專利名稱：一種建立赤潮藻rflp特征性圖譜的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及海洋浮游植物種類和/或數量檢測的技術領域，特別涉及一種建立赤 潮藻RFLP特征性圖譜的方法。
背景技術：
在富饒的海洋世界里，有著許許多多的海洋生物，除了有形式各樣的海洋魚類等 海洋動物，還有著為海洋提供基礎生產力的海洋植物。它們分布于海洋的各個層面，而作為 海洋植物主要組成部分的海洋藻類，是人類的一大寶貴的自然財富，它們可以作為食物，也 可以做成保健藥品。人們根據海洋藻類的不同的生活習慣，把它們分為底棲藻和浮游藻兩 大類型。浮游藻藻體僅由一個細胞組成，又稱為單細胞藻類，是一類具有色素或色素體能 進行光合作用，并制造有機物的自養(yǎng)型單細胞浮游生物。它們是海洋中最重要的初級生產 者，也是海洋生態(tài)系統中食物鏈中最基礎的一環(huán)。浮游藻能漂浮或懸浮在有光的水面上做 極其微弱的浮動，與其適應漂浮生活的各種體型是分不開的。有的浮游藻為了增大與水面 接觸的表面積，其細胞周圍生出一圈刺毛、長長的刺或突起物，還有的成群結隊的積在一 塊，以擴大表面積來利于漂浮。浮游藻植物形狀各有特色，有紡錘形、扇形、星形等。它們多 數是單細胞的，也有許多是由單細胞結合起來的群體。絕大多數浮游植物的個體都非常微 小，只有幾個至幾百微米，只能在顯微鏡下才能看清楚其形態(tài)結構，但其數量極多，代謝活 動強烈。雖然浮游藻形體微小，運動能力較弱，但它的存在對整個地球生態(tài)系統來說是極 其重要的。首先，浮游藻處于有光的水體表面，它們在水面進行光合作用，固定無機碳，使之 轉化為碳水化合物。據估計，全球約50%的初級生物力源于海洋，而海洋浮游植物又是海洋 初級生產力的最主要來源，僅硅藻一類就貢獻了海洋初級生產力的60%。其次，浮游藻類是 為地球提供化合氮的重要生物，如藍藻。最后，海洋浮游植物位于海洋食物鏈的最底層，它 們是小型海洋動物，尤其是海洋動物幼體的直接或間接餌料。某個海域浮游植物的生物量 和多樣性直接影響該區(qū)域其它高級動物的多樣性和分布。赤潮是海水中某些單細胞藻類，原生動物或細菌在一定的環(huán)境條件下爆發(fā)性增殖 或聚集在一起而引起水體變色的一種生態(tài)異?，F象。一般稱藻類大量繁殖的現象為藻華， 赤潮也被稱為有害藻華。赤潮是一種自然生態(tài)現象，也是一種人為因素引起的有害生態(tài)現 象。赤潮一般可分為有毒赤潮與無毒赤潮兩類。有毒赤潮是指赤潮生物體內含有某種毒素 或能分泌出毒素的生物形成的赤潮。有毒赤潮一旦形成，可對赤潮區(qū)的生態(tài)系統、海洋漁 業(yè)、海洋環(huán)境、以及人體健康造成不同程度的損害。無毒赤潮是指生物體內不含毒素，又不 分泌毒素的生物體為主形成的赤潮。無毒赤潮對海洋生態(tài)、海洋環(huán)境、海洋漁業(yè)也會產生不 同程度的損害。除了根據毒素的有無對赤潮進行劃分外，赤潮還可以根據不同的標準有以 下不同的分類方法。首先，根據赤潮爆發(fā)的地點，可分為外海性赤潮和近岸、內灣性赤潮。 由于大洋上升流區(qū)或水團交匯處營養(yǎng)物質比較豐富，容易爆發(fā)外海性赤潮。在中國主要分布于東海以南水域。近岸、內灣、河口性赤潮，指發(fā)生于近岸區(qū)、內灣區(qū)或河口區(qū)等水城的赤 潮。其次，根據赤潮的來源可分為外來型和原發(fā)型赤潮。所謂外來型赤潮，是指不是在原海 域形成的赤潮，而是在其他水域形成后，由于風、浪、流等外力作用被帶到該海域的。其特 點表現在持續(xù)時間比較短，有時候會把同一起赤潮的遷移誤認為兩起發(fā)生在不同地方的赤 潮。原發(fā)性赤潮是指原海域自身發(fā)生的赤潮，其特點是持續(xù)時間較長，而且會反復出現。一 般而言在內灣發(fā)生的赤潮大多是屬于原發(fā)性赤潮。最后，根據引發(fā)的赤潮的生物種類的多 少，可分為單相型、雙相型和復合型赤潮。單相型赤潮是指赤潮爆發(fā)時，只有一個赤潮生物 種占絕對優(yōu)勢。同理，雙相型即指兩種赤潮生物共存并同時占優(yōu)勢而形成的赤潮。