗片刻。(v/v)HCl/100% (ν/ν)乙醇分化3-5秒，鏡下見細(xì)胞質(zhì)蘭色變淺即可，自來水沖洗片刻。95%乙醇，2分鐘0次)；100% 乙醇，2分鐘0次)。伊紅染液處理1分鐘，自來水沖洗片刻。二甲苯乙醇(1 1)，2分鐘；二甲苯，2分鐘0次)；樹膠(配于二甲苯中)封閉，保存。數(shù)據(jù)統(tǒng)計圖中數(shù)據(jù)為平均值士標(biāo)準(zhǔn)差(mean士S. D.)。統(tǒng)計學(xué)比較采用student's t檢驗， P < 0. 05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)的差異，ρ <0.01認(rèn)為具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗方法，通常按照常規(guī)條件如 Sambrook 等人，分子克隆實(shí)驗室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 2002)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。實(shí)施例1、Calcinuerin-NFAT信號通路對ES細(xì)胞胚層分化是必需的PB轉(zhuǎn)座子突變ES細(xì)胞內(nèi)源基因Ppp3rl后，在撤去LIF誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化條件下， ES細(xì)胞不能進(jìn)行正常的胚層分化，提示Calcinuerin-NFAT信號通路在調(diào)控ES細(xì)胞胚層分化方面潛在地有重要作用。為驗證這個假設(shè)，本發(fā)明人用Calcinuerin抑制劑CsA處理ES細(xì)胞，并在添加 LIF (+LIF)或撤除LIF(-LIF)的情況下檢測細(xì)胞形態(tài)和基因表達(dá)。ES細(xì)胞撤除LIF培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯分化，胚層分化標(biāo)志基因Fgf5、Cdx2、Dab2、NestiruT和Mixll都有顯著升高而多能性標(biāo)志基因0ct4、Nanog和Rexl都有下降(圖la、b)。染色實(shí)驗也表明基因 Nanog的蛋白水平在撤除LIF培養(yǎng)后也顯著下降(圖Ic)。而抑制劑CsA的處理可以有效地阻斷由撤除LIF引起的ES細(xì)胞分化表型(圖la-c)。相反，CsA并不影響撤除LIF引起的的去磷酸化，只是阻斷ES細(xì)胞分化引起的Mat3蛋白總量的下降(圖Id ；圖8)。 Calcinuerin其他兩個抑制劑Π(506和VIVIT同樣都可以阻斷去LIF引起ES細(xì)胞分化(圖 9)。為了排除抑制劑的非特異性，通過RNA干涉下調(diào)基因Ppp3rl同樣可以抑制去LIF引起的ES細(xì)胞分化(圖le、f)。除此之外，抑制劑CsA還可以阻斷維甲酸(retinoic acid,RA) 引起的ES細(xì)胞分化(圖10)。因此Calcinuerin-NFAT信號通路對各種外在刺激引起的ES 細(xì)胞胚層分化都是必需的。本發(fā)明人進(jìn)一步研究在撤除LIF情況下，CsA能夠長期維持ES細(xì)胞的自我更新。 ES細(xì)胞在無LIF加CsA情況培養(yǎng)40天后，仍然可以維持未分化形態(tài)(圖1 la)。這些細(xì)胞撤除CsA后懸浮培養(yǎng)仍可形成具有三胚層分化能力的類胚體(embryoid bodies, EB)(圖lg、 h ；圖lib)。將CsA長期培養(yǎng)ES細(xì)胞注射入裸鼠體內(nèi)也可以形成具有三胚層分化能力的畸胎瘤(圖Ii)。最后，將這些細(xì)胞用綠色熒光標(biāo)記，注射入小鼠囊胚，可以觀察到有綠色熒光的嵌合胚胎(圖Ij)。因此，抑制Calcinuerin-NFAT信號通路可以不依賴LIF，長期維持ES細(xì)胞自我更新。實(shí)施例2、Calcinuerin-NFAT信號通路在ES細(xì)胞分化過程中被激活本發(fā)明人進(jìn)一步檢測了 Calcinuerin-NFAT信號通路在ES細(xì)胞分化過程的的表達(dá)情況。Calcinuerin各亞基轉(zhuǎn)錄水平在ES細(xì)胞去LIF引起的分化過程中均有上升(圖加)。蛋白質(zhì)印跡(western blot)和芯片數(shù)據(jù)表明在小鼠ES細(xì)胞中NFAT家族成員中的NFATc3和NFATc4處于高表達(dá)水平。NFATc4蛋白水平在ES細(xì)胞分化過程中顯著上升，而 NFATc3蛋白水平一直處于高表達(dá)(圖2b、c)。值得注意的是，NFATc3在未分化的ES細(xì)胞中定位于細(xì)胞漿，而撤除LIF后定位于細(xì)胞核(圖2d)，表明在ES細(xì)胞分化過程中NFATc3被激活。本發(fā)明人進(jìn)一步檢測了含有NFAT AP-I結(jié)合位點(diǎn)的鼠源112啟動子熒光素酶報告基因活性，發(fā)現(xiàn)撤除LIF顯著提高報告基因活性(圖加)，表明NFAT信號通路在ES細(xì)胞分化過程中被激活。由于NFATc3在ES細(xì)胞中處于高表達(dá)，且分化后很快被激活，在后續(xù)實(shí)驗中在NFAT家族成員中將重點(diǎn)研究這個基因。實(shí)施例3、Calcinuerin-NFAT信號通路促發(fā)ES細(xì)胞發(fā)生胚層分化為研究Calcinuerin-NFAT信號通路的激活能否促發(fā)ES細(xì)胞發(fā)生分化，本發(fā)明人在ES細(xì)胞中過表達(dá)激活形式的Calcinuerin(ACnA)和NFATcl-4 (CA_NFATcl_4)。引人注意的是，在添加LIF的情況下，在轉(zhuǎn)染后ES細(xì)胞發(fā)生明顯分化(圖3a)。