專(zhuān)利名稱(chēng)：用畢赤酵母pGAP調(diào)控表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種應(yīng)用畢赤酵母的pGAP啟動(dòng)子調(diào)控生產(chǎn)生物 蛋白的方法，具體是一種應(yīng)用畢赤酵母的PGAP調(diào)控表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的方法。
背景技術(shù)：
L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(L-arabinose isomerase EC 5. 3. 1.4)是由一系列微生物產(chǎn) 生的、具有變構(gòu)作用的酶。L-阿拉伯糖異構(gòu)酶能催化L-阿拉伯糖為L(zhǎng)-核酮糖；由于L-阿 拉伯糖和D-半乳糖結(jié)構(gòu)的相似性，故L-阿拉伯糖異構(gòu)酶也能催化D-半乳糖異構(gòu)為D-塔 格糖。D-塔格糖是甜味劑，具有低能量，降低血糖和抗齲齒等功能。雖然多種微生物具有 產(chǎn)生L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的功能，但是，由于或是天然的產(chǎn)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶菌株的生長(zhǎng)緩 慢，營(yíng)養(yǎng)要求較高，或是產(chǎn)物在胞內(nèi)形成包涵體(細(xì)菌菌株)不利于目標(biāo)蛋白的純化，導(dǎo)致 生產(chǎn)成本較高。畢赤酵母(Pichia pastoris)是最近迅速發(fā)展的一種真核表達(dá)宿主，營(yíng)養(yǎng)要求不 高，適合于高密度發(fā)酵的大規(guī)模生產(chǎn)方式，由于Pichiapastoris分泌自身的蛋白很少，有 利于表達(dá)產(chǎn)物的純化。PGAP (三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子)是Pichia pastoris的組成型 強(qiáng)啟動(dòng)子，與Pichia pastoris的pAOXl (醇氧化酶1啟動(dòng)子)相比其優(yōu)越性主要是不需要 有毒性的甲醇作為碳源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為解決應(yīng)用天然產(chǎn)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的菌株生產(chǎn)木糖異構(gòu)酶的 成本較高、產(chǎn)物難于純化的問(wèn)題，而提供一種用畢赤酵母PGAP(三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng) 子)調(diào)控表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種用畢赤酵母pGAP調(diào)控表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的方法，其步驟是1、首先從畢赤酵母中擴(kuò)增pGAP啟動(dòng)子；2、在L-阿拉伯糖異構(gòu)酶序列的3’末端融合His6標(biāo)簽，構(gòu)建由pGAP調(diào)控L-阿拉 伯糖異構(gòu)酶基因的由G418抗性基因作為篩選標(biāo)記的畢赤酵母表達(dá)載體，將這一載體轉(zhuǎn)化 畢赤酵母基因組，并將轉(zhuǎn)化物涂布于含G418彡300 μ g/mL的G418-YPD平板上；即涂布于含 G418 為彡 300 μ g/mL 的 YPD (2%蛋白胨，yeast extract，2%葡萄糖)平板上；3、從步驟2的G418-YPD平板上再挑選畢赤酵母重組子作為工程菌株(畢赤酵母 的基因組中沒(méi)有G418抗性基因，在含G418抗性的平板上不能生長(zhǎng)；由于重組子含有G418 抗性基因，所以在含G418抗性的平板上能生長(zhǎng)。也就是說(shuō)在G418抗性平板上能生長(zhǎng)的就 是重組子)；4、將步驟3獲得的工程菌株接種于含碳源的液體培養(yǎng)基中，于28 30°C在生物 反應(yīng)器中發(fā)酵1 2d分泌表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶。所述液體培養(yǎng)基是由以下組分組成 85%磷酸 25 28ml/L、CaSO4 · 2Η20 0· 8 1. 2 g/L、K2SO4 17 19g/L、MgSO4 · 7H20 13 16g/L、K0H 3· 5 4. 5g/L、碳源 15 45g/L、蛋白胨 18 22g/L、Yeastextract 8 12g/ L、PTM43 5ml/L。所述碳源是甘油、油酸、山梨醇、葡萄糖、乳酸、甘氨酸、丙氨酸、海藻糖或 甘露醇。所述 PTM4 是由以下組分組成=CuSO4 ‘ 5H20 2. 0g/L、NaI · 2H20 0. lg/L、MnSO4 · H2O 3. Og/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 2g/L、H3BO3 0. 02g/L、CoCl2 · 6H20 1. 05g/L、ZnCl2 7. Og/L、 Fe2 (SO4) 3 · 7H20 22g/L、生物素 0. 2g/L、硫酸 lml/L。本發(fā)明采用了畢赤酵母的pGAP調(diào)控表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，具有下列優(yōu)點(diǎn)1、生產(chǎn)成本低，只需使用普通的無(wú)機(jī)鹽、碳源和氮源作為發(fā)酵培養(yǎng)基。2、可在生物反應(yīng)器中發(fā)酵畢赤酵母，其細(xì)胞能生長(zhǎng)至細(xì)胞密度達(dá)200A以上，能以 足夠多的細(xì)胞數(shù)量表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，有利于L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的大規(guī)模生產(chǎn)。3、發(fā)酵周期短，整個(gè)發(fā)酵周期只需1 2d。4、使用無(wú)毒性的碳源，不需要使用有毒性的甲醇作為碳源。5、由于pGAP是畢赤酵母的強(qiáng)啟動(dòng)子，由pGAP調(diào)控表達(dá)的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶約占 總分泌蛋白的比例較高，并且由于在L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的C端融合了 His標(biāo)簽，有利于產(chǎn) 物的純化。