復合型 赤潮由三種以及三種以上赤潮生物所引起，且每種的數量都占有總數的20%以上。赤潮的危害主要表現在首先，大量的二氧化碳被赤潮所消耗，使水體酸堿度發(fā)生 較大變化，從而影響海洋生物的群落結構；在赤潮發(fā)生過程中，由于大量赤潮生物的瘋長， 阻擋了陽光到達水體的深度，降低了水體的透明度，導致生長于水體深層的水草和海洋動 物大量死亡，底層生物量銳減。其次，在赤潮生物瘋長過程中，不但競爭性消耗水中的營養(yǎng) 物質，而且分泌一些抑制其他生物生長的物質，如赤潮藻毒素。結果導致水體中赤潮生物 占絕對優(yōu)勢，而其他生物種類減少，嚴重破壞水體的生物多樣性。再次，赤潮生物的缺氧或 造成水體累積大量硫化氫和甲烷，隔絕了海水與大氣圈的氣體交換，使很多海洋生物窒息 或者中毒而死。最后，一些赤潮生物(如某些甲藻)產生的粘液附著在海洋動物的鰓上，妨 礙呼吸作用，使大型水生動物窒息而死，給近海養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。許多赤潮生物含有毒 素，該毒素可使海洋動物因赤潮生物毒素的積累和食物鏈傳遞作用而中毒死亡或生長繁殖 受到影響。赤潮對人體健康的影響也很大，直接接觸會引起皮膚的不適，而一些揮發(fā)性毒素 還可能能對眼睛和呼吸道產生影響，更主要的是由于食物鏈的傳遞作用，有害赤潮產生的 赤潮生物毒素會導致人類的中毒甚至死亡。所以，研究建立赤潮的預警機制是必要的，而赤潮的預警需要了解其結構的多樣 性，則必須建立赤潮藻RELP的特征性圖譜，而建立赤潮藻的RELP的特征性圖譜一直是本領 域重要的課題之一。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于，本發(fā)明運用限制性片斷長度多態(tài)性技術 (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) Wtl^ii^ PCR-RFLP, l^jM^ilM 種的特征酶切圖譜，在此基礎上，建立了一套高效快捷的、基于RFLP的赤潮藻的特征性圖 譜的建立方法。為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其 中，包括以下步驟a、模擬實驗數據表的建立b、模擬酶切電泳圖譜C、模擬酶切和實際酶切對照實驗d、實際酶切實驗e、模擬酶切實驗f、模擬酶切實驗和實際酶切實驗結果的對比
g、酶切實驗條件優(yōu)化h、RFLP圖譜的建立i、基于RFLP技術的赤潮藻種鑒定。
所述步驟a為將實驗藻種序列信息錄入excel軟件，并結合實驗用到的限制性內 切酶的酶切信息，通過excel軟件，作出酶切片段數和長度的信息，建立初級酶切信息數據表。所述步驟b為根據步驟a模擬數據表建立的信息，進行篩選，從中挑選出限制性 內切酶，運用Vector NTI Suite 9軟件確定凝膠電泳的條件，然后對實驗藻種序列進行模 擬的酶切，并跑出模擬電泳圖，根據此初步判斷其區(qū)分鑒別程度。所述步驟c為選取部分實驗藻種進行酶切實驗，并與的模擬實驗結果進行比對， 驗證模擬實驗和實際試驗的吻合程度，其中，反應體系為總體積30μ 1，其中18S rDNA擴增產物15 μ 1，酶切反應緩沖液5 μ 1， 內切酶3μ 1，滅菌重蒸水7μ 1 ；反應時間為65°C條件下90min，其酶切產物也用凝膠電泳檢測，瓊脂糖凝膠濃度 為1%，電壓100V，電泳30min，然后在凝膠成像系統中進行分析。所述步驟d為選取實驗藻種對選擇的限制性內切酶進行實驗，作出酶切電泳圖， 作出單個的藻種酶切圖譜，用于鑒別和區(qū)分，并對相關酶切實驗條件進行優(yōu)化。所述步驟e為對照模擬實驗結果和實際實驗結果，構建赤潮藻種的RFLP圖庫，并 在此基礎上建立標準化的基于RELP技術的赤潮藻種分類鑒定方法，對試驗藻進行了五次 的重復實驗，并計算條帶大小。所述步驟f為收集實驗藻種18S rDNA序列信息，并綜合主要限制性內切酶的信 息，結合數據庫和Vector NTI Suite 9軟件，選取用酶，作出模擬電泳圖，優(yōu)選為Taq I酶 作為實驗用酶；計算模擬實驗和實際實驗的對比結果，計算實際實驗的條帶數和條帶大小 的位置是否與擬實驗結果基本一致。