CA-NFATc 1-4過表達(dá)顯著降低多能性標(biāo)志基因(0ct4、Nanog和Rexl)，而提高分化標(biāo)志基因，特別是滋養(yǎng)層(CdX2，Handl)和原始內(nèi)胚層(Gata6，Ihh)。相對的Δ CnA過表達(dá)引起的分化要弱于CA-NFATc 1-4(圖北、c)。有趣的是激活Calcinuerin-NFAT信號通路引起的ES分化表型和激活Ras通路引起的十分相似(圖12)。進(jìn)一步將過表達(dá)激活形式NFATc3的ES細(xì)胞注射入裸鼠體內(nèi)，形成出血的畸胎瘤(圖3d)。 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(RT-PCR)表明過表達(dá)CA_NFATc3細(xì)胞形成的畸胎瘤跟對照相比滋養(yǎng)層和原始內(nèi)胚層相關(guān)標(biāo)志基因上升最為顯著，而其他胚層標(biāo)志基因變化不大(圖!Be)。因此，激活Calcinuerin-NFAT信號通路可以充分的誘導(dǎo)ES細(xì)胞發(fā)生早期分化。 實(shí)施例4、NFAT直接激活基因Src的表達(dá)為了尋找Calcinuerin-NFAT信號通路調(diào)節(jié)的下游基因，本發(fā)明人進(jìn)行了 NFAT信號通路抑制和激活情況下的生物芯片研究，發(fā)現(xiàn)168個基因受NFAT通路上調(diào)控，138個基因受NFAT通路下調(diào)控。本發(fā)明人將這些基因進(jìn)行信號通路分析，發(fā)現(xiàn)焦點(diǎn)粘附和細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路受NFAT調(diào)節(jié)最為顯著(圖13a、b)。尋找NFAT直接下游基因，本發(fā)明人將上述兩個信號通路中的基因的啟動子進(jìn)行NFAT和其常見共同因子AP-I的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測。發(fā)現(xiàn)基因Src啟動子區(qū)域含有保守的NFAT和AP-I結(jié)合位點(diǎn)，而且AP-I結(jié)合位點(diǎn)已有文獻(xiàn)證實(shí)。 基因Src是一個非受體絡(luò)氨酸激酶，抑制劑PP2可以抑制它的活性。文獻(xiàn)報道Src在調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和延伸方面起重要作用，但它在ES細(xì)胞中研究卻很少。為研究Src是否是NFAT 的下游基因，本發(fā)明人在CA-NFATc3的誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞系(iNFATc3ES細(xì)胞系)中研究了兩者的關(guān)系。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)CA-NFATc3表達(dá)后，可以迅速激活Src的表達(dá)(圖如)。過表達(dá)激活形式的Calcinuerin、NFATc 1-4和Ras也均可以提高Src表達(dá)(圖4b、c)。而且 Calcinuerin抑制劑CsA在去LIF分化過程中可以抑制Src表達(dá)的升高(圖4d)。因此Src 的表達(dá)是受NFAT信號通路調(diào)節(jié)的。為研究NFAT是否直接調(diào)節(jié)Src的表達(dá)，本發(fā)明人用包含NFAT結(jié)合位點(diǎn)的Src啟動子探針，和過表達(dá)CA-NFATc3的ES細(xì)胞核裂解液進(jìn)行了電泳遷移率實(shí)驗(EMSA)。實(shí)驗表明蛋白NFATc3可以和Src探針形成DNA-蛋白復(fù)合物，當(dāng)加入NFATc3抗體時還可以形成抗體膠移動(supershift)(圖如)，這和陽性對照探針112的結(jié)果是一致的，表明蛋白NFATc3 在體外可以直接結(jié)合到Src啟動子區(qū)域。熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M(jìn)一步表明NFAT和AP-I結(jié)合位點(diǎn)對NFATc3激活Src的表達(dá)是必需的(圖4f)。染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗表明，NFATc3在撤除LIF或過表達(dá)CA_NFATc3引起的ES細(xì)胞分化過程中，均可以體內(nèi)結(jié)合到Src啟動子區(qū)域(圖4g)。因此，NFAT直接激活下游基因Src的表達(dá)。實(shí)施例5、Src對Calcinuerin-NFAT信號通路引起的ES細(xì)胞分化是必需的Src是NFAT信號通路的下游基因，那么它對NFAT誘導(dǎo)的ES分化是否必需呢。本發(fā)明人首先在ES細(xì)胞中過表達(dá)Src的活性形式(Src F)，它可以快速誘導(dǎo)ES細(xì)胞發(fā)生分化(圖如)，多能性標(biāo)志基因顯著降低，而分化標(biāo)志基因，特別是滋養(yǎng)層和原始內(nèi)胚層明顯提高(圖恥)，這和過表達(dá)激活形式的NFAT或者Ras引起的表型是是十分相似的。本發(fā)明人進(jìn)一步實(shí)驗發(fā)現(xiàn)Src抑制劑PP2也可以從細(xì)胞形態(tài)和分子標(biāo)志基因上完全阻斷NFATc3引起的ES細(xì)胞分化(圖5c、d)。為了排除抑制劑的非特異性，通過RNA干涉下調(diào)基因Src同樣可以抑制NFATc3引起的ES細(xì)胞分化(圖k和圖14)。除此之外，Src抑制劑PP2還可以阻斷撤除LIF或者過表達(dá)激活的Ras弓丨起的ES細(xì)胞分化(圖5f、g和圖15)。