具體實(shí)施例方式下面才用非限定性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例一1、首先從Pichia pastoris中擴(kuò)增pGAP啟動(dòng)子；2、在L-阿拉伯糖異構(gòu)酶序列的3’末端融合His6標(biāo)簽，構(gòu)建由pGAP調(diào)控L-阿拉 伯糖異構(gòu)酶基因的Pichia pastoris表達(dá)載體，將這一載體轉(zhuǎn)化Pichia pastoris基因組， 并將轉(zhuǎn)化物涂布于含G418彡300 μ g/mL的G418-YPD平板上；3、從步驟2的G418-YPD平板上再挑選畢赤酵母重組子作為工程菌株；4、將工程菌株菌液接種于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基的配方(每升)85%磷酸 26. 7ml, CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g，甘油 40g，蛋白 胨 20g, Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml] (PTM4 配方(每升)=CuSO4 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵表達(dá) L-阿拉伯糖異構(gòu)酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度28 30°C，pH5. 0，攪拌轉(zhuǎn)速200-900r/min。發(fā) 酵1 2d后離心收獲上清。用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，通過(guò)蛋白 電泳(在SDS-PAGE上呈現(xiàn)純化的目標(biāo)蛋白的分子量符合L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的分子量)和 酶活性(純化的目標(biāo)蛋白能夠轉(zhuǎn)化阿拉伯糖生成L-核酮糖，以及能夠催化D-半乳糖異構(gòu) 為D-塔格糖)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定。分泌于發(fā)酵液中的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶占Pichia pastoris 總的分泌蛋白的6%以上。實(shí)施例二實(shí)施步驟1、2、3同實(shí)施例一。4、將工程菌株菌液接種于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基的配方(每升)85%磷酸 26. 7ml, CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g，油酸 20g，蛋白胨 20g，Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml(PTM4 配方(每升):CuS04 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵表達(dá) L-阿拉伯糖異構(gòu)酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度28 30°C，pH5. 0，攪拌轉(zhuǎn)速200-900r/min。發(fā) 酵1 2d后離心收獲上清用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化L-阿拉伯糖 異構(gòu)酶，通過(guò)蛋白電泳(在SDS-PAGE上呈現(xiàn)純化的目標(biāo)蛋白的分子量符合L-阿拉伯糖異 構(gòu)酶的分子量)和酶活性(純化的目標(biāo)蛋白能夠轉(zhuǎn)化阿拉伯糖生成L-核酮糖，以及能夠催 化D-半乳糖異構(gòu)為D-塔格糖)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定。分泌于發(fā)酵液中的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶 占Pichia pastoris總的分泌蛋白的5%以上。實(shí)施例三實(shí)施步驟1、2、3同實(shí)施例一。4、將工程菌株菌液接種于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基的配方(每升)85%磷酸 26. 7ml, CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g,山梨醇 35g，蛋白 胨 20g，Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml(PTM4 配方(每升):CuS04 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵表達(dá) L-阿拉伯糖異構(gòu)酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度28 30°C，pH5. 0，攪拌轉(zhuǎn)速200-900r/min。發(fā) 酵1 2d后離心收獲上清用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化L-阿拉伯糖 異構(gòu)酶，通過(guò)蛋白電泳(在SDS-PAGE上呈現(xiàn)純化的目標(biāo)蛋白的分子量符合L-阿拉伯糖異 構(gòu)酶的分子量)和酶活性(純化的目標(biāo)蛋白能夠轉(zhuǎn)化阿拉伯糖生成L-核酮糖，以及能夠催 化D-半乳糖異構(gòu)為D-塔格糖)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定。分泌于發(fā)酵液中的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶 占Pichia pastoris總的分泌蛋白的7%以上。實(shí)施例四實(shí)施步驟1、2、3同實(shí)施例一。4、將工程菌株菌液接種于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基的配方(每升)85%磷酸 26. 7ml，CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2504 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g,葡萄糖 40g,蛋白 胨 20g，Yeast extract 10g, PTM4 微量元素 4ml(PTM4 配方(每升):CuS04 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl2 7. Og, Fe2 (SO4) 3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵表達(dá) L-阿拉伯糖異構(gòu)酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度28 30°C，pH5. 0，攪拌轉(zhuǎn)速200-900r/min。