專利名稱：仿刺參體壁總rna提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種仿刺參體壁總RNA的提取方法，尤其是一種可避免仿刺參體壁中 粘多糖、膠原蛋白和色素等影響，提取純度高、完整性好、得率高的仿刺參體壁總RNA的方 法。
背景技術(shù)：
從組織細(xì)胞中提取純度高、完整性好的RNA是進(jìn)行分子生物學(xué)研究的必要前提和 關(guān)鍵，因不同物種的組織成分和結(jié)構(gòu)具有差異性，所以對(duì)不同細(xì)胞來(lái)源的RNA的提取必須 選擇相應(yīng)的制備方法。仿刺參體壁結(jié)締組織層較厚，由分布比較疏松的膠原纖維構(gòu)成，體壁化學(xué)成分主 要為粘 多糖、膠原蛋白和色素，這使得提取仿刺參體壁總RNA時(shí)樣品很難勻漿，采用常規(guī)的 RNA提取方法所獲得的提取物中常含有粘多糖等膠狀不溶物和大量黑褐色色素，總RNA純 度低、質(zhì)量差，這些雜質(zhì)不但嚴(yán)重影響了之后的RT-PCR等酶促反應(yīng)，而且也難以滿足某些 實(shí)驗(yàn)(如DDRT-PCR、分子克隆等)對(duì)模板純度的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問(wèn)題，提供一種可避免仿刺參體壁 中粘多糖、膠原蛋白和色素等影響，提取純度高、完整性好、得率高的仿刺參體壁總RNA的 方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種仿刺參體壁RNA提取方法，其特征是按如下步驟 進(jìn)行a.用0. 45 μ m濾膜過(guò)濾的海水清洗仿刺參，取50mg IOOmg仿刺參體壁組織至液 氮中速凍；b.將速凍的組織研磨成粉末置入加有ImL TRIzol裂解液的勻漿器中勻漿，將勻 漿液移至離心管A中，室溫靜置5min，4°C，12000rpm/min離心，取上清至離心管B中；c.向離心管B中加入200yL氯仿，搖動(dòng)14 16s，室溫靜置2 3min，4°C， 12000rpm/min離心，取上清至離心管C中；d.向離心管C中加250 μ L高鹽溶液(0. 8mol/L檸檬酸鈉和1. 2mol/L氯化鈉的混 合液)及250 μ L異丙醇，室溫放置10min，4°c，12000rpm/min離心，棄上清，沉淀用75%乙 醇漩渦振蕩洗滌，4°C，7500rpm/min離心，吸掉酒精，干燥沉淀物5min IOmin ；e.用0. 1 % DEPC處理水溶解所得沉淀物并定容至20 μ 1 ；f.向e步驟所得溶解液中依次加入3 μ L無(wú)RNA酶的DNA酶緩沖液、6 μ L無(wú)RNA 酶的DNA酶(1U/ μ L)及1 μ L RNA酶抑制劑混勻，37 °C水浴Ih，得DNA裂解液；g.取 30 μ LDNA 裂解液，加入酚氯仿(5 1)30 μ L，混勻，4°C，12000rpm/min 離 心，取上清；h.向上清液中加入4μ L 1011^/1^糖原溶液、61^ 2. 5mol/L的醋酸鉀溶液及120 μ L預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻后-20°c過(guò)夜，4°C，lOOOOrpm/min離心，棄上清，沉淀用75% 乙醇洗滌兩次、干燥；i.用0. 1 % DEPC處理水溶解所得沉淀物并定容至20 μ L，-80°C保存。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)
①取樣后在液氮中凍存之后研磨，始終保持液氮覆蓋樣品，能夠很好的抑制RNA 酶活性，充分破碎細(xì)胞。②研磨后移到加有ImL TRIzol的勻漿器中勻漿，能夠更好的裂解細(xì)胞使RNA充分 釋放出來(lái)。③粗提時(shí)用高鹽溶液和異丙醇等體積沉淀，純化過(guò)程中沉淀時(shí)使用醋酸鉀，都能 夠更有效的去除多糖和色素的污染。④用DNase消化粗提的樣品，并將消化時(shí)間延長(zhǎng)到lh，可以更有效的去除基因組 DNA的污染。⑤純化時(shí)加入適量糖原(lOmg/mL)與RNA共沉淀，可以提高RNA的產(chǎn)率(糖原濃 度在不高于4mg/mL時(shí)不會(huì)影響RT-PCR反應(yīng)的進(jìn)行)。⑥通過(guò)本發(fā)明制備的仿刺參體壁總R N A完全可以滿足Northern印跡、基因表達(dá) 分析、分子克隆等實(shí)驗(yàn)的要求。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例提取并純化出的仿刺參體壁總RNA的瓊脂糖電泳圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例提取并純化出的仿刺參體壁總RNA反轉(zhuǎn)錄后，仿刺參 β -actin基因的PCR擴(kuò)增瓊脂糖電泳圖。