因此，基因Src和NFAT和Ras —樣對誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化是充分和必需的。實(shí)施例6、NFAT-Src介導(dǎo)的EMT對ES細(xì)胞分化是一個必要的階段因為Src在多種細(xì)胞中可以誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換即EMT，而且許多EMT誘導(dǎo)因子(Tgf β，F(xiàn)gf家族，Ras-Erkl/2)都可以誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化，因此提示Src通過誘導(dǎo)EMT 而促發(fā)ES細(xì)胞分化。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，Src在促發(fā)ES細(xì)胞分化的同時，也可以激活EMT相關(guān)標(biāo)志基因 (Igf2、SIP1、Ncad和Snail)的表達(dá)。其中作為EMT重要組成部分基質(zhì)金屬蛋白酶(Mmp) 的表達(dá)也有明顯升高(圖6a)。E-cadherin是上皮細(xì)胞的重要標(biāo)志基因，在ES細(xì)胞未分化狀態(tài)定位于細(xì)胞膜，Src引起ES細(xì)胞分化后，E-cadherin定位發(fā)生變化，在細(xì)胞漿出現(xiàn)表達(dá)(圖6b)。作為Src的上游激活通路，激活NFAT或Ras通路同樣可以誘導(dǎo)EMT相關(guān)標(biāo)志基因的升高(圖16a、b)。而且在過表達(dá)CA-NFATc3或者撤除LIF引起的ES細(xì)胞分化過程中，E-cadherin的定位也發(fā)生同樣的變化(圖16c、d)。因此，Src在促發(fā)ES細(xì)胞分化的同時也誘導(dǎo)EMT的發(fā)生。為研究EMT和ES細(xì)胞分化之間的關(guān)系，本發(fā)明人進(jìn)行了 CA_NFATc3誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化不同時間點(diǎn)的研究。發(fā)現(xiàn)EMT相關(guān)標(biāo)志基因在誘導(dǎo)表達(dá)CA-NFATc31天后升高，早于ES 細(xì)胞分化標(biāo)志基因1. 5天的升高和多能性標(biāo)志基因3天的降低(圖6c)，表明EMT早于ES 細(xì)胞分化發(fā)生。本發(fā)明人進(jìn)一步用MMP廣譜的抑制劑GM6001 (Merck)抑制EMT過程，發(fā)現(xiàn)GM6001 也可以阻斷NFATc3弓丨起的ES細(xì)胞分化(圖6d、e)，而且可以部分阻斷撤除LIF弓丨起的ES 細(xì)胞分化(圖17)。而且，Calcinuerin抑制劑CsA和Src抑制劑PP2也可以有效的阻斷撤除LIF引起的EMT相關(guān)標(biāo)志基因的上升，提示它們通過抑制EMT過程而維持ES細(xì)胞的自我更新。實(shí)施例7、Calcinuerin-NFAT信號通路的激活對早期胚胎發(fā)育是必不可少的最后，本發(fā)明人在早期小鼠胚胎水平上研究了 Calcinuerin-NFAT信號通路的表達(dá)和功能。植入前階段的小鼠胚胎包含三種細(xì)胞類型滋養(yǎng)層，原始內(nèi)胚層和上胚層。胚胎染色表明NFATc3在上胚層這些未分化細(xì)胞中定位于細(xì)胞漿，為非活性形式，而在滋養(yǎng)層和 4. 5天胚胎的原始內(nèi)胚層這些分化細(xì)胞中被激活，進(jìn)入于細(xì)胞核。與之相反，多能性標(biāo)志基因0ct4只在上胚有表達(dá)(圖7a)。因此NFAT信號通路在胚胎早期發(fā)育中被激活。為研究Calcinuerin-NFAT信號通路在早期小鼠胚胎發(fā)育中的功能，本發(fā)明人用 Calcinuerin抑制劑CsA和Src抑制劑PP2處理8細(xì)胞期的小鼠胚胎。小鼠胚胎在8細(xì)胞階段用抑制劑處理，2天后觀察囊胚腔的形成。實(shí)驗表明，它們能不同程度的阻斷囊胚腔的形成，使胚胎發(fā)育阻滯在桑椹胚階段(表1)。表1、抑制劑CsA和PP2對囊胚腔形成的作用
權(quán)利要求
1.鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-活化T細(xì)胞核因子信號通路的調(diào)節(jié)劑的用途，用于制備調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育的組合物。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的調(diào)節(jié)劑是抑制劑，其用于制備抑制胚胎干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育的組合物。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑選自環(huán)孢素A；FK506 ； VIVIT ；GM6001 ；PP2 ；特異性干擾鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶基因表達(dá)的干擾分子；特異性結(jié)合鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的抗體或配體。