所述步驟g為(1)酶切樣品量的優(yōu)化取三個酶切對象的量進行優(yōu)化，分別是5μ1、10μ1、 15 μ 1。然后進行電泳分析；(2)酶切時間的優(yōu)化取5個時間段對本實驗進行優(yōu)化，分別是90min、120min、 150min、180min、210min然后進行電泳分析；(3)酶切用酶量的優(yōu)化取三個酶的用量對本實驗進行優(yōu)化，分別是2 μ 1、3 μ 1、 4μ1;然后進行電泳分析。所述步驟h為對各驗藻種進行了 RFLP酶切實驗，在酶切之后固定凝膠濃度以及 電泳的電壓、電泳時間因素，并作出其酶切圖譜，用于鑒別和區(qū)分藻種。所述步驟i為對未知藻種進行培養(yǎng)，提取DNA，對藻種進行擴增，得到目的片段 后對目的片段進行酶切，酶切后進行電泳，得到電泳圖譜后對電泳圖譜進行分析，對電泳圖 譜的分析，應根據電泳圖譜中酶切樣品的片段數以及片段和marker的相對位置來確定，其 中，條帶片段大小估算公式L = (WX C)+D
L 為條帶分子量W 目標條帶所處的兩條marker之間的比例位置C 為條帶所處的兩條marker片段差值D 兩條marker條帶中較小的一條的分子量誤差為士C/10，(C為marker兩條帶之差值)本發(fā)明的優(yōu)點在于，RFLP作為一種分子多態(tài)性的實驗手段，其主要功能在于對生物物種的差性的區(qū)分，作為一種用于鑒定的赤潮藻種的分子生態(tài)學手段，可以作為傳統鑒 定方法的補充和輔助手段。而本發(fā)明，基于FELP建立特征性圖譜，將整個流程標準化，將有 利于對赤潮藻種進行快速簡捷的初步鑒定。


圖1整體模擬酶切電泳結果圖。圖2為酶切樣品量的優(yōu)化。圖3酶切用酶量優(yōu)化。圖4酶切時間的優(yōu)化實驗。圖5為判斷結果示意圖
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其中，包括以下步驟a、模擬實驗數據表的建立b、模擬酶切電泳圖譜C、模擬酶切和實際酶切對照實驗d、實際酶切實驗e、模擬酶切實驗f、模擬酶切實驗和實際酶切實驗結果的對比g、酶切實驗條件優(yōu)化h、RFLP圖譜的建立i、基于RFLP技術的赤潮藻種鑒定。所述步驟a為將實驗藻種序列信息錄入excel軟件，并結合實驗用到的限制性內 切酶的酶切信息，通過excel軟件，作出酶切片段數和長度的信息，建立初級酶切信息數據表。所述步驟b為根據步驟a模擬數據表建立的信息，進行篩選，從中挑選出限制性 內切酶，運用Vector NTI Suite 9軟件確定凝膠電泳的條件，然后對實驗藻種序列進行模 擬的酶切，并跑出模擬電泳圖，根據此初步判斷其區(qū)分鑒別程度。所述步驟c為選取部分實驗藻種進行酶切實驗，并與的模擬實驗結果進行比對， 驗證模擬實驗和實際試驗的吻合程度，其中，反應體系為總體積30μ 1，其中18S rDNA擴增產物15 μ 1，酶切反應緩沖液5 μ 1， 內切酶3μ 1，滅菌重蒸水7μ 1 ；反應時間為65°C條件下90min，其酶切產物也用凝膠電泳檢測，瓊脂糖凝膠濃度為1%，電壓100V，電泳30min，然后在凝膠成像系統中進行分析。所述步驟d為選取實驗藻種對選擇的限制性內切酶進行實驗，作出酶切電泳圖， 作出單個的藻種酶切圖譜，用于鑒別和區(qū)分，并對相關酶切實驗條件進行優(yōu)化。所述步驟e為對照模擬實驗結果和實際實驗結果，構建赤潮藻種的RFLP圖庫，并 在此基礎上建立標準化的基于RELP技術的赤潮藻種分類鑒定方法，對試驗藻進行了五次 的重復實驗，并計算條帶大小。所述步驟f為收集實驗藻種18S rDNA序列信息，并綜合主要限制性內切酶的信 息，結合數據庫和Vector NTI Suite 9軟件，選取用酶，作出模擬電泳圖，優(yōu)選為Taq I酶 作為實驗用酶；計算模擬實驗和實際實驗的對比結果，計算實際實驗的條帶數和條帶大小 的位置是否與擬實驗結果基本一致。所述步驟g為