發(fā) 酵1 2d后離心收獲上清用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化L-阿拉伯糖 異構(gòu)酶，通過(guò)蛋白電泳(在SDS-PAGE上呈現(xiàn)純化的目標(biāo)蛋白的分子量符合L-阿拉伯糖異 構(gòu)酶的分子量)和酶活性(純化的目標(biāo)蛋白能夠轉(zhuǎn)化阿拉伯糖生成L-核酮糖，以及能夠催 化D-半乳糖異構(gòu)為D-塔格糖)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定。分泌于發(fā)酵液中的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶 占Pichia pastoris總的分泌蛋白的9%以上。實(shí)施例五實(shí)施步驟1、2、3同實(shí)施例一。4、將工程菌株菌液接種于液體培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)基的配方(每升)85%磷酸26. 7ml, CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g，乳酸 30g，蛋白胨 20g，Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml(PTM4 配方(每升):CuS04 ·5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl2 7. Og, Fe2 (SO4) 3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸1ml)，在生物反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵表達(dá) L-阿拉伯糖異構(gòu)酶。其發(fā)酵參數(shù)為溫度28 30°C，pH5. 0，攪拌轉(zhuǎn)速200-900r/min。發(fā) 酵1 2d后離心收獲上清用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化L-阿拉伯糖 異構(gòu)酶，通過(guò)蛋白電泳(在SDS-PAGE上呈現(xiàn)純化的目標(biāo)蛋白的分子量符合L-阿拉伯糖異 構(gòu)酶的分子量)和酶活性(純化的目標(biāo)蛋白能夠轉(zhuǎn)化阿拉伯糖生成L-核酮糖，以及能夠催 化D-半乳糖異構(gòu)為D-塔格糖)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定。分泌于發(fā)酵液中的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶 占Pichia pastoris總的分泌蛋白的4%以上。
權(quán)利要求
一種用畢赤酵母pGAP調(diào)控表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的方法，其特征在于，其步驟如下1)、首先從畢赤酵母中擴(kuò)增pGAP啟動(dòng)子；2)、在L-阿拉伯糖異構(gòu)酶序列的3’末端融合His6標(biāo)簽，構(gòu)建由pGAP調(diào)控L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因的由G418抗性基因作為篩選標(biāo)記的畢赤酵母表達(dá)載體，將這一載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母基因組，并將轉(zhuǎn)化物涂布于含G418≥300μg/mL的G418-YPD平板上；3)、從步驟2的G418-YPD平板上再挑選畢赤酵母重組子作為工程菌株；4)、將步驟3獲得的工程菌株接種于含碳源的液體培養(yǎng)基中，于28～30℃在生物反應(yīng)器中發(fā)酵1～2d分泌表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶；所述液體培養(yǎng)基是由以下組分組成85％磷酸25～28ml/L、CaSO4·2H2O 0.8～1.2g/L、K2SO4 17～19g/L、MgSO4·7H2O 13～16g/L、KOH 3.5～4.5g/L、碳源15～45g/L、蛋白胨18～22g/L、Yeastextract 8～12g/L、PTM43～5ml/L；所述PTM4是由以下組分組成CuSO4·5H2O 2.0g/L、NaI·2H2O 0.1g/L、MnSO4·H2O 3.0g/L、Na2MoO4·2H2O 0.2g/L、H3BO30.02g/L、CoCl2·6H2O 1.05g/L、ZnCl27.0g/L、Fe2(SO4)3·7H2O 22g/L、生物素0.2g/L、硫酸1ml/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用畢赤酵母pGAP調(diào)控表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的方法，其特 征在于所述碳源是甘油、油酸、山梨醇、葡萄糖、乳酸、甘氨酸、丙氨酸、海藻糖或甘露醇。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用畢赤酵母pGAP調(diào)控表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域，首先從畢赤酵母中擴(kuò)增pGAP啟動(dòng)子；構(gòu)建由pGAP調(diào)控L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因的畢赤酵母表達(dá)載體，并將這一載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母基因組；根據(jù)載體上所帶的抗性基因篩選高拷貝重組子作為工程菌株；將工程菌株接種于含碳源的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵工程菌分泌表達(dá)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶。本發(fā)明生產(chǎn)成本低，發(fā)酵周期短，利用畢赤酵母的pGAP調(diào)控表達(dá)的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶有利于產(chǎn)物的純化，解決應(yīng)用天然產(chǎn)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的菌株生產(chǎn)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的成本較高、產(chǎn)物難于純化等的問(wèn)題，有利于L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/84GK101831418SQ20101018484
公開(kāi)日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月13日
發(fā)明者崔艷艷, 張?zhí)碓? 張愛(ài)聯(lián), 羅進(jìn)賢 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所