4.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的調(diào)節(jié)劑是促進(jìn)劑，其用于制備促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育的組合物。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的促進(jìn)劑是一表達(dá)載體，其中含有鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶編碼基因或活化T細(xì)胞核因子編碼基因；或者，所述的促進(jìn)劑是促進(jìn)Ca2+信號通路的物質(zhì)。
6.如權(quán)利要求1-5任一所述的用途，其特征在于，所述的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶包括亞基=CnA ；或所述的活化T細(xì)胞核因子包括AFAI^cl、NFAjTcZ、NFATc3, NFATc40
7.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于激活下游靶基因Src 或促進(jìn)上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換。
8.一種篩選調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育的潛在物質(zhì)的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)將候選物質(zhì)與含有鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-活化T細(xì)胞核因子信號通路的體系接觸；(2)檢測候選物質(zhì)對鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-活化T細(xì)胞核因子信號通路的影響；若所述候選物質(zhì)提高鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和/或活化T細(xì)胞核因子的表達(dá)或活性，則表明該候選物質(zhì)是促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育的潛在物質(zhì)；若所述候選物質(zhì)抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和/或活化T細(xì)胞核因子的表達(dá)或活性，則表明該候選物質(zhì)是抑制胚胎干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育的潛在物質(zhì)。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(1)包括在測試組中，將候選物質(zhì)加入到含有鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-活化T細(xì)胞核因子信號通路的體系中；和/或步驟( 包括檢測測試組的體系中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和/或活化T細(xì)胞核因子的表達(dá)或活性，并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質(zhì)的含有鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-活化T細(xì)胞核因子信號通路的體系；如果測試組中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和/或活化T細(xì)胞核因子的表達(dá)或活性在統(tǒng)計學(xué)上高于對照組，就表明該候選物質(zhì)是促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育的潛在物質(zhì)；如果測試組中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和/或活化T細(xì)胞核因子的表達(dá)或活性在統(tǒng)計學(xué)上低于對照組，就表明該候選物質(zhì)是抑制胚胎干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育的潛在物質(zhì)。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的體系中還包含Src表達(dá)品.，步驟( 包括檢測候選物質(zhì)對Src表達(dá)的影響；若所述候選物質(zhì)促進(jìn)Src表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育的潛在物質(zhì)；若所述候選物質(zhì)抑制Src表達(dá)，則表明該候選物質(zhì)是抑制胚胎干細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育的潛在物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及調(diào)控胚胎干細(xì)胞及早期胚胎的胚層分化的方法和試劑。首次揭示激活Calcinuerin-NFAT信號通路與胚胎干細(xì)胞(ES)的分化或自我更新密切相關(guān)，激活該通路可以促發(fā)ES細(xì)胞進(jìn)行胚層分化，而抑制這條信號通路可以長期維持ES細(xì)胞自我更新。
文檔編號C12N5/0735GK102382796SQ20101026830
公開日2012年3月21日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月31日
發(fā)明者朱莉莉, 李翔, 金穎 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院