(1)酶切樣品量的優(yōu)化取三個酶切對象的量進行優(yōu)化，分別是5μ 1、10μ 1、 15 μ 1。然后進行電泳分析；(2)酶切時間的優(yōu)化取5個時間段對本實驗進行優(yōu)化，分別是90min、120min、 150min、180min、210min然后進行電泳分析；(3)酶切用酶量的優(yōu)化取三個酶的用量對本實驗進行優(yōu)化，分別是2 μ 1、3 μ 1、 4μ1;然后進行電泳分析。所述步驟h為對各驗藻種進行了 RFLP酶切實驗，在酶切之后固定凝膠濃度以及 電泳的電壓、電泳時間因素，并作出其酶切圖譜，用于鑒別和區(qū)分藻種。所述步驟i為對未知藻種進行培養(yǎng)，提取DNA，對藻種進行擴增，得到目的片段 后對目的片段進行酶切，酶切后進行電泳，得到電泳圖譜后對電泳圖譜進行分析，對電泳圖 譜的分析，應根據電泳圖譜中酶切樣品的片段數以及片段和marker的相對位置來確定，其 中，條帶片段大小估算公式L = (WX C)+DL 為條帶分子量W 目標條帶所處的兩條marker之間的比例位置C 為條帶所處的兩條marker片段差值D 兩條marker條帶中較小的一條的分子量誤差為士C/10，(C為marker兩條帶之差值)。其中，如圖1所示為整體模擬酶切電泳結果圖。在模擬實驗中，結合序列信息 和酶切結果的初步分析，對近百種常用限制性內切酶進行了篩選，并從中Taq I酶作 為實驗用酶。從模擬實驗結果來看，對于選取用酶Taq I，大多實驗藻種的區(qū)分度比較 好，在四種原甲藻中，海洋原甲藻(Prorocentrummicans)禾口東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)以及微小原甲藻(Prorocentrum minimum)區(qū)分比較明顯，和三角棘原甲藻 (Prorocentrumtriestinum)不能區(qū)分，但是Taq I把原甲藻和其他藻種區(qū)分開來。米氏凱 倫藻(Karenia mikimotoi)和短凱倫藻(Karenia brevis)以及裸甲藻(Gymnodinium)不 能區(qū)分，但這三種藻的Taq I的酶切圖譜一致，將它們和其他藻種區(qū)分開來。旋鏈角毛藻 (Chaetoceros curvisetu)禾口柔弱角毛藻(Chaetoceros debilis)也不能區(qū)分，但這兩種藻的Taq I的酶切圖譜一致，將它們和其他藻種區(qū)分開來。總的來說，除了上述幾種藻種以外，其他實驗藻種在Taq I酶的作用下，酶切圖譜 區(qū)分比較明顯，能把大多數實驗藻種分開，是一個比較合適的實驗用酶。如圖2 所示，DNA marker DL2000 (長度片段分別為 2000bp、IOOObp、750bp、500bp、 250bp、100bp)②東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)樣品量5μ 1③東海原甲藻 (Prorocentrum donghaiense)樣品量10 μ 1@東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense) 樣品量15μ1。
如圖3所示DNA marker DL2000 (長度片段分別為 2000bp、IOOObp、750bp、500bp、 250bp、100bp)②Taq I酶用量4μ 1③Taq I酶用量3μ 1④Taq I酶用量2μ 1。如圖4所示DNA marker DL2000 (長度片段分別為 2000bp、IOOObp、750bp、500bp、 250bp、IOObp)②酶切時間為210min③酶切時間為150min④酶切時間為150min ⑤酶切 時間為120min ⑥酶切時間為90min酶切優(yōu)化實驗從三個方面分別進行了優(yōu)化，以尋求最佳的反應體系和反應時間。 在酶切樣品量的優(yōu)化方面，可以看到，隨著酶切樣品量的增加，其亮度也在逐漸增加(圖 2)，但是由于內切酶本身的酶切能力的限制，所以如果樣品過多，可能會導致酶切反應不完 全。通過酶切樣品的梯度優(yōu)化，一般可以認為，加入酶切樣品15 μ 1是一個比較合適的量。 其亮度基本和marker —致，并且酶切完全。