具體實(shí)施例方式a.用0. 45 μ m濾膜過(guò)濾的海水清洗暫養(yǎng)的仿刺參，用手術(shù)刀取50mg IOOmg仿刺 參體壁組織迅速投入液氮中速凍；b.將凍存的組織研磨成粉末，用藥勺迅速將粉末置入加有ImL TRIzol裂解液(主 要成分是苯酚，還加入了 8-羥基喹啉、異硫氰酸胍、β -巰基乙醇等，Invitrogen公司產(chǎn)品) 的勻漿器中勻漿，將勻漿液移至離心管A中，室溫靜置5min，4°C，12000rpm/min離心lOmin， 取上清至離心管B中；c.向離心管B中加入200yL氯仿，搖動(dòng)14 16s，室溫靜置2 3min，4°C， 12000rpm/min離心15min，取上清至離心管C中；d.向離心管C中加250 μ L高鹽溶液(0. 8mol/L檸檬酸鈉和1. 2mol/L氯化鈉的混 合液)及250 μ L異丙醇，室溫放置10min，4°c，12000rpm/min離心，棄上清，沉淀用75%乙 醇漩渦振蕩洗滌，4°C，7500rpm/min離心lOmin，吸掉酒精，超凈工作臺(tái)干燥沉淀物5min IOmin ；e.用0. 1 % DEPC (焦碳酸二乙酯B. B. I公司產(chǎn)品)處理水溶解所得沉淀物并定容 至 20 μ 1 ；f.向e步驟所得溶解液中依次加入3 μ L無(wú)RNA酶的DNA酶緩沖液 (IOXRNase-Free DNase Buffer, TaKaRa 公司產(chǎn)品)、6μ L 無(wú) RNA 酶的 DNA 酶(1U/μ L, RNase-Free DNase, TaKaRa 公司產(chǎn)品)及 1 μ L RNA 酶抑制劑(RNasinPlus RNase Inhibitor, Promega公司產(chǎn)品)混勻，37°C水浴lh，得DNA裂解液；g.取 30 μ LDNA 裂解液，加入酚氯仿(5 1)30 μ L，混勻，4°C，12000rpm/min 離 心15min，取上清；h.向上清液中加入4μ L 1011^/1^糖原溶液、61^ 2. 5mol/L的醋酸鉀溶液及 120 μ L預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻后-20°c過(guò)夜，40C，10000rpm/min離心15min，棄上清，沉淀用 75%乙醇洗滌兩次、在超凈臺(tái)干燥；i.用0. DEPC (焦碳酸二乙酯B. B. I公司產(chǎn)品)處理水溶解所得沉淀物并定容 至 20μ L，-80°c保存。本發(fā)明提取并純化出的仿刺參體壁總RNA的瓊脂糖電泳如圖1所示28s帶亮度 和寬度皆為18s帶的二倍，說(shuō)明此總RNA純度和完整性好、質(zhì)量高。
本發(fā)明提取后的仿刺參體壁總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，對(duì)β-actin基因進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖如圖2所示帶型清晰、穩(wěn)定，說(shuō)明此總RNA完全能夠滿足后續(xù) Northern印跡、基因表達(dá)分析、分子克隆等實(shí)驗(yàn)的要求。
權(quán)利要求
一種仿刺參體壁總RNA提取方法，其特征是依次按如下步驟進(jìn)行a.用0.45μm濾膜過(guò)濾的海水清洗仿刺參，取50mg～100mg仿刺參體壁組織至液氮中速凍；b.將速凍的組織研磨成粉末置入加有1mL TRIzol裂解液的勻漿器中勻漿，將勻漿液移至離心管A中，室溫靜置5min，4℃，12000rpm/min離心，取上清至離心管B中；c.向離心管B中加入200μL氯仿，搖動(dòng)14～16s，室溫靜置2～3min，4℃，12000rpm/min離心，取上清至離心管C中；d.向離心管C中加250μL高鹽溶液(0.8mol/L檸檬酸鈉和1.2mol/L氯化鈉的混合液)及250μL異丙醇，室溫放置10min，4℃，12000rpm/min離心，棄上清，沉淀用75％乙醇漩渦振蕩洗滌，4℃，7500rpm/min離心，吸掉酒精，干燥沉淀物5min～10min；e.用0.1％DEPC處理水溶解所得沉淀物并定容至20μl；f.向e步驟所得溶解液中依次加入3μL無(wú)RNA酶的DNA酶緩沖液、6μL無(wú)RNA酶的DNA酶(1U/μL)及1μL RNA酶抑制劑混勻，37℃水浴1h，得DNA裂解液；g.取30μL DNA裂解液，加入酚∶氯仿(5∶1)30μL，混勻，4℃，12000rpm/min離心，取上清；h.向上清液中加入4μL 10mg/mL糖原溶液、6μL 2.5mol/L的醋酸鉀溶液及120μL預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻后-20℃過(guò)夜，4℃，10000rpm/min離心，棄上清，沉淀用75％乙醇洗滌兩次、干燥；i.用0.1％DEPC處理水溶解所得沉淀物并定容至20μL，-80℃保存。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種提取純度高、完整性好、得率高的仿刺參體壁總RNA的方法，具體方法是取仿刺參體壁組織至液氮中速凍；將速凍的組織研磨后置入裂解液中勻漿、離心，取上清；向上清中加入氯仿，再離心取上清至另一離心管中；再加入高鹽溶液及異丙醇，所得沉淀用乙醇洗滌；用DEPC處理水溶解沉淀并定容；向所得溶解液中依次加入無(wú)RNA酶的DNA酶緩沖液、無(wú)RNA酶的DNA酶及RNA酶抑制劑混勻，37℃水浴得DNA裂解液；向DNA裂解液中加入酚∶氯仿(5∶1)混勻，離心取上清；向上清液中加入糖原溶液、醋酸鉀溶液及預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻過(guò)夜后離心棄上清，沉淀用乙醇洗滌、干燥；用DEPC處理水溶解最終沉淀物并定容至20μL，-80℃保存。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101864414SQ20101022340
公開(kāi)日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2010年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月12日
發(fā)明者李霞, 王雪, 秦艷杰, 鄭柯, 陳秋實(shí) 申請(qǐng)人:大連海洋大學(xué)