在內切酶用量的優(yōu)化方面，可以看到，(圖3)隨 著內切酶用量的增加，在時間一定的情況下，其產物條帶越來越弱，從本實驗得出，其酶切 用酶量在3μ 1的時候為理想用量。在酶切時間的優(yōu)化方面，分別取五個時間段對酶切實驗 進行了優(yōu)化(圖4)，酶切時間在90min的時候其亮度比較好，其后酶切產物亮度隨著時間的 推移逐漸變淡。所以，總的來說，為了得帶高質量的酶切片段，應對酶切實驗的三個方面進 行優(yōu)化并確定最優(yōu)條件。本實驗確定為酶切樣品量為15 μ 1，內切酶用量為3 μ 1，酶切時間 為 90mino酶切實驗從三個方面進行優(yōu)化并確定最優(yōu)條件。本實驗確定酶切樣品量為15 μ 1， 內切酶用量為3 μ 1，酶切時間為90min。RFLP作為一種分子多態(tài)性的實驗手段，其主要功能在于對生物物種的差性的區(qū) 分，作為一種用于鑒定的赤潮藻種的分子生態(tài)學手段，可以作為傳統鑒定方法的補充和輔 助手段。對于整個RFLP流程來說，其標準化的方式很重要，將整個流程標準化，將有利于 對赤潮藻種進行快速簡捷的初步鑒定。流程如下對未知藻種進行培養(yǎng)，提取DNA，對藻種進行擴增，得到目的片段后對目的片段進 行酶切，酶切后進行電泳，得到電泳圖譜后對電泳圖譜進行分析，對電泳圖譜的分析，應根 據電泳圖譜中酶切樣品的片段數以及片段和marker的相對位置來確定。條帶片段大小估算公式L = (WX C)+DL 為條帶分子量W:目標條帶所處的兩條marker之間的比例位置(如圖23中③條帶與250bp條帶 間距離為a,與500bp條帶間距離為b，則W = a/ (a+b)C 為條帶所處的兩條marker片段差值
D 兩條marker條帶中較小的一條的分子量酶切電泳標準體系 例在圖5中，首先判定目標藻種具有三條條帶，①條帶位于750bp條帶以 上大約五分之一處、通過條帶和marker的相對位置，計算得知其片段分子量大約為 750+(1000-750)/5 = 810bp。同理，②條帶位于750bp條帶以下大約五分之二處、可計算出 其片段大約為650bp左右。③條帶位于250bp條帶以上大約二分之一處，可計算出其片段 大約為350bp左右，根據以上信息可返回圖庫進行對比，對比得知圖譜和東海原甲藻一致， 即可初步判定其為東海原甲藻。為了驗證公式，對東海原甲藻進行了五次的重復酶切，并計算條帶大小，條帶大小 結果。五次重復酶切實驗結果后計算條帶分子量結果如下，可以看出，其相對標準偏差比較 穩(wěn)定，可以用來進行一個條帶分子量大小的估算。驗證條帶大小公式的重復實驗計算結果
權利要求
一種建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，包括以下步驟a、模擬實驗數據表的建立b、模擬酶切電泳圖譜c、模擬酶切和實際酶切對照實驗d、實際酶切實驗e、模擬酶切實驗f、模擬酶切實驗和實際酶切實驗結果的對比g、酶切實驗條件優(yōu)化h、RFLP圖譜的建立i、基于RFLP技術的赤潮藻種鑒定。
2.根據權利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟a 為將實驗藻種序列信息錄入excel軟件，并結合實驗用到的限制性內切酶的酶切信息，通 過excel軟件，作出酶切片段數和長度的信息，建立初級酶切信息數據表。
3.根據權利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟b 為根據步驟a模擬數據表建立的信息，進行篩選，從中挑選出限制性內切酶，運用Vector NTI Suite 9軟件確定凝膠電泳的條件，然后對實驗藻種序列進行模擬的酶切，并跑出模擬 電泳圖，根據此初步判斷其區(qū)分鑒別程度。
4.根據權利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟c 為選取部分實驗藻種進行酶切實驗，并與的模擬實驗結果進行比對，驗證模擬實驗和實際 試驗的吻合程度，其中，反應體系為總體積30 μ 1，其中18S rDNA擴增產物15 μ 1，酶切反應緩沖液5 μ 1，內 切酶3μ 1，滅菌重蒸水7μ 1 ；反應時間為65°C條件下90min，其酶切產物也用凝膠電泳檢測，瓊脂糖凝膠濃度為 1%，電壓100V，電泳30min，然后在凝膠成像系統中進行分析。
5.根據權利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟d 為選取實驗藻種對選擇的限制性內切酶進行實驗，作出酶切電泳圖，作出單個的藻種酶切 圖譜，用于鑒別和區(qū)分，并對相關酶切實驗條件進行優(yōu)化。
6.根據權利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟e 為對照模擬實驗結果和實際實驗結果，構建赤潮藻種的RFLP圖庫，并在此基礎上建立標 準化的基于RELP技術的赤潮藻種分類鑒定方法，對試驗藻進行了五次的重復實驗，并計算 條帶大小。
7.根據權利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟 f為收集實驗藻種18S rDNA序列信息，并綜合主要限制性內切酶的信息，結合數據庫和 Vector NTI Suite 9軟件，選取用酶，作出模擬電泳圖，優(yōu)選為Taq I酶作為實驗用酶；計 算模擬實驗和實際實驗的對比結果，計算實際實驗的條帶數和條帶大小的位置是否與擬實驗結果基本一致。
8.根據權利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟g為(1)酶切樣品量的優(yōu)化取三個酶切對象的量進行優(yōu)化，分別是5μ 1、10μ 1、15μ 1，然后進行電泳分析；(2)酶切時間的優(yōu)化取5個時間段對本實驗進行優(yōu)化，分別是90min、120min、150min、 180min、210min然后進行電泳分析；(3)酶切用酶量的優(yōu)化取三個酶的用量對本實驗進行優(yōu)化，分別是2μ 1、3 μ 1、4 μ 1 ； 然后進行電泳分析。
9.根據權利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟h 為對各驗藻種進行了 RFLP酶切實驗，在酶切之后固定凝膠濃度以及電泳的電壓、電泳時 間因素，并作出其酶切圖譜，用于鑒別和區(qū)分藻種。
10.根據權利要求1所述建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其特征在于，所述步驟 i為對未知藻種進行培養(yǎng)，提取DNA，對藻種進行擴增，得到目的片段后對目的片段進行酶 切，酶切后進行電泳，得到電泳圖譜后對電泳圖譜進行分析，對電泳圖譜的分析，應根據電 泳圖譜中酶切樣品的片段數以及片段和marker的相對位置來確定，其中，條帶片段大小估算公式L = (WXC) +DL 為條帶分子量W 目標條帶所處的兩條marker之間的比例位置C 為條帶所處的兩條marker片段差值D 兩條marker條帶中較小的一條的分子量誤差為士C/10，(C為marker兩條帶之差值)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種建立赤潮藻RFLP特征性圖譜的方法，其中，包括以下步驟a、模擬實驗數據表的建立，b、模擬酶切電泳圖譜，c、模擬酶切和實際酶切對照實驗，d、實際酶切實驗，e、模擬酶切實驗，f、模擬酶切實驗和實際酶切實驗結果的對比，g、酶切實驗條件優(yōu)化，h、RFLP圖譜的建立，i、基于RFLP技術的赤潮藻種鑒定。本發(fā)明作為一種用于鑒定的赤潮藻種的分子生態(tài)學手段，可以作為傳統鑒定方法的補充和輔助手段。本發(fā)明基于FELP建立特征性圖譜，將整個流程標準化，將有利于對赤潮藻種進行快速簡捷的初步鑒定。
文檔編號C12Q1/04GK101864485SQ201010184808
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月28日 優(yōu)先權日2010年5月28日
發(fā)明者于志剛, 張濤, 甄毓, 米鐵柱 申請人:中國海洋大學